Prof. dr hab. Stanisław W. Gawroński Wydział Ogrodnictwa, Biotechnologii i Architektury Krajobrazu, w Warszawie

Transkrypt

1 Prof. dr hab. Stanisław W. Gawroński Wydział Ogrodnictwa, Biotechnologii i Architektury Krajobrazu, w Warszawie SGGW RECENZJA rozprawy doktorskiej mgr Agnieszki Kozak pt.: "Wpływ juglonu na generowanie stresu oksydacyjnego w ziarniakach wybranych gatunków zbóż i nasionach chwastów agrosystemu zbożowego" wykonanej na Wydziale Przyrodniczym, Przyrodniczo-Humanistycznego w Siedlcach. Uniwersytetu 1. Wprowadzenie Intensywnie rozwijana w ostatnich dziesięcioleciach chemizacja rolnictwa zaczęła budzić szereg zastrzeżeń zarówno w obszarze pogorszenia się stanu agrośrodowiska jak również toksykologicznego bezpieczeństwa produkowanej żywności. Przykładem negatywnego oddziaływania na agroekosystem jest wieloletnia uprawa kukurydzy w monokulturze prowadząca do degradacji gleb użytkowanych rolniczo jak również spadek zawartości próchnicy w pasach herbicydowych sadów w których zwalczanie chwastów oparto tylko na metodach chemicznych. W konsekwencji ujawnionych zagrożeń organy administracyjne wielu krajów i Unia Europejska wprowadziły szereg ograniczeń w tym skreślenie wielu dotychczas stosowanych pestycydów. Jedną z decyzji było wprowadzenie w 2015 roku jako obowiązującej integrowanej metody ochrony roślin w której pestycydy są tylko jednym z narzędzi w ochronie roślin i powinny być stosowane w sytuacji kiedy jest to konieczne i w ilościach w jakich jest to niezbędne. Ostatnio duże sieci handlowe również w obawie o bezpieczeństwo swoich klientów wprowadziły ograniczenia ilości stosowanych preparatów ograniczając je zwykle do trzech, mimo iż musi być przestrzegany i nie przekroczony poziom pozostałości to obawy budzi brak badań dotyczący działania synergistycznego zastosowanych insektycydów, fungicydów i herbicydów. Z drugiej strony przy obecnych kosztach produkcji bardzo często trudno jest rezygnować z metod chemicznych opartych na syntetycznych herbicydach. Szukając nowych rozwiązań podpatrujemy jak czyni to przyroda gdzie również ma miejsce chemiczna walka miedzy roślinami określana terminem allelopatii. Należy jednak pamiętać że są to substancje (czasami 1

2 nawet bardzo toksyczne) naturalnego pochodzenia łatwo ulegają rozkładowi mikrobiologicznemu. Jedną z bardziej interesujących takich substancji allelopatycznych jest juglon 2. Dane formalne o rozprawie Praca liczy 151 stron, część graficzna zawiera 22 ryciny oraz 27 tabel, zebrana dokumentacja pozwala na precyzyjne przeprowadzenie analiz i udokumentowanie stawianych hipotez. Bibliografia rozprawy liczy 301 pozycji literatury w tym 243 pozycji anglojęzycznych. Sam układ rozprawy jest typowy dla opracowań z tego obszaru nauki. Objętości najważniejszych rozdziałów rozprawy wynoszą odpowiednio: wstęp wyjaśniający ogólne założenia i cel pracy zawarty jest na 3 stronach, przegląd literatury 34 str. i jest zdecydowanie za długi" materiały i metodyka 11 str., wyniki zajmują 62 str, dyskusja 18 str., wnioski 1 str. oraz wspomniana bibliografia zajmująca 13 strony polskie i angielskie, które zawarto na dwóch stronach. oraz streszczenia 3. Dane merytoryczne o rozprawie Podjęte w rozprawie doktorskiej zagadnienie stanowi część badań od szeregu lat prowadzonych w Katedrze Biochemii i Biologii Molekularnej, Wydziału Przyrodniczego, Uniwersytetu Przyrodniczo-Humanistycznego w Siedlcach. Katedra ma ugruntowaną pozycję w kraju jako jednej z czołowych w obszarze badań podstawowych z zakresu ochrony roślin. Zagadnieniem podjętym w przedstawionej rozprawie była analiza generowania przez juglon, allelopatyk roślin z rodziny orzechowatych (Juglandaceae) stresu oksydacyjnego w nasionach zbóż i chwastów agrosystemu zbożowego.. Ograniczenie konkurencji chwastów w uprawach roślin zbożowych; których struktura łanu w początkowych okresach rozwoju sprzyja skiełkowaniu i wzrostowi wielu gatunków chwastów jest kluczowa w plonowaniu tych roślin. Jedynym wyjątkiem jest żyto, które z wyjątkiem odmian o skróconym źdźble doskonale radzi sobie z konkurencja chwastów za sprawą swoich zdolności allelopatycznych. Doktorantka w przedstawionej rozprawie bardzo obszernie przedstawiła zjawisko allelopatii, zaprezentowała wyniki osiągnięte przez innych autorów w tym prowadzących badania nad juglonem. Tak przygotowane tło literaturowe pozwoliło na określenie osiągniętej wiedzy i sprecyzowanie celu rozprawy, którego osiągnięcie ma szanse na dokonanie znaczącego postępu w tym obszarze badań. Cel główny rozprawy było poznanie działania allelozwiazku juglonu na poziomie metabolicznym i molekularnym. Zakres pracy zostały dobrze zdefiniowane. Zabrakło mi natomiast w tej części pracy podkreślenia dodatkowej zalety wzięcia do badan nad allelopatykami właśnie juglonu albowiem szereg danych wskazuje na bezpośredni udział 2

3 chinonów w przemianach których rezultatem są wolne rodniki. Chinony mogą bowiem pośredniczyć w utlenianiu innych związków, niereagujących bezpośrednio z tlenem. Innymi słowy jest to ingerencja czynnikiem, który sam jest uczestnikiem tych burzliwych przemianach tworzących ROS i obrona przed ich destrukcyjnym działaniem. Wprawdzie wszystkie allelozwiązki jako wywołujące stres biotyczny wywołują wzrost ROS ale dla wielu substancji jest to działanie na dalszym etapie przemian np.: inhibicji procesu enzymatycznego. W przeglądzie literatury poświęcono wiele innym gatunkom roślin o silnym działaniu allelopatycznym i funkcjonującym w roślinach mechanizmom obronnym. W zgromadzonej literaturze Doktorantka opisała dostatecznie obszernie na jakie procesy wpływa juglon ale zbrakło mi informacji charakteryzujących fizyko-chemicznie tą substancję a jest już dobrze opracowana włącznie z toksykologią, która jest istotna skoro są plany ewentualnego zastosowania więc możliwość z nią kontaktu. Oczywistym jest również pytanie jakim przemianom ulega w roślinie na które prawdopodobnie trudno odpowiedzieć ale więcej wiemy o całej grupie chemicznej jaką są chinony. Zwykle usunięcie grup funkcyjnych z danego związku biologicznie czynnego jest jednym z głównych mechanizmów obronnych roślin na herbicydy syntetyczne. Juglon wymywany jest z liści w postaci glikozydu i dopiero po deglikozydacji funkcjonuje w glebie w postaci nafto chinonu. A warto pamiętać że chinony kiedy znajdą się w glebie nie tylko są allelopatykmi ale pełną również istotną rolę w procesie humifikacji czyli tworzeniu się próchnicy. W przypadku wymycia juglonu do wody nadal działa herbicydalnie na rosnące tam rośliny ale jest szybko rozkładany. Zdaniem recenzenta w momencie kiedy proponuje się w przyszłości wykorzystanie danego związku jako naturalnego herbicydu znacznie skromniejszy może być opis działania allelopatycznego innych roślin (szczególnie jeśli inny jest ich mechanizm działania) a w pełni powinno się przedstawić wiedzę o losach zalecanego produktu w środowisku. Na usprawiedliwienie Doktorantki należy dodać iż za to drobne uchybienie współodpowiedzialni są również jej promotorzy. Rozdział materiały i metody jest dobrze opisany W pracy zastosowano jednak wiele technik analitycznych, których opanowanie jest bardzo dobrą wizytówką kwalifikacji Doktorantki, wskazuje zarazem na łatwość z jaka zmierzyła się się z nowymi wyzwaniami. Wykonanie tak szerokiego wachlarza analiz jest cennym doświadczeniem w pracy eksperymentalnej. Na podkreślenie zasługuje bardzo poprawne przeprowadzenie zarówno testów związanych z kiełkowaniem jak i analiz chemicznych i molekularnych. Zaufanie do uzyskanych wyników bardzo dobrze potwierdza przeprowadzona prawie do wszystkich 3

4 wyników analiza statystyczna uzyskanych wyników, która przy przeprowadzeniu stosunkowo ostrym testem Tukey'a bardzo dobrze potwierdza występujące zróżnicowanie. Kolejny rozdział stanowią wyniki, zarówno ich opis jak i prezentowane dane źródłowe są przedstawione bardzo komunikatywnie. Pierwsza cześć wyników dotyczy wpływu juglonu na kiełkowanie nasion roślin agrosystemu zbożowego, które bardzo wyraźnie wykazały znacznie wyższą tolerancję tego allelozwiązku przez 4 gatunki badanych zbóż w porównaniu do ocenianych chwastów. Bardziej precyzyjne informacje o tym procesie dostarczyła przeprowadzona ocena wpływu juglonu na rozwój siewek badanych roślin, która objęła, wpływ na kiełkowanie nasion badanych gatunków. Rośliny zbożowe wykazały się w porównaniu do chwastów znacznie wyższą tolerancja na juglon. Na uwagę zasługuje wysoka tolerancja pszenicy nawet w najwyższej dawce 10 mm co potwierdzały również inne parametry którymi określano rozwój badanych siewek jak długość części nadziemnych, długość korzeni pierwotnych oraz masa tych organów. Najbardziej cenną a również zdaniem recenzenta najbardziej interesującą częścią rozprawy jest wpływ juglonu na tworzenie się wolnych rodników tlenowych które w pracy reprezentował anionorodnik ponadtlenkowy. Wśród roślin uprawnych pszenica i jęczmień już po jednym dniu zareagowały istotnym wzrostem anionorodnuka podltlenkowego we wszystkich trzech stężeniach juglonu i jego spadkiem w następnych dniach ale zawsze był on wyższy jak w kontroli. Natomiast chwasty zareagowały znacznie wyższym poziomem tego rodnika tlenowego i jego podwyższony poziom notowano w drugim i dalszych dniach eksperymentu. Mechanizm obronny roślin przed anionorodnikem ponadtlenkowym opiera się na reakcji dysmutacji tego rodnika do nadtlenku wodoru a w dalszej reakcji pod wpływem enzymu katalazy otrzymujemy wodę i tlen cząsteczkowy. Aktywność desmutazy ogranicza tworzenie rodnika wodorotlenkowego czemu sprzyja kwaśne środowisko, będącego znacznie bardziej aktywnym utleniaczem aniżeli anionorodnik ponadtlenkowy. W pracy przedstawiono wyniki oceny aktywności dysmutazy ponadtlenkowej w nasionach zarówno zbóż jak i chwastów. Największą aktywnością tego enzymu wśród zbóż wykazało się pszenżyto, natomiast wśród chwastów chaber bławatek. W przedstawionej rozprawie reaktywne cząsteczki oceniano na przykładzie najbardziej obficie pojawiającym się nadtlenku wodoru (H202). Juglon w zbożach generował nadtlenek wodoru w ilościach poniżej 0.2 um H202 x g-l Ś. m. przy czym najrnniejsze ilości tej reaktywnej cząsteczki odnotowano w siewkach owsa. Natomiast w nasionach chwastów odnotowano poziomy dwukrotnie wyższe (w różnych dniach) przy najniższym poziomie w siewkach kąkolu polnego. W analizowanych 4

5 przemianach ważnym staje się wpływ juglonu na aktywność enzymu katalazy w nasionach badanych roślin. W uruchomieniu enzymu katalazy w obronie przed reaktywnym nadtlenkiem wodoru najbardziej skuteczna była pszenica już w drugim dniu był to poziome jaki inne zboża w ogóle osiągnęły a w 8 dniu był nawet trzykrotnie wyższy. Aktywność tego enzymu u chwastów również była zróżnicowana, w maku i chabrze była podobna do zbóż (poza pszenicą) natomiast bardzo dużą aktywnością katalazy wykazał się kąkol i to we wszystkich dniach przeprowadzonych analiz. W kolejnym eksperymencie Doktorantka przeprowadziła analizę wpływu juglonu na ekspresji wybranych genów kodujących izoenzymy katalazy w pszenicy, kukurydzy i soi. Juglon zwiększał ekspresje genów wszystkich izoenzymów natomiast okazało się stężenie juglonu nie odgrywało zbyt istotnej roli w tej ekspresji katalazy. W aktywności antyoksydacyjnej tkanek istotną rolę odgrywają również nieenzymatyczne antyoksydanty np.: związki fenolowe, których zdolności antyoksydacyjne określa się z wykorzystaniem wolnego rodnika DPPH przez pomiar zmienionej przez niego po zredukowaniu barwy z filetowej na żółtą. Najbardziej wydajną skutecznością wygaszania rodnika DPPH wśród zbóż charakteryzowały się jęczmień i pszenżyto a wśród chwastów u mak i chaber a kąkolu i pierwszych dniach eksperymentu. W sumie kombinacje chwastów traktowane juglonem w stosunku do kontroli wykazały się niższą zdolnością do redukcji DPPH. W pracy przedstawiono również ocenę wpływu wolnych rodników i reaktywnych cząstek tlenu na stopień uszkodzeń błon komórkowych. Zwykle pierwszymi ofiarami peroksydacji aktywnymi formami tlenu są lipidy w tym zawarte w błonach komórkowych decydujące o transporcie wewnątrz tkanek roślinnych. Stopień peroksydacji mierzony jest pośrednio przez pomiar poziomu dialdehydu malonowego (MDA) jednego z produktów wytwarzanych w trakcie tego procesu. U wszystkich roślin proces peroksydacji naj silniej ujawnił się w najwyższym stężeniu juglonu i w czasie pierwszych dwóch dniach. Peroksydacja roślin zbożowych była na podobnym poziomie w tym samym zakresie reakcji mieścił się również chaber, natomiast maku i kąkolu była prawie dwa razy wyższa. Ostatnim parametrem oceny wpływu juglonu na kiełkujące nasiona roślin agrosystemy zbożowego był wyciek elektrolitów z komórek nasion. Istotny wpływ stężenia juglonu jako czynnika biologicznie czynnego na ten parametr jest dość oczywisty. Bardzo istotne okazały się różnice gatunkowe, u pszenicy odnotowani naj słabszy wyciek natomiast najwyższy był u chabra bławatka. 5

6 Uzyskane wyniki pozwoliły Autorce na wyciagnięcie 7 wniosków, które wynikają z przeprowadzonych doświadczeń i analiz. Potwierdzono w nich hamujące działanie juglonu na kiełkowanie i wzrost siewek, modyfikacje mechanizmów obronnych opartych zarówno na aktywności enzymów zaangażowanych w usuwanie rodników jak i aktywnych cząstek tlenu oraz nisko cząsteczkowych antyoksydantów. Otrzymane wyniki pozwalają również na postawienie wniosku o znacznie lepszej tolerancji tego allelozwiązku aniżeli chwasty. przez rośliny zobożowe 4. Ocena rozprawy Problematyka podjęta w rozprawie wychodzi naprzeciw stawianemu przez społeczeństwo żądaniu ograniczenia chemizacji produkcji rolnej syntetycznymi pestycydami, których pozostałości w płodach rolnych i bardzo często wolna degradacja w środowisku. wywołuje obawy o stan zdrowia konsumentów i środowiska. Tytuł rozprawy jest zgodny z jej treścią, z dużą precyzją charakteryzuje podjęte badania. Bibliografia zgromadzona w przeglądzie literatury definiuje i przybliża czytelnikowi zjawiska fizjologiczne pełniące częstowidącą role w początkowych etapach wzrostu i rozwoju roślin, okresu kluczowego dla chemicznego zwalczania chwastów. Cel pracy i zakres badań zostały dobrze zdefiniowane. Doktorantka opanowała szeroki wachlarz metod badawczych pozwalających na analizy, które ze względu na krótkotrwałość w jakiej reagują rodniki wymagała precyzyjnego i sprawnego wykonania. Wyniki mimo że jest to trudny obszar do badań są zaprezentowane w sposób bardzo czytelny za sprawą zarówno dobrze skonstruowanego podziału rozprawy, formy przedstawienia oraz opisu. W tym miejscu pragnę podkreślić bardzo komunikatywną formę opisu zjawisk, badanych przez Autorkę rozprawy. Dyskusja, która jest ważnym elementem rozprawy naukowej w tym przypadku mimo iż zagadnienie jest trudne jest bardzo dobrze prowadzona, zapewnia zachowaniem pełnej poprawności metodycznej i logicznej. Autorka umiejętnie konfrontuje wyniki swoich badań z dostępnymi danymi literaturowymi, tym samym potwierdzając ich zgodność. Wnioski są sformułowane poprawnie, dobrze również definiują zanalizowane procesy. 6

7 5. Konkluzja W posumowaniu rozprawę doktorską mgr Agnieszki Kozak stanowiącą kompendium wiedzy nad trudnym zjawiskiem jakim są wolne rodniki i reaktywne cząsteczki tlenu, których poziom w warunkach stresowych ma tendencje wzrostowe oceniam jako bardzo dobrą. Rozprawa potwierdza przebieg szeregu zjawisk w roślinie stanowiąc udokumentowany zbiór informacji o stresie biotycznym wywołanym allelopatykiem jakim jest juglon. Pragnę podkreślić, iż uzyskane wyniki obok aspektu poznawczego, który w tym przypadku cenię sobie najbardziej, ma szanse na wykorzystanie w niektórych obszarach praktyki. Uważam, że praca stanowi oryginalny dorobek naukowy, sposób jej opracowania oraz duża swoboda poruszania się w przedstawionej tematyce badawczej pozwalają na stwierdzenie, że przedstawiona mi do recenzji rozprawa w pełni odpowiada wymaganiom ustawy o stopniach i tytule naukowym i najej podstawie wnioskuje do Rady Wydziału Przyrodniczego, Uniwersytetu Przyrodniczo-Humanistycznego w Siedlcach o dopuszczenie mgr Agnieszki Kozak do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Warszawa b:"t L-~ ~r.7/s-ń Prof. dr hab. Stanisław W. Gawroński 7