Analiza polimorfizmu genu prolaktyny (PRL) i genu receptora prolaktyny (PRLR)

Transkrypt

1 Mazurowski Artur, Mroczkowski Sławomir. Analiza polimorfizmu genu prolaktyny (PRL) i genu receptora prolaktyny (PRLR) = Analysis of prolactin (PRL) and prolactin receptor (PRLR) genes polymorphism. Journal of Health Sciences. 2014;4(9): ISSN / X. Analiza polimorfizmu genu prolaktyny (PRL) i genu receptora prolaktyny (PRLR) Analysis of prolactin (PRL) and prolactin receptor (PRLR) genes polymorphism Artur Mazurowski, Sławomir Mroczkowski Zakład Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Technologiczno- Przyrodniczy im. Jana i Jędrzeja Śniadeckich w Bydgoszczy Streszczenie W przypadku trzody chlewnej gen prolaktyny (PRL) zlokalizowany jest na chromosomie siódmym, natomiast gen receptora prolaktyny (PRLR) na chromosomie szesnastym. Są to geny głównie zaangażowane w procesy reprodukcyjne. Celem przeprowadzonych analiz była identyfikacja polimorfizmu genu prolaktyny oraz genu receptora prolaktyny. Badaniem objęto 150 loch rasy wielka biała polska. Analizy molekularne przeprowadzono za pomocą metody PCR RFLP. Słowa kluczowe: gen prolaktyny, gen receptora prolaktyny, polimorfizm, lochy Summary In the case of swine, prolactin gene (PRL) is located on chromosome seven, while the prolactin receptor gene (PRLR) on chromosome sixteenth. These are genes mainly involved in the reproductive process. The aim of the analysis was the identification of prolactin and prolactin receptor genes polymorphism. The study included 150 Polish Large White sows. Molecular analysis was carried out by PCR - RFLP. Keywords: prolactin gene, prolactin receptor gene, polymorphism, sows WSTĘP Mutacje genowe mogą wywierać istotny wpływ na efektywność rozrodu, co wpływa znacząco na hodowlę zwierząt gospodarskich [1]. Wśród wielu genów, których polimorficzne formy wykazują związek z cechami rozrodczymi, znajdują się gen prolaktyny (PRL) [1, 2, 15] i jego receptor (PRLR) [3, 14, 18, 22]. Zaburzenia lub ich całkowita dysfunkcja może doprowadzić do spadku wskaźników cech związanych z rozrodem, a co za tym idzie do strat ekonomicznych wśród hodowców trzody chlewnej. Dlatego też bardzo ważne są badania na poziomie molekularnym, które umożliwiają dobór zwierząt do rozrodu nie obciążonych genetycznie [1]. Prolaktyna jest jednym z wielu niezbędnych hormonów, które wywierają wpływ na cechy związane z rozrodem, takie jak wielkość miotu, przeżywalność prosiąt, laktacja czy też instynkt macierzyński [7]. Prolaktyna wywiera wpływ na wzrost i rozwój gruczołu mlekowego oraz laktopoezę i laktogenezę [6]. Prolaktyna podwyższa syntezę najważniejszych białek w mleku, koordynuje aktywność enzymów które 61

2 syntetyzują lipidy oraz bierze udział w stymulacji syntezy laktozy [8]. Wyrzuty prolaktyny, które przebiegają cyklicznie, pozytywnie wpływają na rozwój ciałek żółtych oraz ich przemianę w ciałka ciążowe. Mają także istotne znaczenie w regresji tych ciałek z poprzedniego cyklu. Wpływ hormonu na ciałko żółte obserwuje się we wczesnej fazie lutealnej cyklu rujowego oraz w drugiej połowie ciąży. Ponadto prolaktyna stymuluje wytwarzanie progesteronu [8]. Prolaktyna syntetyzowana jest przez komórki laktotropowe w przednim płacie przysadki mózgowej. Zlokalizowana została także w macicy, grasicy i tkankach układu immunologicznego. Jej obecność wykazano również w płynach ustrojowych, między innymi w mleku, pocie i łzach [8, 11, 13]. W przypadku trzody chlewnej jak i w przypadku ludzi hormon ten zbudowany jest z 199 aminokwasów z trzema mostkami disiarczkowymi znajdującymi się między sześcioma cysternami [6, 8, 10, 17]. Hormon ten ma aktywną postać dopiero po utworzeniu kompleksu receptor hormon receptor (po połączeniu z jednym receptorem nie jest aktywny) [21]. Gen PRL kodujący peptydowy hormon prolaktynę u świni domowej został zlokalizowany w chromosomie siódmym [15]. Receptor prolaktyny u ssaków, między innymi u świni domowej został wykryty w różnych tkankach, a mianowicie w mózgu, macicy, jajnikach oraz łożysku. Receptor ten jest białkiem międzybłonowym zaliczanym do rodziny receptorów cytokinowych klasy I, wykazuje duże podobieństwo do receptora hormonu wzrostu (GHR) [11, 12]. Sus scrofa domestica L. w gruczole mlekowym posiada dwie formy receptorowe, długą oraz krótką; długa zbudowana jest z 592 aminokwasów, krótka natomiast w swej budowie liczy 291 aminokwasów [4, 16]. Po wieloletnich badaniach PRLR został uznany jako kandydat, zaliczany do puli genów odpowiedzialnych za cechy zwiane z rozrodem, ze względu jego wiele oddziaływań na organizm samicy [15, 23]. Zauważono także, że zwierzęta które posiadają zablokowane formy PRLR nie wykazują dostatecznej matczynej opieki nad swym potomstwem [9]. Gen receptora prolaktyny (PRLR) zlokalizowany jest w chromosomie szesnastym w pozycji q 1.4 lub q [18, 20]. MATERIAŁ i METODY Materiał badawczy stanowiło 150 loch rasy wielka biała polska (wbp), pochodzących z czterech stad objętych kontrolą Polskiego Związku Hodowców i Producentów Trzody Chlewnej POLSUS regionu kujawsko pomorskiego. Lochy, stanowiące przedmiot badań utrzymywane były w zbliżonych warunkach środowiskowych (utrzymanie grupowe), znajdowały się w tym samym stanie fizjologicznym (wieloródki) i nie były ze sobą spokrewnione. Testy genetyczne przeprowadzono na wyizolowanym z krwi obwodowej DNA, według procedury Master Pure DNA Purification Kit frimy Epicentre Technologies. Genotypy pod względem genu prolaktyny (PRL) i genu receptora prolaktyny (PRLR) określono metodą PCR RFLP. Fragment genu PRL o długości 298 par zasad zamplifikowano według metodyki Babicz i wsp. (2008) [2], a fragment genu PRLR o długości 163 par zasad według metodyki Drogemuller i wsp. (2001) [5]. Długości fragmentów restrykcyjnych genów PRL i PRLR określających odpowiednie genotypy identyfikowano wobec markera molekularnego pbr322 dla genu PRL, oraz markera puc19 dla genu PRLR (Tab.1). Na podstawie uzyskanych wyników badań określono strukturę genetyczną analizowanych grup loch dla badanych miejsc restrykcyjnych zgodnie z regułą Hardy ego-weinberga. Do weryfikacji zgodności rozkładu frekwencji genotypów wykonano test chi 2 [19]. Tabela 1. Identyfikacja polimorfizmu w loci PRL i PRLR. 62

3 Gen Genotyp Długość fragmentów restrykcyjnych [pz] Del/Del 287; 11 PRL Ins/Ins 212; 86 Ins/Del 287; 212; 86;11 A/A 85; 59; 19 PRLR B/B 104; 59 A/B 104; 85; 59; 19 Na rycinie nr 1 przedstawiono zdjęcie z transiluminatora po trawieniu produktu PCR genu prolaktyny enzymem restrykcyjnym TaaI. Rycina nr 2 obrazuje polimorfizm genu receptora prolaktyny, gdzie produkt PCR został strawiony enzymem restrykcyjnym AluI. Rycina 1. Rycina 2. (M marker molekularny pbr322; (M marker molekularny puc19 genotypy Del/Del, Ins/Ins, Ins/Del). genotypy PRLR/ AA, AB, BB). WYNIKI I DYSKUSJA W badanej grupie loch rasy wielka biała polska zidentyfikowano po dwa allele genu PRL (Ins, Del) i genu PRLR (A, B), oraz trzy genotypy genu prolaktyny (Del/Del, Ins/Del, Ins/Ins) i trzy genotypy genu receptora prolaktyny (AA, AB, BB). Frekwencja alleli genu prolaktyny kształtowała się na poziomie: Ins 0,58 i Del 0,42. Ziółkowska i wsp. (2010) prowadząc badania w obrębie ras wbp i pbz otrzymali następujące wyniki: wśród rasy wbp rozkład alleli wynosił (Del 0,42) oraz (Ins 0,58), natomiast w obrębie rasy pbz frekwencja dla allelu Del wynosiła 0,63 oraz 0,37 dla allelu Ins [24]. W niniejszej pracy częstość występowania genotypu Ins/Del była największa wynosiła 0,46, natomiast dla pozostałych genotypów była zbliżona Del/Del 0,25 i Ins/Del 0,29 (Tab. 2). Babicz i wsp. (2008) w swych badaniach wykazali wśród osobników rasy puławskiej największy udział homozygot Del/Del (frekwencja 0,54) [2]. W przypadku genu receptora prolaktyny frekwencja allela B wynosiła 0,57 i przewyższała udział allela A którego frekwencja wynosiła 0,43 (Tab. 2). Podobne wyniki uzyskali Barreras Serrano i wspł. (2009) prowadząc badania w grupie czterech ras świń, gdzie frekwencja alleli kształtowała się na poziomie A - 0,46 oraz B 0,54 [3]. W badanej grupie loch genotypy były w niewielkim stopniu zróżnicowane pod względem genu PRLR. Genotyp PRLR/BB występował z największą częstością (frekwencja 0,41), nieco niższą frekwencję zaobserwowano dla genotypu PRLR/AB (0,31), natomiast najniższą dla homozygot PRLR/AA (0,28) (Tab. 2, Wykres 2). Podobną tendencję wśród genotypów zaobserwowali także Kmieć i Terman (2004) badając grupę loch rasy wbp określili największy udział genotypu PRLR/BB 63

4 Udział [%] (frekwencja 0,48) a najniższy dla genotypu PRLR/AA (frekwencja 0,10) [13]. Badana grupa loch rasy wielka biała polska w locus PRL charakteryzowała się rozkładem genotypów zgodnym z regułą równowagi genetycznej Hardy ego Weinberga, natomiast w locus PRLR rozkład genotypów nie był zgodny z równowagą genetyczną (Tab. 2). Tabela 2. Frekwencja genów i genotypów PRL i PRLR u loch rasy wbp. Gen Genotyp n Liczebność obserwowana Liczebność oczekiwana χ 2 Częstość alleli Del/Del 37 0,248 0,231 PRL PRLR PRL Ins/Del 70 0,465 0,498 0,637 Ins Del A B Ins/Ins 43 0,287 0,271 PRLR A/A 42 0,280 0,188 A/B 46 0,307 0,491 21,157 0,58 0,42 0,43 0,57 B/B 62 0,413 0,321 Na wykresie oznaczonym numerem 1 przedstawiono strukturę genetyczną badanych loch w zależności od genotypów genu PRL z uwzględnieniem poszczególnych stad. Zaobserwowano, iż heterozygoty stanowiły największy odsetek zwierząt w każdym z czterech analizowanych stad, a kształtował się on na poziomie od 41,67% (stado 3) do 50% (stado 1) (Wykres 1) , ,71 41,67 45, ,29 36,11 33,33 Del/Del 30 Ins/Del ,22 21,21 Ins/Ins 10 5,88 0 Stado I stado II stado III stado IV Wykres 1. Frekwencja genotypów w loci PRL badanych loch z podziałem na stada. Na wykresie 2 zobrazowano udział poszczególnych genotypów pod względem genu PRLR w czterech stadach objętych analizą. Zaobserwowano, iż udział trzech 64

5 Udział [%] zidentyfikowanych genotypów w stadzie II i III był zbliżony. Natomiast w stadzie I ponad połowę loch stanowiły heterozygoty PRLR/AB, a w stadzie IV aż 75% to osobniki homozygotyczne PRLR/BB (Wykres 2) , , ,3 42,86 41,67 38,89 31,43 31,43 25,71 A/A A/B B/B ,76 12,12 12,12 0 Stado I stado II stado III stado IV Wykres 2. Frekwencja genotypów w loci PRLR badanych loch z podziałem na stada. PODSUMOWANIE Badania przeprowadzone w ciągu kilku ostatnich lat dowodzą, iż zarówno gen PRL jak i gen PRLR w sposób pośredni i bezpośredni uczestniczą w kształtowaniu cech reprodukcyjnych trzody chlewnej, dzięki czemu są one rozpatrywane jako potencjalni kandydaci na markery tychże cech. Podsumowując, należy stwierdzić, iż dokładniejsze poznanie opisanych genetycznych i fizjologicznych czynników może przyczynić się do przyspieszenia postępu hodowlanego a tym samym utrzymania produkcji wieprzowiny na opłacalnym poziomie. LITERATURA References 1. Babicz M., Bajda Z Długość użytkowania rozpłodowego loch ważnym czynnikiem produkcyjnym, Ogólnopolski biuletyn dla hodowców i producentów trzody chlewnej. 11: Babicz M., Pierzchała M., Urbański P., Rozempolska Rucińska I An insertion /deletion polymorphism In the 3'UTRencoding region of the porcie prolactin (PRL) gene. Animal Science Papers and Reports vol. 26, no. 3: Barreras Serrano A., Herrera Haro J. G., Hori Oshima S., Guti rrez spinosa A., Ortega Cerilla M. E., P rez J., Lemus Flores C., Kinejara spinosa A. L., Gonz lez Arangur A., Soto A ila J. G Prolactin Receptor (PRLR) Gen Polimorphism and Associations with Reproductive Traits in Pigs. Journal of Animal and Veterinary Advances 8 (3): Bole Feysot C., Goffin V., Edery M., Binart N., Kelly P.A Prolactin (PRL) and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout mice. Endocr. Rev. 19: Clevenger C. V., Kline J. B Prolactin receptor signal transduction. Lupus, 10:

6 6. Colenbrander B., Erkens H. F., Meijer J. C., Poot P., Trudeau V. L., Van De Wiel D. F. M Prolactin in the developing Pig. Biology of reproduction 39: Drogemuller C., Hamann H., Dietl O Candidate gene markers for litter size In different German pig lines. J. Anim. Sci. 79: Dusza L., Ciereszko R., (red.) Krzymowskiego T Fizjologiczna regulacja procesów rozrodczych samicy, Biologia Rozrodu Zwierząt. Wydawnictwo Uniwersytetu Warmińsko Mazurskiego, Olsztyn. 9. Farmer C., Sorensen M. T., Robert S., Petitclerc D Administring exogenous porcine prolactin to lactating sows: milk yield, mammary gland composition, and endocrine and behavioral responses. J. Anim Sci. 77: Freeman M. E., Kanyicska B., Lerant A., Nagy G Prolactin : structure, function, and regulation of secretion. Mol. Cell. Endocrinol. 80: Grattan D. R Behavioural significance of prolactin signaling in the central nervous system during pregnancy and lactation. Reprod. 123: Kelly P. A., Djiane J., Postel Vinay M. C., Edery M The prolactin/growth hormone receptor family. Endocr. Rev. 12: Kmieć M., Terman A Polymorphism in the PRLR/AluI gene and its effect on litter size in Large White sows. Anim. Sci. Pap. Rep. 22: Kmieć M., Terman A Prolactin receptor gene polymorphism in Polish Landrace boars, Anim. Sci. Pap. Rep. 22: Korwin Kossakowska A., Kamyczek M., Cieślak D., Pierzchała M., Kurył J Candidate gene markers for reproductive traits In polish 990 pig line. J. Anim. Breed. Genet. 120: Lesueur L., Edery M., Ali S., Paly J., Kelly P. A., Djiane J Comparison of long and short forms of the prolactin receptor on prolactin induced milk protein gene transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., Rodwell V. W Biochemia Harpera. Wydawnictwo lekarskie PZWL, Warszawa. 18. Putnova L., Knoll A., Dvorak J., Cepica S A new HpaII PCR RFLP within the porcine prolactin receptor (PRLR) gene and study of its effect on litter size and number of teats. J. Anim. Breed. Genet. 119: Ruszczyc Z Metodyka doświadczeń zootechnicznych. Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, Warszawa. 20. Terman A Effect of the polymorphism of prolactin receptor (PRLR) and leptin (LEP) genes on litter size In polish pigs. J. Anim. Breed. Genet. 122: Terman A., Kmieć M., Kowalewska Łuczak I Gen PRLR marker cech użytkowości rozrodczej loch? Medycyna Wet. 63: Tomas A., Casellas J., Ramirez O., Munoz G., Noguera J. L., Sanchez A High amino acid variation in the intracellular domain of the pig prolactin receptor (PRLR) and its relation to ovulation rate and piglet survival traits. J. Anim. Sci. 84: Van Rens B. T. T. M., Van Der Lende T Litter size and piglet traits of gilts with different prolactin receptor genotypes, Theriogenol. 57: Ziółkowska A., Bogdzińska M., Biegniewski J Polymorphism of prolactin receptor gene (PRLR) in the Polish Landrace and Polish Large White swine population, Journal Central European of Agriculture 4: