Witaminy ROZDZIAŁ 10. Agnieszka Kłych. Agnieszka Kosowska. Teresa Jurczak

Transkrypt

1 ROZDZIAŁ 10 Witaminy Agnieszka Kłych Agnieszka Kosowska Teresa Jurczak Witaminy to drobnocząsteczkowe egzogenne związki organiczne, które pełnią funkcje regulatorowe i są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania organizmu. W odróżnieniu od większości składników pokarmowych, witaminy nie są substratami energetycznymi, ale uczestniczą w reakcjach katalitycznych pełniąc rolę koenzymów. Witaminy pełnią także funkcje parahormonalne. Witaminy muszą być dostarczane do organizmu z pożywieniem w postaci prowitamin lub witamin preformowanych, bądź są produkowane przez mikroorganizmy zasiedlające przewód pokarmowy. Podział witamin opiera się na ich rozpuszczalności. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach Wchłanianie tych witamin uzależnione jest od prawidłowego trawienia i wchłaniania tłuszczów pokarmowych. Nieprawidłowe wchłanianie tłuszczów skutkuje niedoborem witamin rozpuszczalnych w tłuszczach. Transport witamin rozpuszczalnych w tłuszczach w organizmie odbywa się dzięki udziałowi swoistych białek transportujących lub lipoprotein osocza. Ponieważ witaminy te są nierozpuszczalne w wodzie, ich wydalanie przez nerki jest uniemożliwione. Dlatego w przypadku ich nadmiernej podaży mogą gromadzić się w tkankach bogatych w tłuszcz, osiągając stężenia toksyczne. W praktyce objawy toksyczne są efektem farmakologicznego przedawkowania tych witamin. 285

2 Witamina A Rysunek Retinol Wszystkie pochodne witaminy A są związkami 20-węglowymi, zawierającymi pierścień β-jononu oraz dwie jednostki izoprenowe. Ponadto w strukturze występują cztery sprzężone wiązania podwójne. Aktywność witaminy A wykazują retinoidy, czyli retinol, retinal i kwas retinowy. Przy czym pełną aktywność biologiczną ma jedynie retinol. W formie preformowanej witamina A występuje jedynie w pokarmach zwierzęcych w postaci estrów kwasu retinowego. Natomiast karotenoidy i ich pochodne występujące w pokarmach roślinnych są prowitaminami dla człowieka. Do karotenoidów będących prekursorami witaminy A zaliczane są głównie: karoteny α, β, γ oraz kryptoksantyna. Karotenoidy w jelicie ulegają rozszczepieniu przez dioksygenazę karotenową tworząc retinal. Retinal ulega redukcji do retinolu, a następnie estryfikacji. W takiej formie wydzielany jest do chylomikronów. Chylomikrony są transportowane z limfą i trafiają do krążenia wrotnego wątroby. Uwolniony z wątroby retinol transportowany jest z krwią w połączeniu z białkami RBP. Na powierzchni komórki występują specyficzne receptory wiążące kompleks witamina A - RBP. Po związaniu, retinol uwalniany jest do wnętrza komórki, gdzie przekształcany jest do retinalu lub kwasu retinowego. W komórce retinol i kwas retinowy łączą się odpowiednio z białkami CRBP i CRABP. Kompleksy takie łączą się z receptorami jądrowymi: RAR (dla kwasu retinowego) i RXR (dla retinoidów). Wnikając do jądra, regulują ekspresję genów. Źródła aktywnej witaminy A: tran, mleko, wątroba, żółtka jaj, ser. Źródła prowitaminy A: warzywa i owoce zawierające karoteny. Funkcje: retinal jest składnikiem rodopsyny, retinol jest niezbędny do prawidłowego wzrostu i różnicowania komórek, retinol jest niezbędny do prawidłowego działania hormonów steroidowych, kwas retinowy jest niezbędny do syntezy glikoprotein i mukopolisacharydów, kwas retinowy działa jak hormon steroidowy, 286

3 kwas retinowy wykazuje działanie przeciwnowotworowe, witamina A bierze udział w regulacji ekspresji genów, witamina A warunkuje integralność błon komórkowych, witamina A odpowiada za funkcje nabłonka. Dobowe zapotrzebowanie: 1-2 mg. Przyczyny niedoboru witaminy A: zespół złego wchłaniania i trawienia, choroby miąższu wątroby, niedobór w diecie. Skutki niedoboru witaminy A: zmiany w obrębie oczu (suchość spojówek, zmiany chorobowe w rogówce, kurza ślepota), hiperkeratoza, zahamowanie wzrostu u dzieci, niedokrwistość hemolityczna. Witamina D Rysunek ,25-dihydroksycholekalcyferol Witamina D to grupa kalcyferoli, będących pochodnymi cholesterolu, wykazujących działanie biologiczne właściwe dla witaminy D. Prekursorami witaminy D są: ergokalcyferol (pochodzenia roślinnego) i cholekalcyferol (pochodzenia zwierzęcego). Jej aktywne formy to: 25-hydroksycholekalcyferol, 25-hydroksyergokalcyferol oraz 1,25- dihydroksycholekalcyferol. Aktywne formy witaminy D powstają w wyniku przemian zachodzących w skórze, nerkach i wątrobie. 287

4 Rysunek Schemat biosyntezy witaminy D. Przemiany witaminy D są bezpośrednio związane z gospodarką wapniowo-fosforanową. Witamina D odpowiada za utrzymanie prawidłowego stężenia wapnia we krwi, poprzez: zwiększenie wchłaniania wapnia w jelitach, retencję wapnia w kościach, zmniejszenie wydalania wapnia z moczem. Dodatkowo, kalcytriol bierze udział w sekrecji insuliny, hormonów przytarczyc oraz tarczycy. Źródła witaminy D: pokarmy zwierzęce, olej z wątroby ryb morskich. Funkcje: stymulacja ekspresji genu dla białka wiążącego wapń CaBP w jelicie, hamowanie wydalania wapnia i fosforanów w nerkach, nasilenie osteolizy, wzrost syntezy tkanki kostnej, wzrost syntezy osteokalcyny, regulacja uwalniania prolaktyny, hamowanie syntezy parathormonu, udział w wewnątrzkomórkowej homeostazie komórek ściany naczyniowej. Dobowe zapotrzebowanie: 0,01-0,02 mg. 288

5 Przyczyny niedoboru: zespoły złego wchłaniania, uszkodzenie czynności miąższu wątroby i nerek, długoletnie leczenie lekami przeciwpadaczkowymi. Skutki niedoboru: hipokalcemia, wtórna nadczynność przytarczyc, hipofosfatemia, demineralizacja kości. Witamina E Rysunek α-tokoferol Grupa związków wykazujących aktywność witaminy E zbudowana jest z pierścienia aromatycznego i 6-członowego pierścienia heterocyklicznego z atomem tlenu, do którego przyłączony jest 16-węglowy łańcuch boczny. Terminem witamina E określa się związki, do których zaliczamy: α, β, γ, δ tokoferole oraz α, β, γ, δ tokotrienole. Przy czym największą aktywność biologiczną wykazuje α-tokoferol. Tokoferole dostarczane z pożywieniem wchłaniane są w jelicie cienkim. Wchłonięte tokoferole są wbudowywane do chylomikronów i wraz z limfą transportowane są krążeniem wrotnym do wątroby. Połowa z dostarczonych z pokarmem tokoferoli magazynowanych jest w tym narządzie, a reszta trafia do krążenia. Ponadto tokoferole magazynowane są również przez tkankę mięśniową i tłuszczową. We krwi α-tokoferol transportowany jest przez lipoproteiny LDL, a tokotrienole przez VLDL. Źródła witaminy: pokarmy pochodzenia zwierzęcego (mięso, jaja, wątroba, ryby, drób) i roślinnego (kiełkujące ziarna zbóż, oleje roślinne). Funkcje: antyoksydacyjna, stabilizacja błon komórkowych i lizosomalnych, nasilanie odpowiedzi immunologicznej. Dobowe zapotrzebowanie: mg. Przyczyny niedoboru: zespoły złego wchłaniania, niedobór w diecie. Skutki niedoboru: u wcześniaków niedokrwistość hemolityczna, zwyrodnienie rdzeniowomózgowe; u dorosłych obwodowa neuropatia, ataksja, oczopląs, osłabienie mięśni. 289

6 Witamina K Rysunek Filochinon Naturalna witamina K jest związkiem dwupierścieniowym, z których jeden jest pierścieniem aromatycznym, a drugi chinonowym z kilkoma podstawnikami. Główny z podstawników jest łańcuchem poliizoprenoidowym. Naturalne witaminy K to: filochinon (K 1 ) oraz menachinon (K 2 ). Filochinon jest pochodzenia roślinnego, natomiast menachinon wytwarzany jest przez florę bakteryjną jelita cienkiego. Ponadto występują także formy syntetyczne witaminy K: menadiol oraz dioctan menadiolu, które mogą ulec przemianie do filochinonu. Źródła witaminy: pokarmy pochodzenia roślinnego (rośliny zielonolistne) i zwierzęcego (wątroba, jaja); flora bakteryjna przewodu pokarmowego. Funkcje: uczestniczy w γ-karboksylacji reszt glutaminanu w trakcie potranslacyjnej modyfikacji protrombiny oraz innych osoczowych czynników krzepnięcia: VII, IX, X, uczestniczy w γ-karboksylacji reszt glutaminanu w osteokalcynie, osteopontynie i osteonektynie, uczestniczy w procesach glikozylacji. Dobowe zapotrzebowanie: 0,05-1 mg. Przyczyny niedoboru: u noworodków słabe przechodzenie witaminy K przez łożysko, brak flory bakteryjnej jelita; u dorosłych zespoły złego wchłaniania, leki hamujące wchłanianie witaminy K (np. związki kumarolowe, salicylany, sulfonamidy), u chorych po długotrwałej antybiotykoterapii, cholestaza. Skutki niedoboru: skaza krwotoczna. Witamina F (wielonienasycone kwasy tłuszczowe) Kwas linolowy, kwas linolenowy oraz kwas arachidonowy zaliczane są do tzw. niezbędnych kwasów tłuszczowych. Szczególnie ważne jest, aby w diecie dostarczane były wielonienasycone kwasy omega

7 Funkcje: wchodzą w skład struktur komórkowych, wywierają hamujący wpływ na syntezę cholesterolu i VLDL, kwasy ω-3 wykazują działanie przeciwmiażdżycowe. Przyczyny niedoboru: stosowanie diety beztłuszczowej. Skutki niedoboru: zahamowanie wzrostu u dzieci, suchość i szorstkość skóry, zaburzenia neurologiczne. Witaminy rozpuszczalne w wodzie Jest to największa grupa witamin. Jako substancje rozpuszczalne w wodzie, są one łatwo wchłaniane w jelicie i wydalane przez nerki. Powoduje to, że witaminy rozpuszczalne w wodzie nie kumulują się w organizmie i najczęściej nie powodują skutków toksycznych. Witamina B 1 (tiamina) Rysunek 10.6.Tiamina Tiamina zbudowana jest z pierścieni pirymidynowego i tiazolowego, połączonych mostkiem metylenowym. Tiamina ulegając fosforylacji tworzy pirofosforan tiaminy (kokarboksylaza, TPP), który jest aktywną formą witaminy B 1. Źródła witaminy: pokarmy pochodzenia roślinnego (głównie niełuszczone ziarna zbóż) i zwierzęcego (wątroba, wieprzowina, nerki); flora bakteryjna przewodu pokarmowego. Funkcje: jest koenzymem enzymów: dehydrogenazy pirogronianowej, dehydrogenazy α-ketoglutarowej, dehydrogenazy ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, transketolazy, udział w przewodnictwie impulsów nerwowych. Dobowe zapotrzebowanie: 1,5-2 mg. Przyczyny niedoboru: alkoholizm, zespoły złego wchłaniania, obecność tiaminazy w diecie. Skutki niedoboru: choroba beri-beri, psychoza Korsakowa, kwasica mleczanowa. 291

8 Witamina B 2 (ryboflawina) Rysunek Ryboflawina Ryboflawina jest zbudowana z pierścienia dimetyloizoalloksazyny połączonego z rybitolem. Jest źródłem koenzymów: FMN, FAD. FMN powstaje w wyniku reakcji fosforylacji ryboflawiny z udziałem ATP, natomiast dalsza fosforylacja prowadzi do uzyskania FAD. FMN i FAD są grupami prostetycznymi flawoprotein, pełniących funkcję enzymów oksydoredukcyjnych. Witamina B 2 jest odporna na działanie wysokiej temperatury oraz utlenianie, natomiast jest inaktywowana pod wpływem światła widzialnego. Źródła witaminy: pokarmy pochodzenia roślinnego (świeże jarzyny, kiełkujące ziarna zbóż) i zwierzęcego (mleko, wątroba, nerki), drożdże. Funkcje: jest koenzymem enzymów oksydo-redukcyjnych w łańcuchu oddechowym, utlenianiu kwasów tłuszczowych i aminokwasów, cyklu Krebsa. Dobowe zapotrzebowanie: 1,7-3 mg. Przyczyny niedoboru: braki w diecie, fototerapia noworodków. Skutki niedoboru: triada objawów ze strony jamy ustnej, oczu i narządów płciowych; łojotokowe zmiany skóry, niedokrwistość normocytowa. Witamina B 6 (pirydoksyna) Rysunek Pirydoksal 292

9 Pochodna pirydyny z jednym atomem azotu w pierścieniu. Aktywność witaminy B 6 wykazują pirydoksyna, pirydoksal, pirydoksamina oraz ich 5 -fosforany. Fosforan pirydoksalu zgromadzony w mięśniach stanowi 80% witaminy B 6 w ustroju. W stanach wygłodzenia, fosforan pirydoksalu jest uwalniany z mięśni. Uwolniona witamina jest zużywana w procesach glukoneogenezy. Źródła witaminy: pokarm pochodzenia roślinnego (ziarna zbóż, zielone warzywa) i zwierzęcego (mleko, wątroba, jaja); drożdże. Funkcje: jest grupą prostetyczną enzymów: dekarboksylaz, deaminaz, aminotransferaz, desulfhydraz, enzymów transsulfuracji i transmetylacji oraz kinureninazy, uczestniczy w przemianach aminokwasowych, uczestniczy w biosyntezie: sfingozyny, porfiryn, neuroprzekaźników, DNA. Dobowe zapotrzebowanie: 2-3 mg. Przyczyny niedoboru: niedostateczna podaż w diecie, zespoły złego wchłaniania, wiązanie lub inaktywacja witaminy przez leki (np. penicylamina). Skutki niedoboru: Łojotokowe zapalenie skóry, zapalenie jamy ustnej, niedokrwistość mikrocytarna lub megaloblastyczna, zaburzenia OUN. Skutki nadmiaru: długotrwałe przyjmowanie wysokich dawek prowadzi do neuropatii obwodowej. Witamina B 12 (kobalamina) Rysunek Kobalamina 293

10 Jest zaliczana do porfiryn. Zbudowana jest z pierścienia tetrapirolowego (korynowego) z centralnie usytuowanym atomem kobaltu, który może tworzyć sześć wiązań koordynacyjnych z ligandami. Szósta pozycja atomu kobaltu może łączyć się z jedną z następujących grup funkcyjnych: CN - tworząc cyjanokobalaminę, OH - tworząc hydroksykobalaminę, CH 3 tworząc metylokobalaminę, 5-deoksyadenozyną tworząc adenozylokobalaminę, H 2 O tworząc akwakobalaminę. Witamina B 12 jest wchłaniana z przewodu pokarmowego w połączeniu z czynnikiem wewnętrznym Castle a (wytwarzanym przez komórki okładzinowe błony śluzowej żołądka). Czynnik Castle a wiąże jedynie aktywne formy kobalaminy. Źródła witaminy: pokarm pochodzenia zwierzęcego (wątroba, nerki, mięso, mleko, jaja), flora bakteryjna przewodu pokarmowego. Funkcje: jest koenzymem enzymów: mutazy metylomalonylo-coa, aminomutazy leucynowej, syntazy metioninowej. Dobowe zapotrzebowanie: 0,003-5 mg. Przyczyny niedoboru: niedostateczna podaż, niedobór lub upośledzenie wydzielania czynnika wewnętrznego Castle a, resekcja żołądka. Skutki niedoboru: zmiany w układzie nerwowym (zaburzenia psychiczne, zaburzenia czucia), niedokrwistość megalocytarna, hipersegmentacja granulocytów, hiperbilirubinemia, niedokrwistość złośliwa, zanik nabłonka wydzielniczego żołądka i jelit, zapalenie języka. Kwas foliowy Rysunek Kwas foliowy Zbudowany jest z pterydyny i kwasu p-aminobenzoesowego oraz od 1 do 7 reszt glutaminianu. Aktywną formą kwasu foliowego jest tetrahydrofolian (THF). W pożywieniu 294

11 występuje forma kwasu foliowego bogata w reszty glutaminowe, które hydrolizowane są w przewodzie pokarmowym. W wyniku hydrolizy powstaje produkt, który jest przekształcany do THF przy udziale reduktazy folianowej. Źródła witaminy: pokarm pochodzenia roślinnego (jarzyny zielonolistne) i zwierzęcego (wątroba, nerki), drożdże, grzyby, flora bakteryjna przewodu pokarmowego. Funkcje: przenoszenie rodników jednowęglowych, synteza puryn i pirymidyn, przemiany aminokwasów i fosfolipidów, synteza formylometionylo-trna. Dobowe zapotrzebowanie: 0,3-0,4 mg. Przyczyny niedoboru: niedostateczna podaż, zespoły złego wchłaniania, zwiększone zapotrzebowanie (np. w ciąży), podawanie antagonistów kwasu foliowego (np. metotreksat), zwiększony metabolizm kwasu foliowego. Skutki niedoboru: niedokrwistość makrocytarna, nadbarwliwa; nadmierna segmentacja granulocytów, megaloblastoza w szpiku; wady cewy nerwowej u płodu. Witamina C (kwas askorbinowy) Rysunek Kwas askorbinowy Witamina C jest γ-laktonem kwasu 2,3-okso-L-gulonowego. Jest związkiem nietrwałym, wrażliwym na działanie wysokiej temperatury i zasad. Źródła witaminy: pokarmy pochodzenia roślinnego (świeże owoce, jarzyny) i zwierzęcego (wątroba, nerki, mleko). Funkcje: jest niezbędnym składnikiem w biosyntezie kości, chrząstek i substancji międzykomórkowej tkanki łącznej. Uczestniczy w biosyntezie kolagenu (hydroksylacji proliny i lizyny), 295

12 uczestniczy w procesach hydroksylacji steroidów nadnerczowych, udział w przemianach tyrozyny (niezbędna do prawidłowego funkcjonowania β-hydroksylazy dopaminowej), niezbędna do prawidłowego funkcjonowania hydroksylazy peptydyloglicynowej, udział w procesach hydroksylacji związków aromatycznych w mikrosomach, zachowanie prawidłowego potencjału oksydacyjno-redukcyjnego w komórce, ułatwienie wchłaniania wapnia, działanie antyoksydacyjne. Dobowe zapotrzebowanie: mg. Przyczyny niedoboru: niedobór w diecie, alkoholizm. Skutki niedoboru: szkorbut, upośledzenie gojenia się ran, kruchość naczyń włosowatych; u dzieci choroba Moellera-Barlowa; u dorosłych ogólne osłabienie, senność, brak łaknienia, bóle typu gośćcowego. Niacyna (witamina PP) Rysunek Kwas nikotynowy i amid kwasu nikotynowego. Niacyna jest kwasem nikotynowym, bądź jego amidem. Nie jest ona typową witaminą, ponieważ może być wytwarzana w organizmie człowieka w reakcjach przemian tryptofanu. Jednak endogenna niacyna nie zaspokaja dobowego zapotrzebowania, dlatego niezbędna jest jej suplementacja. Pokarm dostarczany z dietą zawiera niacynę w formie NAD + i NADP +. W przewodzie pokarmowym NAD + i NADP + są hydrolizowane do wolnej niacyny lub niacynamidu. W tej postaci są wychwytywane w jelicie cienkim i dostarczane do tkanek. W tkankach wolne formy witaminy są ponownie wbudowywane do NAD + i NADP +. Źródła witaminy: pokarm pochodzenia roślinnego i zwierzęcego, drożdże, synteza z tryptofanu. Funkcje: 296

13 jest składnikiem koenzymów NAD + i NADP +, uczestniczących w reakcjach utleniania i redukcji, NAD + i NADP + biorą udział w przemianach: białek, węglowodanów, lipidów, zasad azotowych, porfiryn. Ponadto uczestniczą w tworzeniu wiązań wysokoenergetycznych. Dobowe zapotrzebowanie: mg. Przyczyny niedoboru: niedobór w diecie, marskość wątroby, zespoły złego wchłaniania, cukrzyca, zwiększone zapotrzebowanie na witaminę PP (przewlekłe choroby zakaźne, stosowanie antymetabolitów witaminy PP np. hydrazyd kwasu izonikotynowego), choroba Hartnupów, rakowiak. Skutki niedoboru: pelagra (brak łaknienia, osłabienie, zmiany skórne, zaburzenia ze strony układu pokarmowego i ośrodkowego układu nerwowego). Biotyna (witamina H) Rysunek Biotyna Biotyna zbudowana jest z pierścieni imidazolowego i tiofenowego połączonego z pięciowęglowym łańcuchem bocznym zakończonym grupą karboksylową. Źródła witaminy: pokarmy pochodzenia roślinnego (pomidory) i zwierzęcego (wątroba, nerki, żółtka jaj), drożdże, flora bakteryjna przewodu pokarmowego. Funkcje: uczestniczy w przenoszeniu grup COO - w reakcjach karboksylacji, stanowiąc grupę prostetyczną enzymów: karboksylazy acetylo-coa, karboksylazy pirogronianowej, karboksylazy propionylo-coa, uczestniczy w regulacji cyklu komórkowego, poprzez stymulację białek w jądrze komórkowym. Dobowe zapotrzebowanie: 0,015-0,3 mg. Przyczyny niedoboru: długotrwała antybiotykoterapia powodująca wyjałowienie przewodu pokarmowego, spożywanie dużej ilości surowego białka jaj. 297

14 Skutki niedoboru: zmiany skórne, bóle mięśniowe, ogólne wyczerpanie organizmu, stany depresyjne, senność. Kwas pantotenowy Rysunek Kwas pantotenowy Kwas pantotenowy zbudowany jest z β-alaniny i reszty kwasu pantoinowego. Źródła witaminy: pokarmy pochodzenia zwierzęcego (wątroba, nerki, żółtka jaj), drożdże. Funkcje: jest substratem do biosyntezy acetylo-coa oraz białka przenoszącego reszty acylowe ACP. Koenzym A i ACP uczestniczą w reakcjach biosyntezy kwasów tłuszczowych. Nie obserwuje się niedoboru kwasu pantotenowego. Kwas liponowy Funkcje: bierze udział w procesie dekarboksylacji kwasu pirogronowego i α-ketoglutarowego. Nie obserwuje się niedoboru kwasu liponowego. Diagnostyka laboratoryjna gospodarki witaminowej Diagnostyka gospodarki witaminowej jest trudna i kosztowna. Witaminy w organizmie występują w stężeniach mili- lub mikrogramowych, dlatego też metody stosowane do ich badania muszą charakteryzować się wysoką czułością i dużą precyzją. Najczęściej stosowane do oznaczania stężenia witamin i ich metabolitów są metody: radioimmunologiczne, chemiluminescencyjne, fluorymetryczne, chromatograficzne, głównie wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), spektrofotometryczne. Diagnostyka gospodarki witaminowej obejmuje: oznaczanie stężenia witamin we krwi, oznaczanie stężenia witamin w moczu, oznaczanie stężenia metabolitów powstających w procesach, w których biorą udział witaminy, 298

15 testy dynamiczne po obciążeniu określoną witaminą bądź jej prekursorem, testy obciążeniowe po obciążeniu związkiem, który metabolizuje się przy udziale witaminy. Największe znaczenie diagnostyczne ma oznaczanie stężenia witaminy B 12, kwasu foliowego oraz metabolitów witaminy D. Oznaczenia poziomu witaminy B 12 i kwasu foliowego wykonuje się głównie ze względu na częsty niedobór tych witamin prowadzący m.in. do niedokrwistości, a przy dłużej trwającym niedoborze także do zmian neurologicznych. Szczególnie często niedobór B 12 występuje u osób starszych, u których jest najczęstszą przyczyną niedokrwistości. Natomiast poziom metabolitów witaminy D oznacza się głównie w ramach diagnostyki osteoporozy i zaburzeń kostnych. WITAMINA B 6 Diagnoza niedoboru witaminy B 6 zwykle opiera się na badaniu poziomu fosforanu pirydoksalu w osoczu krwi. Prawidłowe stężenie fosforanu pirydoksalu wynosi nmol/l. Test ksanturenowy Fosforan pirydoksalu jest koenzymem kinureninazy, enzymu biorącego udział w katabolizmie tryptofanu. Kinureninaza katalizuje przemianę 3-L-hydroksykinureniny do hydroksyantranilanu. W stanach niedoboru witaminy B 6 dochodzi do zaburzenia tej przemiany, w wyniku czego gromadząca się 3-L-hydroksykinurenina przekształcana jest do kwasu ksanturenowego wydalanego z moczem. Wykonanie testu Pacjentowi podaje się 10 g tryptofanu rozpuszczonego w 250 ml wody lub soku. Następnie przeprowadza się dobową zbiórkę moczu. W dobowej zbiórce oznacza się stężenie kwasu ksanturenowego metodą spektrofotometryczną z wykorzystaniem siarczanu żelazowoamonowego. Kwas ksanturenowy z żelazem tworzy zielony kompleks. Interpretacja wyniku W warunkach prawidłowych kwas ksanturenowy nie powstaje lub powstaje w bardzo niewielkich ilościach. Po obciążeniu tryptofanem dobowe wydalanie kwasu ksanturenowego u osób zdrowych może wynosić około 20 mg/dobę. Stężenie kwasu powyżej 50 mg/dobę świadczy o niedoborze fosforanu pirydoksalu. Należy jednak zwrócić uwagę, że test jest mało swoisty, dlatego też prawidłowe ilości kwasu ksanturenowego w moczu nie świadczą o prawidłowej zawartości witaminy B 6 w organizmie. 299

16 WITAMINA B 12 Standardowym badaniem, mającym na celu potwierdzenie podejrzenia niedoboru witaminy B 12 jest oznaczenie stężenia B 12 w surowicy krwi. Oznaczenie przeprowadza się najczęściej metodami chemiluminescencyjnymi lub radioimmunologicznymi. Zakres wartości referencyjnych: niedobór witaminy B12 <150 pmol/l stężenie graniczne pmol/l prawidłowe stężenie >300 pmol/l Kwas metylomalonowy (MMA) Stężenie kwasu metylomalonowego (MMA) jest czułym i wczesnym wskaźnikiem niedoboru witaminy B 12. Metylomalonylo-CoA jest wytwarzany w niewielkich ilościach w trakcie metabolizmu aminokwasów oraz nieparzystowęglowych kwasów tłuszczowych. Witamina B 12 jest koenzymem mutazy metylomalonylowej katalizującej konwersję metylomalonylo-coa w bursztynylo-coa. W przypadku niedoboru kobalaminy stężenie metylomalonylo-coa zaczyna wzrastać, a organizm zaczyna przekształcać go w MMA. Powoduje to wzrost stężenia MMA we krwi i moczu. Rysunek Powstawanie kwasu metylomalonowego w niedoborze witaminy B

17 Wykonanie testu Podczas testu pacjentowi podaje się prekursor kwasu metylomalonowego, najczęściej walinę lub metioninę. Następnie oznacza się stężenie MMA w dobowej zbiórce moczu metodą kolorymetryczną lub chromatograficzną. Interpretacja wyniku Prawidłowe wydalanie MMA wynosi 0-11 mg/dobę i nie ulega zmianie po obciążeniu prekursorem. U osób z niedoborem witaminy B 12 dobowe wydalanie MMA wzrasta do mg/dobę natomiast po obciążeniu prekursorem osiąga wartość powyżej 1000 mg/dobę. Zastosowanie testu ma pewne ograniczenia. U części pacjentów z niewyrównaną chorobą Addisona-Biermera obserwuje się wzrost wydalania MMA dopiero po obciążeniu pacjenta prekursorem. Natomiast u chorych po całkowitej remisji choroby Addisona-Biermera, z marskością wątroby oraz osób z obniżoną ilością czynnika Castle a nie następuje wzrost wydalania MMA nawet po obciążeniu. Test jest jednak istotny w diagnostyce niedokrwistości megaloblastycznych. Test Schillinga Test Schillinga jest pośrednią metodą oceny wchłaniania witaminy B 12 na podstawie pomiaru jej wydalania z moczem. Wykonuje się go w celu określenia przyczyny niedoboru witaminy B12. Wykonanie testu Badanie przeprowadza się na czczo. Po opróżnieniu pęcherza moczowego pacjentowi podaje się doustnie 1 µg znakowanej promieniotwórczym izotopem kobaltu witaminy B 12. Następnie po 2 godzinach wstrzykuje się domięśniowo preparat zawierający 1000 µg tej witaminy, ale zawierającej kobalt niepromieniotwórczy. Następnie przeprowadza się dobową zbiórkę moczu i dokonuje się pomiaru radioaktywności moczu będącej miarą wydalania znakowanej witaminy B 12. Drugą fazę testu wykonuje się tylko u pacjentów, u których w pierwszej części wykryto zaburzone wchłanianie witaminy. U pacjentów z prawidłowym wchłanianiem odstępuje się od wykonania drugiej części testu. W drugiej fazie testu, po upływie około 5 dni, znakowaną witaminę B 12 podaje się łącznie z 60 mg świńskiego czynnika wewnętrznego (IF). Interpretacja wyniku W warunkach prawidłowych wydalone z moczem zostaje więcej niż 10% podanej dawki znakowanej witaminy B 12. Zmniejszone wydalanie znakowanej witaminy B 12, poniżej 5%, 301

18 wskazuje na jej upośledzone wchłanianie w przewodzie pokarmowym. Jeżeli wynik ulega normalizacji po podaniu znakowanej witaminy B 12 związanej z czynnikiem wewnętrznym, wskazuje to na utratę aktywności czynnika wewnętrznego. Brak wchłaniania znakowanej witaminy B 12 związanej z czynnikiem wewnętrznym może być wynikiem: polekowego złego wchłaniania witaminy B 12, niewydolności trzustki, zespołu Zollingera-Ellisona, nieprawidłowej jelitowej flory bakteryjnej. Oznaczanie przeciwciał przeciwko IF w surowicy krwi Niedokrwistość Addisona-Biermera (niedokrwistość złośliwa) jest chorobą u podstaw której leży zanikowe zapalenie błony śluzowej żołądka o charakterze autoimmunologicznym. Prowadzi ono do upośledzenia wydzielania czynnika wewnętrznego a w konsekwencji niedoboru witaminy B12 i związanych z tym objawów klinicznych. U około 60% chorych stwierdza się obecność przeciwciał przeciwko czynnikowi wewnętrznemu Castle a. Metody oznaczania przeciwciał: immunoenzymatyczne radioimmunologiczne Oznaczenie holotranskobalaminy Nową metodą stosowaną w diagnostyce gospodarki witaminowej jest oznaczanie stężenia holotranskobalaminy (holotc). Witamina B 12 w surowicy związana jest z dwoma białkami: transkobalaminą (TC) oraz haptokoryną (HC). Kompleks transkobalamina-kobalamina zwany holotranskobalaminą rozpoznawany jest przez receptory tkankowe i jest jedynym rezerwuarem zawierającym witaminę B 12 w formie dostępnej biologicznie. Oznaczenie stężenia holotc przeprowadza się głównie w przypadkach stężenia witaminy B 12 na poziomie pmol/l. Prawidłowe stężenie holotc w surowicy wynosi >35 pmol/l, wartości niższe świadczą o niedoborze witaminy B 12. KWAS FOLIOWY Podstawowym badaniem diagnostycznym jest oznaczenie stężenia kwasu foliowego w surowicy krwi metodami immunologicznymi. Prawidłowe stężenie tej witaminy wynosi 5,7-38 nmol/l. 302

19 Test FIGLU Kwas formiminoglutaminowy (FIGLU) jest produktem pośrednim w procesie przemiany histydyny do kwasu glutaminowego. Przeniesienie grupy formiminowej z FIGLU na tetrahydrofolian przy udziale enzymu formiminotransferazy prowadzi do utworzenia glutaminianu. W stanach niedoboru kwasu foliowego reakcja ta jest zahamowana a FIGLU wydalany jest z moczem. Test FIGLU wykorzystywany jest w diagnostyce niedoboru kwasu foliowego, witaminy B 12 oraz chorób miąższu wątroby. Wykonanie testu Badanie przeprowadza się na czczo. Pacjentowi podaje się 15 g chlorowodorku L-histydyny rozpuszczonej w wodzie a następnie przeprowadza się 5 godzinną zbiórkę moczu pomiędzy 3 a 8 godziną od podania roztworu. W zebranym moczu oznacza się stężenie FIGLU metodami spektrofotometrycznymi, chromatograficznymi lub elektroforetycznymi. Interpretacja wyniku Zdrowi pacjenci wydalają z moczem niewielkie ilości FIGLU do 2 mg/h. U osób z niedoborem kwasu foliowego lub witaminy B 12 stężenie FIGLU w moczu może wzrosnąć nawet do 80 mg/h. WITAMINA D Diagnostyka niedoborów witaminy D opiera się na oznaczeniu stężenia jej metabolitów: 25-hydroksycholekalcyferolu (25-OH-D 3 ) oraz 1,25-dihydroksycholekalcyferolu (1,25- (OH) 2 -D 3 ). Nigdy nie oznacza się tylko 1,25-(OH) 2 -D 3 ponieważ jej niedobór może być kompensowany przez zachodzącą w nerkach 1α-hydroksylację. Stężenie metabolitu 1,25- (OH) 2 -D 3 odzwierciedla więc aktywność 1α-hydroksylazy, a obniża się w ciężkich niedoborach substratu (witaminy) lub uszkodzeniu nerek. Stężenie 25-OH-D 3 i 1,25-(OH) 2 -D 3 oznacza się w surowicy krwi pobranej od pacjenta będącego na czczo. Oznaczenie wykonuje się metodami radioimmunologicznymi. Prawidłowe stężenie 25-OH-D 3 mieści się w zakresie ng/ml, natomiast 1,25-(OH) 2 -D pg/ml. Wartości referencyjne zależą od zastosowanej metody, dlatego należy uwzględnić te ustalone przez laboratorium. Obniżone stężenie witaminy 25-OH-D 3 obserwuje się u osób starszych, nie wychodzących z domu na skutek ograniczonej ekspozycji na światło słoneczne oraz u osób niedożywionych lub z upośledzonym wchłanianiem. Ponadto zwiększone zapotrzebowanie na witaminę 25- OH-D 3 występuje u dzieci oraz kobiet w ciąży, a także w stanach wyniszczenia organizmu. 303

20 Zwiększony metabolizm witaminy 25-OH-D 3 obserwuje się także w trakcie zażywania leków przeciwpadaczkowych oraz w pierwotnej nadczynności przytarczyc. Podwyższone stężenie 25-OH-D 3 występuje po przedawkowaniu witaminy, a także po intensywnej ekspozycji na światło UV oraz u chorych leczonych dużymi dawkami heparyny. 304

21 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA ĆWICZENIE 1 WYKRYWANIE WITAMINY A METODĄ CARRA-PRICE A ZASADA METODY Witamina A i karotenoidy dają niebieskie zabarwienie z nasyconym roztworem trójchlorku antymonu. Witaminę A z materiału biologicznego ekstrahujemy za pomocą chloroformu. Ekstrakt chloroformowy służyć może nie tylko do wykrywania, ale również do ilościowego oznaczania witaminy A, poprzez pomiar absorbancji produktu reakcji z SbCl 3 ODCZYNNIKI Nasycony roztwór trichlorku antymonu w chloroformie (odczynnik Carra-Price`a) WYKONANIE Do suchej probówki wlać około 2 ml odczynnika Carra-Price`a i dodać 1 kroplę witaminy A. Do odczynnika Carra-Price`a używać wyłącznie suchej pipety lub wlać odczynnik bezpośrednio z butelki (woda powoduje hydrolizę soli antymonu i wytrącanie się białego osadu tlenosoli SbO 2 Cl). ĆWICZENIE 2 WYKRYWANIE WITAMINY B 1 ZASADA METODY Witamina B 1 jest wrażliwa na działanie czynników utleniających, np. żelazicyjanku potasu czy nadtlenku wodoru. Przekształca się ona wówczas w tiochrom, charakteryzujący się niebieską fluorescencją. ODCZYNNIKI 1% wodny roztwór K 3 [Fe(CN) 6 ] 20% wodny roztwór NaOH Rozpuszczalnik organiczny: butanol lub alkohol amylowy WYKONANIE Pół tabletki witaminy B 1 rozpuścić w około 10 ml wody destylowanej, dodać po 1 ml roztworu K 3 [Fe(CN) 6 ] i NaOH. Po wymieszaniu odczekać kilka minut i dodać około 5 ml 285