JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

Transkrypt

1 TOM 5 NUMER 6 GRUDZIEŃ 2007 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY PRACA ORYGINALNA Określenie klinicznie istotnych molekularnych podtypów raka piersi z dodatnimi receptorami estrogenowymi poprzez genomiczny stopień złośliwości Sherene Loi, Benjamin Haibe-Kains, Christine Desmedt, Françoise Lallemand, Andrew M. Tutt, Cheryl Gillet, Paul Ellis, Adrian Harris, Jonas Bergh, John A. Foekens, Jan G.M. Klijn, Denis Larsimont, Marc Buyse, Gianluca Bontempi, Mauro Delorenzi, Martine J. Piccard i Christos Sotiriou Jules Bordet Institute; Machine Learning Group, Université Libre de Bruxelles; International Drug and Development Institute, Brussels, Belgium; Peter MacCallum Cancer Center, Melbourne, Australia; Guys Hospital, London; John Radcliffe Hospital, Oxford, United Kingdom; Karolinska Institute, Stockholm, Sweden; Erasmus Medical Center, Daniel den Hoed Cancer Center, Rotterdam, the Netherlands; National Center of Competence in Research Molecular Oncology, Swiss Institute of Cancer Research; and Swiss Institute of Bioinformatics, Epalinges, Switzerland. Otrzymano 4 maja 2006, zaakceptowano 2 stycznia Finansowano z grantów badawczych Jean-Claude Heuson Breast Cancer Foundation (S.L., C.S.), Belgian National Foundation for Research (FNRS; B.H.-K., C.D., C.S.), E. Lauder Breast Cancer Foundation (C.S.) oraz MEDIC Foundation (C.S.). Udział S.L., B.H.-K. i C.D. w opracowaniu tego doniesienia był równy. Oświadczenie autorów na temat potencjalnych konfliktów interesów oraz wkład poszczególnych autorów zamieszczono na końcu artykułu. Prośby o przedruki należy adresować: Christos Sotiriou, MD, PhD, Translational Research Unit, Jules Bordet Institute, Université Libre de Bruxelles, 121 Blvd de Waterloo, 1000 Brussels, Belgium; christos.sotiriou@bordet.be by American Society of Clinical Oncology X/07/ /$20.00 DOI: /JCO S T R E S Z C Z E N I E Cel W kilku dotychczas prowadzonych badaniach mikromacierzowych udało się wyróżnić molekularne podtypy raka piersi, takie jak podtyp podstawny (basal), podtyp z ekspresją ErbB2 i dwa lub trzy podtypy luminalne. Podtypy te wykazywały różny przebieg kliniczny choroby. Molekularne podtypy podstawne i ErbB2 są systematycznie wyróżniane, natomiast wyróżnianie podgrup raka z ekspresją receptora estrogenowego (estrogen receptor, ER) nie było dotychczas jednoznaczne i powtarzalne. Dlatego w niniejszej pracy podjęto próbę sprecyzowania dokładnej charakterystyki molekularnej tych nowotworów. Materiały i metody Opracowaliśmy poprzednio indeks złośliwości oparty na ekspresji genów (gene expression grade index, GGI), który pozwala określić histologiczny stopień zróżnicowania raka na podstawie profilu ekspresji genów. Używając opracowanego przez nas algorytmu, udało nam się przyporządkować ER-dodatnie raki piersi do grup niskiego bądź wysokiego genomicznego stopnia złośliwości i porównać tę klasyfikację z wcześniej opracowanymi podziałami ER-dodatniego raka piersi, uzyskanymi na podstawie profilu ekspresji. W ramach walidacji dokonaliśmy klasyfikacji 666 ER-dodatnich raków piersi do poszczególnych podtypów i oceniliśmy przebieg kliniczny choroby w wyodrębnionych grupach. Wyniki Na podstawie GGI można było wyróżnić dwie podgrupy ER-dodatniego raka piersi (o wysokim i niskim genomicznym stopniu złośliwości). Mimo że klasyfikacja ta jest związana tylko z jednym szlakiem biologicznym, jest ona bardzo podobna do opisanego wcześniej podziału na typ luminalny A i B oraz koreluje istotnie z grupami ryzyka wyróżnionymi na podstawie 21-genowego indeksu nawrotu (recurrence score, RS). Oba podtypy wykazują statystycznie istotne różnice w rokowaniu, zarówno u chorych nie poddanych leczeniu systemowemu, jak i w populacji chorych leczonych tamoksyfenem. Wnioski Użycie genomicznego stopnia złośliwości pozwala na podstawie prostej metody, wysoce powtarzalnej między różnymi zbiorami danych, wyróżnić dwa klinicznie różne molekularne podtypy ER-dodatniego raka piersi. Uzyskane wyniki podkreślają istotną rolę genów proliferacji w przewidywaniu rokowania u chorych na ER-dodatniego raka piersi. J Clin Oncol 25: przez Amerykańskie Towarzystwo Onkologii Klinicznej WSTĘP Wraz z podjęciem analiz metodą mikromacierzy pojawiły się doniesienia, że w raku piersi można wyróżnić podtypy molekularne zdefiniowane na podstawie różnic w profilu ekspresji genów. Wyróżnione w ten sposób podgrupy wykazywały różnice w przebiegu choroby i rokowaniu, sugerujące biologiczne podłoże heterogenności klinicznej. 1-4 Zaproponowany podział uwzględniał do pięciu podtypów raka piersi (typ podstawny, ErbB2 oraz typy luminalne A, B i C) [ang. termin luminal pozostawiono w wersji oryginalnej, by uniknąć niejednoznaczności z określeniem przewodowy termin ten dotyczy rozpoznania histopatologicznego przyp. tłum.] i został opracowany na podstawie analizy zbioru charakterystycznych niezmiennych genów (intrinsic gene set); podtyp podstawny, niewykazujący ekspresji receptora estrogenowego (ER-ujemny), charakteryzował się gorszym rokowaniem w porównaniu z podtypami luminalnymi, głównie ER-dodatnimi. 1,4 Chociaż charakter podtypów podstawnego i ErbB2 potwierdzono w wielu analizach na niezależnych zbiorach danych, to 381

2 Loi i wsp. rozróżnienie podtypów ER-dodatniego raka piersi sprawiało wiele trudności. Sorlie i wsp., 2 aby rozróżnić podtypy luminalne raka piersi w niezależnych zbiorach danych, użyli predyktora opierającego się na metodzie najbliższej centroidy, zawierającej zestaw charakterystycznych niezmiennych genów. Jednak wielu próbek raka piersi nie udało się zaklasyfikować do żadnego podtypu ze względu na niską korelację z centroidami wszystkich typów, a zaproponowany przez nich zbiór genów okazał się nie w pełni zgodny. 1,2,4,5 Ostatnio doniesiono, że zestaw 822 genów indukowanych przez estrogeny pozwala lepiej przewidzieć odległy wynik leczenia w guzach ER-dodatnich niż klasyfikacja na podtypy luminalne A i B. 6 Jednak i ta obszerna lista genów dotąd nie została wykorzystana jako test kliniczny. Inny wskaźnik, indeks wznowy (recurrence score, RS), jest testem dostępnym komercyjnie (Oncotype Dx; Genomic Health, Inc., Redwood City, CA), który używa złożonego algorytmu obliczania ryzyka dla stratyfikacji populacji chorych z ER-dodatnim rakiem piersi. 7 Dotychczas brak prostego testu diagnostycznego ograniczał wprowadzenie klasyfikacji molekularnej raka piersi do praktyki klinicznej, mimo że taka klasyfikacja mogłaby wspomóc identyfikację leków skutecznych w poszczególnych podgrupach chorych. Wiadomo, że nadekspresja genów cyklu komórkowego jest związana z gorszym przebiegiem klinicznym raka piersi. Perou i wsp. 4 po raz pierwszy stwierdzili, że klaster genów korelujących z szybkością proliferacji komórkowej wykazuje wyraźne zróżnicowanie między molekularnymi podtypami raka piersi. 8 Rozwijając tę ideę, zaproponowaliśmy definicję indeksu złośliwości opartego na ekspresji genów (gene expression grade index, GGI) [ang. termin grade, odpowiadający stopniowi zróżnicowania, w niniejszym artykule tłumaczony jest jako stopień złośliwości ; to rozróżnienie ma na celu wyeliminowanie niejednoznaczności związanej z tłumaczeniem określeń low grade, high grade przyp. tłum.]. 9 GGI jest algorytmem opartym na porównaniu ekspresji genów w próbce guza z jej stopniem zróżnicowania histologicznego. W naszym poprzednim badaniu genomiczny indeks złośliwości oceniany za pomocą GGI lepiej przewidywał wynik leczenia w populacji chorych na raka piersi niepoddanych leczeniu systemowemu niż indeks histologiczny. 9 Celem niniejszego badania była ocena, czy indeks genomiczny może być wykorzystany do lepszego zdefiniowania molekularnych podtypów ER-dodatniego raka piersi, a w szczególności porównanie, jak klasyfikacja oparta na niskim lub wysokim genomicznym stopniu złośliwości odnosi się do innych systemów molekularnej klasyfikacji raka piersi. MATERIAŁY I METODY Szerszy opis zastosowanych metod umieszczono w Dodatku, dostępnym wyłącznie na stronie internetowej JCO. Próbki raka piersi Nasz zbiór danych wykorzystany w tej analizie zawierał 335 próbek raka piersi we wczesnym stopniu zaawansowania klinicznego; 86 z nich wykorzystano wcześniej w innym badaniu (opisano w pracy Sotiriou i wsp., 9 surowe dane mikromacierzowe są dostępne w bazie Gene Expression Omnibus [ numer GSE2990). Zbiór danych wcześniej niepublikowanych zawiera 249 próbek od chorych, którzy byli leczeni uzupełniająco tamoksyfenem (dalej zbiór określany jako leczeni tamoksyfenem ). Surowe dane mikromacierzowe dla zbioru danych od chorych leczonych tamoksyfenem są również dostępne w bazie Gene Expression Omnibus. Zbiór danych dotychczas niepublikowanych został uzyskany za pomocą mikromacierzy GeneChip U133A (Affymetrix, Santa Clara, CA). Zbiór ten zawiera próbki uzyskane z John Radcliffe Hospital, Oksford, Wielka Brytania; Guys Hospital, Londyn, Wielka Brytania oraz Uppsala University Hospital, Uppsala, Szwecja. Użycie materiału tkankowego zostało zaakceptowane przez komisje ds. etyki instytucji biorących udział w badaniu, od chorych uzyskano pisemną, świadomą zgodę. W pracy wykorzystaliśmy również pięć innych, publicznie dostępnych zbiorów danych, opisanych w publikacjach: Sorlie i wsp., 1,2 van de Vijvera i wsp., 10 Wanga i wsp. 11 oraz Sotiriou i wsp. 3 W analizie przeżycia wykorzystano (1) grupę ERdodatnich raków piersi u chorych niepoddanych systemowemu leczeniu uzupełniającemu, dla oceny naturalnego przebiegu choroby w grupach zdefiniowanych przez GGI (w sumie 417 chorych z ER-dodatnim rakiem piersi, w dalszym opisie określanych jako chore nieleczone, van de Vijver i wsp., 10 n = 122, Wang i wsp., 11 n = 209 oraz 86 próbek ze zbioru danych opublikowanego przez nas poprzednio) oraz (2) grupę chorych leczonych tamoksyfenem (n = 249) dla oceny efektu uzupełniającej monoterapii hormonalnej tamoksyfenem. Wszystkie dane kliniczne zamieszczono w Tabelach A1 i A2 (załącznik dostępny wyłącznie na stronie internetowej). Analiza danych Ekspresja ER i receptora progesteronowego. Próbki do badania zostały wybrane na podstawie kryterium dodatniej ekspresji ER w teście wiązania liganda. Wartość odcięcia dla rozróżnienia między próbkami dodatnimi i ujemnymi dla ER i receptora progesteronowego (progesterone receptor, PgR) przyjęto na poziomie 10 fmol/mg białka. Dodatnia ekspresja ER była potwierdzana przez pomiar za pomocą zestawów sond odpowiadających genom ESR1 i PgR na mikromacierzy, odpowiednio at i at. W celu analizy przeżycia, dla rozróżnienia na podgrupy z dużą i małą ekspresją receptorów hormonalnych, jako poziom odcięcia przyjęto medianę ekspresji tych zestawów sond. Histologiczna ocena stopnia zróżnicowania/złośliwości. Stopień zróżnicowania/złośliwości oceniano za pomocą systemu Elstona-Ellisa. 12 Jeden histopatolog oceniał wszystkie próbki w populacji z Oksfordu i populacji szwedzkiej. Wyniki centralnej oceny histopatologicznej były dostępne dla zbioru van de Vijvera i wsp. 10 Próbki w pracy Wanga i wsp. 11 były oceniane przez miejscowych patologów. Indeks oparty na ekspresji genów związanych z proliferacją dla ilościowej oceny genomicznego stopnia złośliwości: GGI. Indeks GGI został już przez nas uprzednio opisany. 9 W skrócie, wskaźnik ten opiera się na średniej z wartości ekspresji genów związanych ze stopniem złośliwości. Wysoka wartość GGI odpowiada wysokiemu stopniowi złośliwości, niska wartość GGI niskiemu stopniowi złośliwości. Jakkolwiek można używać GGI 382 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

3 Określenie klinicznie istotnych molekularnych podtypów raka piersi Ryc. 1. (A i B) Zastosowanie genomicznego indeksu złośliwości do opisanego wcześniej podziału raka piersi na podtypy molekularne. Wykresy ramkowe ekspresji genów indeksu GGI (mediana i zakres) umieszczone są pod gałęzią drzewa odpowiadającą danemu podtypowi. Próbki niemożliwe do zaklasyfikowanianapodstawieanalizypodtypów molekularnych za pomocą zbioru genów charakterystycznych oznaczono kolorem szarym. (C) Wartości GGI dla pięciu podtypów i próbek nieklasyfikujących się ze zbioru danych z pracy van de Vijvera i wsp

4 Loi i wsp. jako zmiennej ciągłej, w naszej analizie został on zdychotomizowany na podgrupy o niskim i wysokim genomicznym stopniu złośliwości, aby uzyskać krzywe Kaplana-Meiera i ocenę ilorazu hazardu w porównaniu z obiema grupami. Wartości odcięcia użyte w analizie zostały wybrane tak, by zmaksymalizować rozdział pomiędzy stopniem złośliwości 1 oraz 3; do rozdziału grup nie wykorzystywano żadnej informacji dotyczącej przeżycia chorych. Zestawy sond z macierzy GeneChip U133A mapowano do innych platform mikromacierzowych przez porównywanie symboli genów. 9 Ze 128 zestawów sond (odpowiadających 97 genom), które wchodzą w skład GGI, udało nam się dopasować w zbiorach Sorlie i wsp i Sorlie i wsp , odpowiednio 48 i 63 zestawy sond, w zbiorze Sotiriou i wsp zestawów sond, a w zbiorze van de Vijvera i wsp zestawy sond. Porównanie z innymi klasyfikacjami molekularnymi ER-dodatnich raków piersi Skupienie hierarchiczne na podstawie zbioru genów charakterystycznych. Dokonaliśmy porównania pomiędzy GGI oraz podtypami luminalnym A, B i podtypem seminormalnym (normal-like), opisanymi przez Perou i wsp., 4 wykorzystując zbiór charakterystycznych niezmiennych genów (intrinsic gene set) oraz zbiory danych Sorlie i wsp. 1,2 oraz van de Vijvera i wsp., jak opisano w pracy Changa i wsp. 13 Model indeksu RS. Wykorzystując dane mikromacierzowe oraz algorytm 21-genowego indeksu nawrotu (RS), opracowanego przez Paika i wsp., 7 w zbiorze danych dla chorych leczonych tamoksyfenem wyróżniono trzy grupy ryzyka. Grupy ryzyka niskiego i pośredniego złączono w jedną grupę o niskim ryzyku, ponieważ nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w rokowaniu między tymi podgrupami. Analiza statystyczna Wartości GGI pomiędzy podgrupami raka piersi porównywano, wykorzystując test znakowanych rang Wilcoxona. Analizę korelacji pomiędzy współczynnikiem RS a indeksem GGI przeprowadzono, używając współczynnika korelacji Pearsona. Krzywe przeżycia wizualizowano, używając wykresów Kaplana-Meiera i porównywano testem log-rank, wykorzystując czas do stwierdzenia przerzutów odległych (time to distant metastasis, TDM), często używany w zastępstwie całkowitego czasu przeżycia specyficznego dla raka piersi. Jedno- i wielozmienne ilorazy hazardu oszacowano metodą analizy regresji Coxa. Wszystkie analizy przeżycia były stratyfikowane względem zbiorów danych. Wartości P w analizie wielozmiennej były oceniane na podstawie statystyki Walda. W analizach opartych na parametrach klinicznych wyłączano chorych, dla których wartości tych parametrów nie były określone. Wszystkie użyte testy statystyczne stosowano jako dwustronne. Krzywe charakterystyki odbiornika (receiver operating characteristic, ROC) zależne od czasu, uzyskano wykorzystując metodę opisaną w pracy Heagerty ego i wsp. 14 Analizy statystyczne przeprowa- Ryc. 2. Krzywe przeżycia Kaplana-Meiera ze względu na czas do pojawienia się przerzutów odległych (TDM) dla genomicznego wskaźnika złośliwości (GGI, wysoki w porównaniu z niskim), pomiaru ekspresji ESR1 (wysoka w porównaniu z niskim) oraz ekspresji PgR (wysoka w porównaniu z niskim). (A, B i C) Wyniki w grupie chorych nieleczonych (n = 417). (D, E i F) Wyniki w grupie chorych leczonych tamoksyfenem (n = 249). PgR receptor progesteronowy. 384 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

5 Określenie klinicznie istotnych molekularnych podtypów raka piersi dzono stosując pakiet SPSS Statistical Software Package, wersja 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) oraz pakiet R (wersja z roku 2006, Zależność pomiędzy czasem przeżycia a niektórymi zmiennymi ilościowymi oceniano, używając modyfikacji metody wykorzystanej wcześniej do oszacowania przeżycia w funkcji zmiennej częstości przerzutów odległych Wykreślano krzywe zależności między odsetkiem chorych z przerzutami odległymi a GGI, ESR1 i PgR, stosując model Coxa dopasowany pojedynczo do każdej analizowanej zmiennej. WYNIKI Zastosowanie GGI do luminalnych podtypów raka piersi Aby przeanalizować ekspresję genów wchodzących w skład indeksu GGI w odniesieniu do opisanych wcześniej molekularnych podtypów raka piersi, dane dotyczące ekspresji tych genów poddano klasteryzacji hierarchicznej, z próbkami uporządkowanymi identycznie jak w oryginalnych publikacjach 1 (Ryc. 1A). Ogólnie ujmując, ER-ujemne podtypy raka piersi: podtyp podstawny i ErbB2 miały wysokie wartości GGI lub zostały sklasyfikowane jako próbki o wysokim genomicznym stopniu złośliwości (GGI " 0). W przeciwieństwie do tych dwóch grup prawie wszystkie raki ER-dodatnie należące do podtypu luminalnego A, charakteryzujące się najlepszym rokowaniem, miały niskie wartości GGI. Te wartości GGI odpowiadają niskiemu stopniowi złośliwości, podobnemu do raków podtypu seminormalnego (normal-like). Natomiast raki w podtypach luminalnych B i C charakteryzują się istotnie wyższymi wartościami GGI w stosunku do podtypu luminalnego A (P! 0,01; Tabela A3 w załączniku na stronie internetowej). Na podstawie tych wyników można stwierdzić, że podtypy luminalne charakteryzowały się zróżnicowaniem wartości GGI, podczas gdy większość raków ER-ujemnych wykazywała wysoki genomiczny stopień złośliwości. Dane sugerowały, że za pomocą GGI, prostego algorytmu matematycznego, można otrzymać wyniki podobne do klasyfikacji uzyskanych wcześniej na podstawie podziału na molekularne podtypy raka piersi, powstałego w drodze hierarchicznej klasteryzacji na podstawie zestawu charakterystycznych genów oraz wyznaczania centroid dla uzyskanych klastrów. Aby potwierdzić skuteczność algorytmu GGI, zastosowaliśmy go na zasadzie identycznej do opisanej powyżej do populacji badanej przez Sorlie i wsp , która zawierała wiele próbek, niemożliwych do zaklasyfikowania przez porównanie do centroid poszczególnych klastrów. Jak widać na Ryc. 1B, próbki uprzednio klasyfikowane jako luminalne A lub B, różnią Ryc. 3. Wykresy ryzyka wystąpienia przerzutów odległych w grupie chorych z ER-dodatnim rakiem piersi. (A) Wyniki w grupie chorych niepoddanych leczeniu systemowemu (zbiór danych Wang i wsp. 11 ). (B) Wyniki w grupie chorych leczonych tamoksyfenem. Na osi x przedstawiono wartość wskaźnika predykcyjnego ocenionego dla każdego chorego, linia ciągła oznacza wartość mediany, a linie przerywane wyznaczają zakres 25-75% CI. GGI genomiczny indeks złośliwości; PgR receptor progesteronowy. 385

6 Loi i wsp. się istotnie wartościami GGI (P! 0,0001). Ponadto wartość GGI dało się przypisać do każdej próbki ERdodatniej, klasyfikując ją w ten sposób do podtypu o niskimbądźwysokimgenomicznymstopniuzłośliwości.jako dodatkową weryfikację, obliczono wartości GGI dla pięciu podtypów raka piersi zdefiniowanych na podstawie zbioru charakterystycznych genów w próbkach z publikacji van de Vijvera i wsp. 10 (Ryc. 1C). Ponownie uzyskane wartości GGI różniły się istotnie pomiędzy podtypem luminalnym A i B (P! 0,0001). Jak zaobserwowano poprzednio, 13 ponad 100 z 295 guzów nie udało się wiarygodnie przypisać do konkretnego podtypu według definicji Sorlie i wsp. 2 Natomiast w naszej analizie, opartej na ocenie genomicznego stopnia złośliwości, niezaklasyfikowane uprzednio próbki istotnie różnią się rokowaniem (P = 0,0001, Ryc. 1A w załączniku na stronie internetowej). Podsumowując, uzyskane wyniki sugerują, że wartości GGI mogą, w sposób wysoce porównywalny do podtypów uprzednio opisywanych, rozróżniać klinicznie istotne podgrupy raka piersi, szczególnie w rakach ER-dodatnich. Wyróżnienie dwóch podtypów ER-dodatniego raka piersi na podstawie genomicznego stopnia złośliwości i ocena ich klinicznego znaczenia Dalsza weryfikacja zaproponowanej koncepcji została przeprowadzona na zbiorze 666 ER-dodatnich raków piersi. Każda z próbek została przypisana do grupy niskiego lub wysokiego genomicznego stopnia złośliwości, w zależności od obliczonej wartości GGI. Aby ocenić, czy uzyskana w ten sposób klasyfikacja wyróżnia grupy o znaczeniu klinicznym, przeprowadzono analizę Kaplana-Meiera, porównując ERdodatnie raki piersi w zależności od wartości GGI (porównanie wysokiego i niskiego genomicznego stopnia złośliwości) oraz ekspresji ER i PgR, zarówno wśród chorych nieleczonych, jak i leczonych tamoksyfenem (Ryc. 2). Dla populacji chorych z ER-dodatnim rakiem piersi, zarówno nieleczonych (Ryc. 2A, 2B i 2C), jak i leczonych tamoksyfenem (Ryc. 2D, 2E i 2F) podgrupy wyróżnione na podstawie niskiej i wysokiej ekspresji receptora estrogenowego (ekspresja genu ESR1) nie miały żadnej wartości prognostycznej. W przeciwieństwie do grup uzyskanych na podstawie analizy genomicznego stopnia złośliwości oraz ekspresji PgR miały istotną statystycznie wartość prognostyczną. Grupa ER-dodatnich raków piersi o niskim GGI (chore nieleczone, n = 235, 56%; chore leczone tamoksyfenem, n = 150, 60%) wykazywała istotnie mniejszy odsetek chorych z nawrotem odległym po 10 latach obserwacji w porównaniu z grupą ER-dodatnich raków piersi o wysokim wskaźniku GGI (Ryc. 2). Dodatkowo wydaje się, że grupa o wysokim ryzyku ciągle wykazuje złe rokowanie mimo uzupełniającej monoterapii tamoksyfenem. Dla dalszego zobrazowania prognostycznej wartości genomicznego stopnia złośliwości w ER-dodatnich rakach piersi sporządzono wykresy przedstawiające oszacowanie częstości nawrotów odległych w funkcji wartości GGI i porównano je do wartości ESR1 i PgR dla każdego zbioru danych, wykorzystanego w naszej analizie (Ryc. 3, Ryc. A2 w załączniku na stronie internetowej). Według rycin częstość przerzutów odległych po 10 latach zwiększyła się znacząco ze wzrostem wartości GGI, wskazując na dużą wartość dyskryminacyjną tego czynnika w ERdodatnich rakach piersi. Niezależna wartość prognostyczna genomicznego stopnia złośliwości w modelu wielozmiennym Tabele 1 i 2 przedstawiają jednozmienną i wielozmienną analizę genomicznego stopnia złośliwości wraz z innymi standardowymi zmiennymi prognostycznymi w grupie chorych nieleczonych i leczonych tamoksyfenem. W wielozmiennej analizie regresji Coxa w grupie chorych nieleczonych istotnymi czynnikami prognostycznymi pozostawały tylko genomiczny stopień złośliwości, stężenie PgR oraz histologiczny stopień złośliwości. W grupie chorych leczonych tamoksyfenem wyłącznie genomiczny stopień złośliwości był statystycznie istotny w analizie wielozmiennej. Uzyskane wyniki potwierdzają znaczną wartość prognostyczną genomicznego stopnia złośliwości i jego przewagę w przewidywaniu rokowania nad stopniem złośliwości ocenianym histologicznie, zarówno wśród nie- Tabela 1. Jednozmienna i wielozmienna analiza markerów prognostycznych w raku piersi w grupie chorych bez leczenia uzupełniającego (N = 417) Zmienna Analiza jednozmienna Iloraz hazardu 95% Cl P* Analiza wielozmienna Iloraz hazardu 95% Cl P* Wiek: # 50 wobec 50 lat 0,88 0,61 do 1,27 0,48 0,82 0,50 do 1,34 0,43 Średnica guza: 2 wobec # 2 cm 1,77 1,27 do 2,46 0,0008 1,38 0,94 do 2,03 0,10 Histologiczny stopień zróżnicowania 0, ,015 1 wobec ,11 1,53 do 2,90 1,83 0,87 do 3, wobec 3 2,62 1,69 do 4,08 1,56 0,97 do 2,51 Receptor estrogenowy: wysoki wobec niskiego 0,91 0,66 do 1,27 0,59 1,28 0,83 do 1,95 0,26 Receptor progesteronowy: wysoki wobec niskiego 0,54 0,38 do 0,75 0, ,58 0,39 do 0,89 0,0087 Genomiczny stopień złośliwości: wysoki wobec niskiego 2,64 1,86 do 3,76 0, ,96 1,27 do 3,02 0,0024 *W oparciu o analizę regresji Coxa, przy stratyfikacji wobec zbioru danych. 386 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

7 Określenie klinicznie istotnych molekularnych podtypów raka piersi Tabela 2. Jednozmienna i wielozmienna analiza markerów prognostycznych w raku piersi w grupie chorych leczonych uzupełniająco tamoksyfenem (N = 249) Zmienna Analiza jednozmienna Iloraz hazardu 95% Cl P* Analiza wielozmienna Iloraz hazardu 95% Cl P* Wiek: # 50 wobec 50 lat 1,18 0,42 do 3,29 0,75 1,06 0,30 do 3,73 0,92 Średnica guza: 2 wobec # 2 cm 1,94 1,14 do 3,30 0,01 1,56 0,84 do 2,92 0,16 Histologiczny stopień zróżnicowania 0,034 0,30 1 wobec ,32 1,32 do 8,38 1,88 0,69 do 5, wobec 3 1,50 0,78 do 2,88 0,69 0,33 do 1,43 Stan węzłów chłonnych: dodatnie wobec ujemnych 1,44 0,84 do 2,49 0,18 1,02 0,55 do 1,88 0,96 Receptor estrogenowy: wysoki wobec niskiego 0,82 0,50 do 1,34 0,42 0,95 0,54 do 1,69 0,86 Receptor progesteronowy: wysoki wobec niskiego 0,42 0,25 do 0,70 0, ,68 0,38 do 1,24 0,20 Genomiczny stopień złośliwości: wysoki wobec niskiego 3,24 1,93 do 5,43 0, ,50 1,28 do 4,90 0,0074 *W oparciu o analizę regresji Coxa, przy stratyfikacji wobec zbioru danych. leczonych systemowo, jak i leczonych tamoksyfenem chorych na ER-dodatniego raka piersi. Porównanie GGI z 21-genowym indeksem RS w grupie chorych leczonych tamoksyfenem Ponieważ indeks RS został szczegółowo zweryfikowany jako czynnik stratyfikujący w ER-dodatnim raku piersi (choć inaczej niż w naszej analizie na podstawie ilościowego badania metodą odwrotnej transkrypcji i łańcuchowej reakcji polimerazy), byliśmy zainteresowani porównaniem klasyfikacji na podstawie GGI i RS. Zwracając szczególną uwagę na to, że GGI oparte jest na jednym szlaku biologicznym, podczas gdy RS łączy kilka. Stwierdziliśmy istotną korelację między oboma indeksami (r = 0,7; 95% CI, od 0,63 do 0,76; P! 0,0001). W następnym etapie w grupie chorych leczonych tamoksyfenem porównaliśmy grupy ryzyka zdefiniowane na podstawie RS z grupami ryzyka zdefiniowanymi na podstawie GGI. Stwierdziliśmy, że obie klasyfikacje są istotnie statystycznie skorelowane (P! 0,0001). W szczególności 90% chorych, dla których ryzyko określono jako niskie na podstawie RS, zostało tak samo zaklasyfikowane na podstawie GGI (danych nie przedstawiono). Porównaliśmy również rokowanie w grupach ryzyka wyodrębnionych na podstawie GGI i RS. Pomimo większego odsetka chorych bez przerzutów do węzłów chłonnych, zaklasyfikowanych jako ryzyko niskie na podstawie GGI w porównaniu z RS (78 względem 40 chorych) 10-letni odsetek chorych bez przerzutów odległych był podobny dla obu klasyfikatorów, odpowiednio 83% i 84% (Tabela A4 w załączniku na stronie internetowej). Analiza metodą krzywych charakterystyki odbiornika wykazała, że predykcyjna wartość GGI i RS jest porównywalna (Ryc. 4). DYSKUSJA Na podstawie analizy ponad 650 próbek ER-dodatniego raka piersi wykazaliśmy, że genomiczny indeks złośliwości pozwala na wyraźne rozróżnienie dwóch molekularnych podtypów raka piersi w grupie chorych, u których guz piersi wykazuje co najmniej niewielki stopień ekspresji ER. W analizach jedno- i wielozmiennych, uwzględniających tradycyjne kliniczne czynniki prognostyczne, GGI był najsilniejszą zmienną o znaczeniu prognostycznym. Potwierdził tym samym znaczenie genów związanych z cyklem komórkowym i stopniem złośliwości w określeniu rokowania u chorych z ER-dodatnim rakiem piersi (Tabela 1). Wykazaliśmy po raz pierwszy, że wysoki genomiczny stopień złośliwości jest związany z niekorzystnym rokowaniem w dużej populacji chorych leczonych uzupełniająco tamoksyfenem. Uzyskane wyniki nie zmieniały się istotnie po wyłączeniu próbek wykazujących nadekspresję receptora naskórkowego czynnika wzrostu typu 2 ocenianego metodą immunohistochemiczną (10% próbek kwalifikujących się do oceny w grupie leczonych tamoksyfenem). Pojawienie się wielu nowych strategii uzupełniającej terapii hormonalnej podkreśla potrzebę poszukiwania markerów prognozujących rokowanie w grupie chorych leczonych tamoksyfenem. Jak przedstawiono na Ryc. 1, wykazaliśmy, że mimo użycia różnych metod do wyodrębnienia podgrup na podstawie cech molekularnych otrzymana klasyfikacja jest podobna do poprzednich podziałów uzyskanych na podstawie hierarchicznej klasteryzacji według zestawu charakterystycznych genów. 1-3 Co interesujące, w grupie chorych leczonych tamoksyfenem GGI jest istotnie skorelowany z wynikami indeksu RS (liczonego na podstawie danych z mikromacierzy) i wykazuje podobną wydajność. Jednak zastosowanie metody GGI wykazuje wiele zalet. Po pierwsze, wartość tego indeksu jest łatwo obliczana przez uśrednienie wartości 97 genów. Jak wykazaliśmy, wynik może być obliczony także na podstawie mniejszego podzbioru tych genów, z niewielką stratą wydajności, i to niezależnie od użytej platformy oznaczania ekspresji genów. 9 Po drugie, funkcja biologiczna genów użytych do zdefiniowania GGI jest łatwo zrozumiała, gdyż geny te zostały wybrane przez ich korelację z histologicznym stopniem zróżnicowania. Ponieważ zgodność między wy- 387

8 Loi i wsp. Ryc. 4. Krzywe charakterystyki odbiornika (ROC) zależne od czasu dla genomicznego indeksu złośliwości (GGI) oraz 21-genowego indeksu nawrotu (RS) przy ocenie 10-letniego ryzyka przerzutów odległych w grupie chorych leczonych tamoksyfenem. Pole pod krzywą wynosi 0,7 dla GGI oraz 0,69 dla RS. Wartości P wskazują, że między krzywymi nie ma różnicy istotnej statystycznie. nikami przewidywania rokowania za pomocą różnych zbiorów genów jest znaczna, 24 wydaje się, że identyfikacja odpowiedzialnego za tę zgodność wspólnego zjawiska biologicznego jest zadaniem bardzo istotnym. Wykorzystanie genomicznego indeksu złośliwości do stratyfikacji grupy ER-dodatnich chorych na raka piersi ułatwi zatem wprowadzenie klasyfikacji według podtypów molekularnych do praktyki klinicznej i ukierunkowanych badań naukowych. Dotąd opublikowano kilka sygnatur, które opisywane są jako potencjalnie zdolne do przewidywania rokowania w grupie ER-dodatnich raków piersi leczonych tamoksyfenem. 6,7,11,25-27 Geny związane z proliferacją wydają się podstawową składową istniejących sygnatur genowych. 9 Dai i wsp. 28 donieśli, że zwiększona proliferacja komórkowa była związana z gorszym rokowaniem w grupie chorych na raka piersi. We wzorze, na podstawie którego obliczany jest indeks RS, 7 zbiór genów proliferacji ma największą wagę (współczynnik). To podkreśla kluczowe znaczenie tych genów w prognozowaniu przeżycia. 7 Podobnie inna klasyfikacja molekularna ER-dodatnich raków piersi, oparta wyłącznie na genach regulowanych przez estrogeny, wykazała dla grupy o złym rokowaniu istotną zależność od histologicznego stopnia złośliwości i wysoką ekspresję genów proliferacji. 6 W naszym badaniu podejmujemy próbę ujednolicenia podgrup definiowanych na podstawie genomicznego wskaźnika złośliwości oraz wcześniejszych klasyfikacji, przez znalezienie wspólnej biologicznej cechy mogącej przyczynić się do wyjaśnienia heterogenności ER-dodatnich raków piersi. W przyszłości ważnym celem będzie porównywanie różnych klasyfikacji, aby lepiej zrozumieć ich wzajemne zależności i zbudować optymalny, szeroko akceptowany i łatwy we wdrożeniu system stratyfikacji guzów wrażliwych na leczenie hormonalne. Ważnym elementem takiego badania będzie rekrutowana prospektywnie kohorta chorych, co pozwoli wyeliminować błąd systematyczny związany z selekcją, nieunikniony w grupach opartych na mrożonym materiale archiwalnym. Ten błąd można zauważyć w naszym badaniu w grupie chorych leczonych tamoksyfenem, gdzie zaobserwowano brak istotności przerzutów do węzłów chłonnych w analizie statystycznej i relatywnie małą częstość chorych bez przerzutów odległych w 10-letniej obserwacji, w porównaniu z odsetkami oczekiwanymi na podstawie badań populacyjnych. 29 Na podstawie naszych badań wyciągamy zatem wniosek, że genomiczny wskaźnik złośliwości, zdefiniowany przez GGI, w sposób wiarygodny i powtarzalny w wielu zbiorach danych pozwala rozróżnić dwa podtypy ERdodatniego raka piersi. W przyszłości w prospektywnych badaniach klinicznych raka piersi stratyfikacja na podstawie podtypu molekularnego może pomóc w wyjaśnieniu przyczyn zróżnicowanego efektu działania różnych leków hormonalnych, chemioterapeutyków czy leków celowanych. Obecnie nie wiadomo, czy grupa o wysokim genomicznym indeksie złośliwości będzie odnosić korzyść z wdrożenia chemioterapii lub alternatywnych leków antyestrogennych. W dodatku dalsze ukierunkowane badania biologiczne ścieżek regulujących maszynerię cyklu komórkowego mogą ułatwić odkrywanie nowych leków, pomocnych w leczeniu chorych na raka piersi o wysokiej złośliwości. 30 PIŚMIENNICTWO 1. Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R, et al: Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumour subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci U S A 98: , Sorlie T, Tibshirani R, Parker J, et al: Repeated observation of breast tumour subtypes in independent gene expression data sets. Proc Natl Acad Sci U S A 100: , Sotiriou C, Neo SY, McShane LM, et al: Breast cancer classification and prognosis based on gene expression profiles from a population-based study. Proc Natl Acad Sci U S A 100: , Perou CM, Sorlie T, Elsen MB, et al: Molecular portraits of human breast tumours. Nature 406: , Hu Z, Fan C, Oh DS, et al: The molecular portraits of breast tumors are conserved across microarray platforms. BMC Genomics 7:96, Oh DS, Troester MA, Usary J, et al: Estrogenregulated genes predict survival in hormone receptorpositive breast cancers. J Clin Oncol 24: , Paik S, Shak S, Tang G, et al: A multigene assay to predict recurrence of tamoxifen-treated, node-negative breast cancer. N Engl J Med 351: , Sorlie T: Molecular portraits of breast cancer: Tumour subtypes as distinct disease entities. Eur J Cancer 40: , Sotiriou C, Wirapati P, Loi S, et al: Gene expression profiling in breast cancer: Understanding the molecular basis of intermediate histologic grade to improve prognosis. J Natl Cancer Inst 98: , van de Vijver MJ, He YD, van t Veer LJ, et al: A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 347: , Wang Y, Klijn J, Zhang Y, et al: Gene-expression profiles to predict distant metastasis of lymph-nodenegative primary breast cancer. Lancet 365: , Elston CW, Ellis IO: Pathological prognostic factors in breast cancer: I. The value of histological grade in breast cancer- Experience from a large study with long-term follow-up. Histopathology 19: , JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

9 Określenie klinicznie istotnych molekularnych podtypów raka piersi 13. Chang HY, Nuyten DS, Sneddon JB, et al: Robustness, scalability, and integration of a woundresponse gene expression signature in predicting breast cancer survival. Proc Natl Acad Sci U S A 102: , Heagerty PJ, Lumley T, Pepe MS: Timedependent ROC curves for censored survival data and a diagnostic marker. Biometrics 56: , Therneau TM, Grambasch PM: Modeling Survival Data: Extending the Cox Model. New York, NY, Springer, Valenta Z, Weissfeld L: Estimation of the survival function of Gray s piecewise-constant timevarying coefficients model. Stat Med 21: , Gray RJ: Flexible methods for analyzing survival data using splines, with applications to breast cancer prognosis. J Am Stat Assoc 87: , Goss PE, Ingle JN, Martino S, et al: A randomized trial of letrozole in postmenopausal women after five years of tamoxifen therapy for early-stage breast cancer. N Engl J Med 349: , Boccardo F, Rubagotti A, Puntoni M, et al: Switching to anastrozole versus continued tamoxifen treatment of early breast cancer: Preliminary results of the Italian Tamoxifen Anastrozole Trial. J Clin Oncol 23: , 2005 Fig 4. Time-dependent receiver operating characteristic curves for the gene expression grade index (GGI) and the 21-gene recurrence score (RS) for metastases within 10 years for the tamoxifen-treated dataset.areaunderthecurveis0.7forggiand0.69for RS. P value shows curves are not significantly different. 20. Thurlimann B, Keshaviah A, Coates AS, et al: A comparison of letrozole and tamoxifen in postmenopausal women with early breast cancer. N Engl J Med 353: , Baum M, Buzdar A, Cuzick J, et al: Anastrozole alone or in combination with tamoxifen versus tamoxifen alone for adjuvant treatment of postmenopausal women with early-stage breast cancer: Results of the ATAC (Arimidex, Tamoxifen Alone or in Combination) trial efficacy and safety update analyses. Cancer 98: , Coombes RC, Hall E, Gibson LJ, et al: A randomized trial of exemestane after two to three years of tamoxifen therapy in postmenopausal women with primary breast cancer. N Engl J Med 350: , Jakesz R, Jonat W, Gnant M, et al: Switching of postmenopausal women with endocrine-responsive early breast cancer to anastrozole after 2 years adjuvant tamoxifen: Combined results of ABCSG trial 8 and ARNO 95 trial. Lancet 366: , Fan C, Oh DS, Wessels L, et al: Concordance among gene-expression-based predictors for breast cancer. N Engl J Med 355: , van t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, et al: Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 415: , Ma XJ, Wang Z, Ryan PD, et al: A two-gene expression ratio predicts clinical outcome in breast cancer patients treated with tamoxifen. Cancer Cell 5: , Loi S, Piccart MJ, Desmedt C, et al: Prediction of early distant relapses on tamoxifen in early-stage breast cancer (BC): A potential tool for adjuvant aromatase inhibitor (AI) tailoring. J Clin Oncol 23:6s, 2005 (suppl, abstr) 28. Dai H, van t Veer L, Lamb J, et al: A cell proliferation signature is a marker of extremely poor outcome in a subpopulation of breast cancer patients. Cancer Res 65: , Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group: Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival: An overview of the randomised trials. Lancet 365: , Wilcken NR, Prall OW, Musgrove EA, et al: Inducible overexpression of cyclin D1 in breast cancer cells reverses the growth-inhibitory effects of antiestrogens. Clin Cancer Res 3: , 1997 Oświadczenie autorów na temat potencjalnych konfliktów interesów Autorzy nie wskazali możliwości konfliktu interesów. Wkład poszczególnych autorów Koncepcja i projekt badania: Sherene Loi, Benjamin Haibe-Kains, Christine Desmedt, Mauro Delorenzi, Martine J. Piccart, Christos Sotiriou Wsparcie finansowe: Martine J. Piccart Wsparcie administracyjne: Sherene Loi, Benjamin Haibe-Kains, Christine Desmedt, Cheryl Gillett, Paul Ellis, Jonas Bergh, Martine J. Piccart, Christos Sotiriou Dostarczenie próbek lub umożliwienie dostępu do chorych: Sherene Loi, Christine Desmedt, Françoise Lallemand, Andrew M. Tutt, Cheryl Gillett, Paul Ellis, Adrian Harris, Jonas Bergh, Denis Larsimont, Martine J. Piccart, Christos Sotiriou Zbieranie i gromadzenie danych: Sherene Loi, Benjamin Haibe-Kains, Christine Desmedt, Françoise Lallemand, Andrew M. Tutt, Cheryl Gillett, Paul Ellis, Adrian Harris, Jonas Bergh, John A. Foekens, Jan G.M. Klijn, Denis Larsimont, Mauro Delorenzi, Christos Sotiriou Analiza i interpretacja danych: Sherene Loi, Benjamin Haibe-Kains, Christine Desmedt, Adrian Harris, John A. Foekens, Jan G.M. Klijn, Denis Larsimont, Marc Buyse, Gianluca Bontempi, Mauro Delorenzi, Martine J. Piccart, Christos Sotiriou Pisanie manuskryptu: Sherene Loi, Benjamin Haibe-Kains, Christine Desmedt, John A. Foekens, Jan G.M. Klijn, Gianluca Bontempi, Mauro Delorenzi, Martine J. Piccart, Christos Sotiriou Ostateczna akceptacja manuskryptu: Sherene Loi, Benjamin Haibe-Kains, Christine Desmedt, Andrew M. Tutt, Adrian Harris, John A. Foekens, Jan G.M. Klijn, Marc Buyse, Gianluca Bontempi, Mauro Delorenzi, Martine J. Piccart, Christos Sotiriou Dodatek Dodatek znajduje się w pełnej wersji artykułu, dostępnej na stronie internetowej. Nie jest dołączony do wersji PDF. 389