Replicative Senescence of Lymphocytes

Transkrypt

1 REVIEWS Dent. Med. Probl. 2003, 40, 1, ISSN X LUC MARIE GERLAND 1, 2, MARTINE FFRENCH 1, 2 Replicative Senescence of Lymphocytes Senescence replicative des lymphocytes Starzenie się limfocytów 1 INSERM U 453: Biologie des Gènes Suppresseurs de Tumeur, Faculté de Médecine Rockefeller et Centre Léon Bérard, Lyon, France 2 Laboratoire d'hématologie et de Cytogénétique, Hôpital Edouard Herriot, Lyon, France Résumé Les cellules normales en culture prolongée ont une durée de vie limitée et après un nombre défini de doublements (50+10) atteignent le stade de sénescence réplicative. Cette sénescence se manifeste par une diminution de la prolifération cellulaire, une absence de capacité de restimulation, l expression de la β galactosidase à ph 6. Les cellules lymphoïdes normales maintenues en culture sont capables de développer ces modifications initialement décrites pour les fibroblastes à la conditions d être soumises à des stimulations mitogéniques itératives. De plus, ils manifestent une diminution de l expression de CD28 tandis que les modifications morphologiques classiques ne sont pas observées. Une autre particularité des lymphocytes normaux réside aussi dans leur capacité à exprimer la télomérase qui est active dans les lymphocytes stimulés. La sénescence lymphocytaire provoque une diminution de l activité télomérasique aboutissant comme pour les fibroblastes à un raccourcissement de la longueur des télomères. Les phénomènes biologiques impliqués dans la mort des cellules sénescentes restent incomplètement compris. Le dogme de leur résistance à l apoptose est remis en cause. Sous l influence de stress génotoxiques, les fibroblastes sénescents développent une apoptose p53-indépendante et une nécrose dont il reste à préciser les mécanismes. L étude de la sénescence lymphocytaire in vitro est un modèle permettant de mieux comprendre l immunosénescence, correspondant aux modifications du système immunitaire associés à l âge (Dent. Med. Probl. 2003, 40, 1, 93 98). Mot clé: senesence replicative, lymphocytes, cycle celluláire. Key words: replicative senesence, lymphocytes, cellular cycle. Streszczenie Prawidłowe komórki eukariotyczne utrzymane w hodowli ciągłej dzielą się skończoną ilość razy (około 50±10), osiągając stadium starzenia. Stadium to charakteryzuje się zmniejszoną proliferacją komórkową, utratą zdolności komórek do dalszych podziałów po ich ponownej stymulacji, pojawieniem się w tych komórkach ekspresji enzy mu β galaktozydazy aktywnej w środowisku o ph 6. Prawidłowe limfocyty krwi obwodowej utrzymane w długo trwałej, ciągłej hodowli wykazują cechy starzenia, które po raz pierwszy były opisane w kulturze fibroblastów pod danych stymulacji mitogenami. W komórkach limfatycznych obserwuje się dodatkowo obniżenie ekspresji anty genu CD28, ale brak jest w nich typowych zmian morfologicznych (występujących np. w fibroblastach) oraz eks presję enzymu telomerazy, która jest obecna w limfocytach stymulowanych. W fazie senesencji replikacyjnej lim focyty, podobnie jak fibroblasty, wykazują nieznaczną aktywność telomerazy oraz skrócenie długości telomerów. Procesy biologiczne regulujące procesem starzenia się i śmiercią komórkową nie są do końca poznane. Założenie, że komórki w fazie senesencji replikacyjnej są oporne na apoptozę budzi kontrowersje. Pod wpływem stresu ge notoksycznego fibroblasty w fazie starzenia ulegają apoptozie drogą p53 niezależną i martwicy w wyniku działania niepoznanego jeszcze do końca mechanizmu. Badanie starzenia limfocytów in vitro stanowi doskonały model, który umożliwi lepsze zrozumienie i poznanie zjawiska immunosenesencji w aspekcie zmian w systemie immunologicznym występujących wraz z wiekiem (Dent. Med. Probl. 2003, 40, 1, 93 98). Słowa kluczowe: starzenie komórek, limfocyty, cykl komórkowy.

2 94 L. M. GERLAND, M. FFRENCH La notion de sénescence réplicative (SR) a été proposée initialement au niveau de fibroblastes en culture par la mise en évidence d une incapacité à se multiplier indéfiniment [1]. Le vieillissement cellulaire in vitro se manifeste classiquement aux niveaux morphologique et prolifératif: les «vieux» fibroblastes augmentent en taille, ont une prolifération de plus en plus lente qui s arrête après 50±10 doublements et sont alors résistants à la stimulation mitogénique. Ces phénomènes s accompagnent de multiples modifications métaboliques portant en particulier sur la régulation du cycle cellulaire, le métabolisme des télomères, la régulation de la mort cellulaire. La mise en évidence d une enzyme lysosomiale, la β galactosidase exprimée au ph suboptimal de 6, paraît spécifique de la sénescence réplicative et permet de recon naître les cellules sénescentes [2]. Cependant, les caractéristiques de la sénescence cellulaire peu vent dans une certaine mesure varier en fonction du type cellulaire et la notion même de sénescence réplicative a été contestée pour les lymphocytes du fait de leur capacité d anergie in vivo impliquant l absence de prolifération et une survie très prolongée. Obtention de la Sénescence Lymphocytaire La sénescence lymphocytaire, in vitro, a été longtemps méconnue car sa survenue contraire ment aux fibroblastes ou aux kératinocytes néces site des restimulations répétées. Sans restimula tion, les lymphocytes du sang initialement sti mulés par la PHA puis maintenus en culture en présence d IL 2 cessent progressivement de pro liférer mais ne présentent pas toutes les caractéri stiques de SR: l activité de la β galactosidase n est retrouvée que dans une partie de la population lymphocytaire et les cellules sont capables de re stimulation. C est seulement après 3 à 4 restimulations successives que l ensemble de la population cellulaire exprimera l activité β galactosidase et sera incapable de restimulation. Il se pourrait donc que la rencontre ré pétée d un même antigène au cours de la vie d'un individu puisse limiter la réponse immune en déclenchant la sénescence des lymphocytes T mémoires. Cette hypothèse est étayée par l observation au niveau des lymphocytes de modifications phénotypiques liées à l age [3], d une diminution des capacités prolifératives des lymphocytes T mémoire par rapport lymphocytes naifs [4], et des caractéristiques des populations lymphocytaires dans certaines infections chroniques [5]. Cependant, au cours des infections virales aiguës, provoquant des expansions clonales massives, la réponse cellulaire est complexe avec mise en place de mécanismes de compensation qui semble retarder la survenue de la sénescence réplicative [6]. L immunosénescence, correspondant aux modifications du système immunitaire associés à l âge ne concerne pas seulement les lymphocytes T (les mieux étudiés) mais aussi les autres types cellulaires en particulier les lymphocytes B et les neutrophiles. Caractéristiques Morphologiques des Lymphocytes Sénescents Les fibroblastes normaux humains présentent des modifications morphologiques importantes avec le vieillissement. Alors que les fibroblastes jeunes sont fusiformes, les fibroblastes sénescents augmentent en taille et s étalent sur le support. Au contraire, en microscopie optique aucune différen ce de taille ou de forme n est observée entre les lymphocytes jeunes et sénescents [7]. Cependant, des modifications du phénotype immunologique des lymphocytes apparaissent. Lorsque les lymphocytes totaux du sang périphéri que sont maintenus en culture prolongée, le pour centage de cellules CD8 + augmente progressive ment alors que parallèlement l expression de l antigène CD28 diminue. Plus de 95% des lymphocytes en fin de culture sont CD8 + CD28 [8]. Régulation du Cycle Cellulaire Comme les fibroblastes, les lymphocytes en culture prolongée en présence d IL 2 cessent pro gressivement de proliférer. Cependant, pendant plusieurs semaines, ils restent sensibles à la restimulation qui progressivement devient inefficace. Lorsque l ensemble de la population lymphocytaire exprime la β galactosidase, elle n est plus capa ble de proliférer sous l effet des mitogènes. Les lymphocytes comme les fibroblastes sont alors bloqués en phase G1 du cycle cellulaire [9]. La plupart des modifications de l expression des protéines de régulation du cycle cellulaire sont retrouvées dans les différents types cellulaires. Lucibello et al. [10] ont montré que, dans les fibroblastes sénescents, l expression des cyclines de la phase G1 (D1 et E) est plus importante que dans les cellules quiescentes, alors que l expression des cyclines des phases plus tardives S et G2/M (cyclines A et B) est extrêmement faible. En outre, une

3 Replicative Senescence of Lymphocytes 95 très faible expression de CDK1 et une diminution des transcrits de CDK2 et CDK4 sont constantes. Dans les cellules lymphoïdes sénescentes, CDK6 paraît au contraire fortement exprimée [11]. Les inhibiteurs des CDK présentent aussi des modifications de leur expression avec en particulier une forte expression des protéines p16 ink4a et p15 ink4b dans les lymphocytes sénescents [11]. Normalement, p16 ink4a n est pas exprimée dans les lymphocytes T mais est visualisée en Western blot après 10 à 15 jours de culture alors que seule une minorité de lymphocytes sont β galactosidase po sitifs. On peut ainsi penser que p16 ink4a partici perait à l établissement du phénotype sénescent. Les voies de prb et de p53 sont impliquées dans l induction de la sénescence réplicative et font actuellement l objet de très nombreuses études dans ce contexte [12]. Sénescence Lymphocytaire et Télomères Lors de la sénescence réplicative, l arrêt de la prolifération cellulaire semble être régi par une horloge biologique. L érosion de l ADN terminal aux extrémités des chromosomes, après chaque cycle de réplication a été proposée comme participant au déclenchement de l arrêt de la prolifération cellulaire. Les télomères structures nucléoprotéiques présentant une répétition de l hexamère TTAGGG sont raccourcis de 50 à 200 nucléotides lors de chaque cycle de réplication. Ceci est contre-balancé, dans les lymphocytes, par la persistance de l activité enzymatique de la télomèrase. La télomérase est une ribonucléoprotéine présentant une activité ADN polymérase ARN-dépendante [13]. Cette enzyme est ainsi capable d ajouter des séquences hexanucléotidiques à l extrémité des télomères. Lors du vieillissement des lymphocytes, l activité télomérasique diminue pour devenir presque indétectable et les télomères raccourcissent [14]. Régulation de la Mort Cellulaire des Lymphocytes Sénescents Les cellules sénescentes ne meurent pas im médiatement et peuvent rester longtemps métaboli quement actives [15]. Les modalités de mort cellu laire des cellules sénescentes restent encore très controversées. Pour les lymphocytes deux résultats s opposent: les uns ont trouvés que les lymphocytes sénescents sont résistants à l apoptose [16] tandis que d autres auteurs ont montré la capacité des lymphocytes sénescents à mourir par apoptose [14]. Le modèle des fibroblastes a apporté récemment de nouvelles informations. Un dogme s était presque imposé selon lequel les fibroblastes sénescents étaient résistants à l apoptose. En fait, si en effet la déprivation en serum n induit pas d apoptose dans les fibroblastes sénescents contrairement aux fibroblastes jeunes [17], les stress génotoxiques provoquent la mort cellulaire aussi bien dans les fibroblastes jeunes que vieux. Les fibroblastes jeunes meurent essentiellement par apoptose p53-dépendante tandis que les fibroblastes sénescents meurent d une part par apoptose p53-indépendante et d autre part par nécrose [18]. Le mécanisme de la mort cellulaire des cellules sénescentes reste donc en partie incompris mais des voies nouvelles mettant en jeu en particulier la masse lysosomiale se dessinent [19]. Les lymphocytes maintenus en culture pro longée, dans certaines conditions, évoluent vers un phénotype sénescent. Ce modèle cellulaire conserve cependant, dans cette évolution métabolique, des particularités qui restent à explorer. Elles pourraient être liées en particulier aux relations entre la stimulation lymphocytaire et le métabolisme des télomères. Remerciements. Nos travaux concernant la sénescence réplicative des lymphocytes ont été fi nancièrement soutenus en partie par les Hospices civils de Lyon, la «Ligue contre le Cancer du Rhône, et de l Ardèche» et par la Région Rhône Alpes (contrat ).

4 96 L. M. GERLAND, M. FFRENCH Po raz pierwszy proces starzenia opisano w fi broblastach. Leonard Hayflick w pracy opubliko wanej w 1961 r. w Experimental Cell Research dowiódł, że fibroblasty dzielą się skończoną ilość razy, liczbę tę nazwano limitem Hayflicka [1] Starzenie się komórek w warunkach in vitro cha rakteryzuje się klasycznymi zmianami w ich mor fologii i zdolność do proliferacji. Fibroblasty sene sentne są bardziej wydłużone, wykazują zmniej szoną zdolność do podziałów komórkowych (oko ło 50±10) i utratę zdolności do podziałów po ich restymulacji. Te zjawiska towarzyszą licznym zmianom metabolicznym, które dotyczą głównie regulacji cyklu komórkowego i metabolizmu telo merów. Wykazanie ekspresji lizosomalnego enzymu β galaktozydazy w środowisku o ph 6 wydaje się swoistym markerem starzenia pozwalającym na identyfikację komórek w tym stadium [2]. Cechy charakteryzujące komórki starzejące się mogą się jednak zmieniać w zależności od typu komórek. Otrzymywanie limfocytów w fazie starzenia Przez długi czas proces starzenia limfocytów in vitro pozostawał słabo poznany ze względu na trudności w utrzymaniu limfocytów w długotrwa łej hodowli komórkowej, która wymaga częstej re stymulacji, przeciwnie do fibroblastów i keratyno cytów. Prawidłowe limfocyty krwi obwodowej stymulowane początkowo za pomocą PHA, na stępnie utrzymane w hodowli dzięki obecności IL 2 przestają stopniowo proliferować, lecz nie wyka zują jeszcze wszystkich cech starzenia. Aktyw ność β galakozydazy jest wykrywana tylko w czę ści populacji komórkowej, pozostała część popu lacji odpowiada na stymulację. Dopiero po trzech lub czterech kolejnych restymulacjach całość po pulacji staje się β galaktozydazododatnia i traci zdolność do dalszej proliferacji nawet po dalszej stymulacji. Przypuszcza się, że powtarzająca się stymulacja limfocytów T tym samym antygenem w czasie życia osobniczego mogłaby ograniczać odpowiedź limfocytów T pamięci immunologicz nej. Ta hipoteza została wysunięta na podstawie obserwacji zmian fenotypowych limfocytów związanych z wiekiem badanego [3], obniżeniem zdolności proliferacyjnej limfocytów T pamięci immunologicznej w stosunku do limfocytów, któ re nie miały żadnego kontaktu z antygenem [4] oraz w odniesieniu do populacji limfocytów wy stępujących w przewlekłych zakażeniach [5]. Tymczasem podczas ostrej infekcji wirusowej, po wodującej masywną ekspansję limfocytów, odpo wiedź komórkowa jest kompleksowa wraz z uru chomieniem mechanizmów kompensacyjnych, które wydają się opóźniać rozwój fazy starzenia komórkowego [6]. Proces immunosenesencji ob serwowany w kontekście zmian w układzie immu nologicznym wraz z wiekiem człowieka nie doty czy tylko limfocytów typu T (lepiej zbadanych), ale również innych typów komórek, szczególnie limfocytów B i granulocytów obojętnochłonnych (netrofilii). Charakterystyka morfologiczna limfocytów w stadium starzenia Prawidłowe ludzkie fibroblasty wykazują du że zmiany morfologiczne związane z procesem starzenia się komórek. Młode fibroblasty mają kształt wrzecionowaty, w fazie starzenia ich kształt zmienia się, a wielkość się zwiększa. W przeciwieństwie do fibroblastów, nie stwierdza się żadnych różnic w wielkości i kształcie między limfocytami młodymi a starzejącymi się oceniany mi w mikroskopie optycznym [7]. Stopniowo po jawiają się jednak różnice fenotypowe. Kiedy cała populacja limfocytów krwi obwodowej jest utrzy mywana w hodowli ciągłej, odsetek limfocytów CD8 + stopniowo wzrasta, a ekspresja antygenu CD28 + stopniowo się zmniejsza. Ponad 95% lim focytów pod koniec hodowli ma fenotyp: CD8 + CD28 [8]. Regulacja cyklu komórkowego Podobnie jak fibroblasty, limfocyty utrzyma ne w ciągłej hodowli w obecności Il 2 stopniowo przestają się dzielić. Tymczasem przez wiele ty godni pozostają one wrażliwe na ponowną stymu lację, która stopniowo staje się coraz mniej sku teczna. Kiedy cała populacja komórek staje się β galaktozydazododatnia, nie jest zdolna do dalszej proliferacji indukowanej mitogenami. Limfocyty, podobnie jak fibroblasty, są zatrzymane w fazie G1 cyklu komórkowego [9]. W różnych typach komórek stwierdza się zmiany w ekspresji białek regulujących cykl komórkowy. Lucibello et al. [10] wykazali, że w fibroblastach w stadium sta rzenia ekspresja cyklin fazy G1 cyklu komórko wego (D1 i E) jest większa niż w komórkach spo czynkowych, podczas gdy ekspresja cyklin obe cnych w późniejszych fazach cyklu podziałowego S i G2/M (cyklin A i B) jest bardzo słaba. Obser wuje się również bardzo słabą ekspresję kinaz CDK1, CDK2 i CDK4, ekspresja CDK6 jest nato

5 Replicative Senescence of Lymphocytes 97 miast bardzo silna [11]. Stwierdza się również zmiany w ekspresji inhibitorów kinaz cyklinoza leżnych. Szczególnie silną ekspresję w tych lim focytach mają białka p16 ink4a i p15 ink4b [11]. W prawidłowych limfocytach T ekspresja p16 ink4a nie jest wykrywana, dopiero po dniach hodowli może zostać wykazana metodą Western Blot, gdy w hodowli pojawiają się komór ki β galaktozydazododatnie. Fakt ten pozwala na wysunięcie przypuszczenia, że białko p16 ink4a mo że odgrywać rolę w kształtowaniu fenotypu starze jących się limfocytów. W regulację starzenia ko mórkowego są zaangażowane białka szlaku prb i p53, które stanowią obecnie przedmiot wielu ba dań [12]. Proces starzenia limfocytów a telomery Starzenie komórkowe, zatrzymanie podziałów komórkowych, wydają się regulowane przez tzw. zegar biologiczny komórki. Ubytek DNA na koń cach chromosomów po każdym podziale komór kowym jest uważany za czynnik inicjujący zatrzy manie dalszej proliferacji komórkowej. Telomery będące strukturami nukleoproteinowymi o se kwencyjnej budowie heksamerycznej TTAGGG, zostają skrócone nukleotydów podczas każ dego podziału komórkowego. To zjawisko jest równoważone obecnością aktywności telomerazy w limfocytach. Telomeraza jest rybonukleoprotei ną o aktywności odwrotnej transkryptazy RNA zależnej [13]. Enzym ten ma zdolność przyłącza nia sekwencji telomerowych do końców chromo somów. W procesie starzenia się komórek limfa tycznych aktywność telomerazy zmniejsza się i staje się praktycznie niewykrywalna, a długość telomerów jest mniejsza [14]. Regulacja śmierci komórek limfatycznych w fazie starzenia Komórki limfatyczne w fazie starzenia nie umierają od razu, lecz mogą pozostawać przez dłu gi czas aktywne metabolicznie [15]. Mechanizm śmierci komórek starzejących się budzi wciąż spo ro kontrowersji. Odnośnie do limfocytów wyniki badań są sprzeczne: wykazano, że limfocyty takie nie ulegają apoptozie [16], inni badacze stwierdzi li natomiast, że giną w wyniku apoptozy [14]. Ba dania przeprowadzone na fibroblastach dostarczy ły w ostatnim czasie nowych informacji. Przyjęto, że fibroblasty w fazie starzenia są oporne na apoptozę i rzeczywiście pozostawione w hodowli oraz pozbawione substancji odżywczych fibrobla sty zestarzałe nie ulegają apoptozie wprost prze ciwnie do młodych fibroblastów [17]. Wykazano jednak, że stres genotoksyczny powoduje śmierć komórek zarówno młodych fibroblastów, jak i sta rzejących się. Młode fibroblasty giną w wyniku apoptozy zależnej od p53, podczas gdy fibroblasty starzejące się mogą ulegać zarówno apoptozie nie zależnej od p53, jak i martwicy [18]. Mechanizmy zaangażowane w proces śmierci komórek starzeją cych się pozostają nadal w znacznej części niezro zumiałe, ale nowe teorie próbujące wyjaśniać ten proces, przede wszystkim udział w nim enzymów lizosomalnych, już się zarysowują [19]. Limfocyty utrzymane w hodowli ciągłej, w pewnych określonych warunkach ewoluują, osiągając fenotyp komórek zestarzałych. Ten model komórkowy zachowuje jednak pewne szczególne cechy, które nie są do końca poznane. Uważa się, że mogą wykazywać ścisły związek z procesem sty mulacji komórkowej i metabolizmem telomerów. Podziękowanie. Badania były finansowane przez Hospice Cyvils, Lyon, La Lique contre le Cancer du Rhone i Ardeche oraz region Rhone Al pes (grant nr ) (tłum. IWONA URBANOWICZ) References [1] HAYFLICK L., MOOREHEAD P. S.: The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 1961, 25, [2] DIMRI G.P., LEE X., BASILE G., ACOSTA M., SCOTT G., ROSKELLEY C., MEDRANOS E., LINSKENS M., RUBELJ I., PE REIRA SMITH O., PEACOCKE M., CAMPISI J.: A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, 92, [3] PAWELEC G., SOLANA R., REMARQUE E., MARIANI E.: Impact of aging on innate immunity. J. Leukocyte Biol. 1998, 64, [4] WENG N. P., LEVINE B. L., JUNE C. H., HODES R. J.: Human native and memory T lymphocytes differ in telome ric length and replicative potential. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, [5] EFFROS R. B., ALLSOPP R., CHIU C. P., HAUSNER M. A., HIRJI K., WANG L., HARLEY C. B., VILLEPONTEAU B., WEST M. D., GIORGI J. V.: Shortened telomers in expanded CD28 CD8 + cell subset in HIV disease implicate re plicative senescence in HIV pathogenesis. AIDS 1996, 10,

6 98 L. M. GERLAND, M. FFRENCH [6] MAINI M. K., SOARES M. V. D., ZILCH C. F., AKBAR A. N., BEVERLEY P. C. L.: Virus induced CD8 + T cell clonal expansion is associated with telomerase up regulation and telomere length preservation: A mechanism for rescue from replicative senescence. J. Immunol. 1999, 162, [7] PERILLO N. L., NAEIM F., WALFORD R. L., EFFROS R.: In vitro cellular aging in T lymphocyte cultures: analysis of DNA content and cell size. Exp. Cell Res. 1993, 207, [8] EFFROS R. B., BOUCHER N., PORTER V., ZHU X., SPAULDING C., WALFORD R. L., KRONENBERG M., COHEN D., SCHÄCHTER F.: Decline in CD28 + T cells in centenarians and in long term T cell cultures: a possible cause for both in vivo and in vitro immunosenescence. Exp. Gerontol. 1994, 6, [9] CRISTOFALO V. J., SHARF B.: Cellular senescence and DNA synthesis. Exp. Cell. Res. 1973, 76, 419. [10] LUCIBELLO F. C., SEWING A., BRUSSELBACH S., BURGER C., MULLER R.: Deregulation of cyclins D1 and E and sup pression of CDK2 and CDK4 in senescent human fibroblasts. J. Cell Sci. 1993, 105, [11] ERICKSON S., SANGFELT O., HEYMAN M., CASTRO J., EINHORN S., GRANDER D.: Involvement of INK4 proteins p16 and p15 in T lymphocyte senescence. Oncogene 1998, 17, [12] SHAY J. W., PEREIRA SMITH O. M., WRIGHT W. E.: A role for both Rb and p53 in the regulation of human cellular senescence. Exp. Cell Res. 1991, 196, [13] BLACKBURN E. H.: Structure and function of telomeres Nature 1991, 350, [14] PAN C., XUE B. H., ELLIS T. M., PEACE D. J., DIAZ M. O.: Changes in telomerase activity and telomere length du ring human T lymphocyte senescence. Exp. Cell Res. 1997, 231, [15] LINSKENS M. H. K., CAMPISI J., HAYFLICK L.: Replicative senescence and cell death. Science 1995, 267, 17. [16] SPAULDING C., GUO W., EFFROS R.: Resistance to apoptosis in human CD8 + T cells that reach replicative senescen ce after multiple rounds of antigen specific proliferation. Exp. Gerontol. 1999, 34, [17] Senescent human fibroblasts resist programmed cell death, failure to suppress bcl2 is involved. Cancer Res. 1995, 55, [18] SELUANOV A., GORBUNOVA V., FALCOVITZ A., SIGAL A., MILYAVSKY M., ZURER I., SHOHAT G., GOLDFINGER N., ROTTER V.: Change of the death pathway in senescent human fibroblasts in response to DNA damage is caused by an inability to stabilize p53. Mol. Cell Biol. 2001, 21, [19] BRUNK U. T., TERMAN A.: The mitochondrial lysosomal axis theory of aging. Accumulation of damaged mito chondria as a result of imperfect autophagocytosis. Eur. J. Biochem. 2002, 269, Address for correspondance: Martine Ffrench INSERM U 453, Faculté de Médecine 8 avenue Rockefeller Lyon CEDEX 08 France Phone: Fax: E mail: Martine.Ffrench@rockefeller.univ lyon1.fr Received: Revised: Accepted: Praca wpłynęła do Redakcji: r. Po recenzji: r. Zaakceptowano do druku: r.