Ocena rozprawy na stopień doktora nauk biologicznych mgr Anny Biernackiej

Transkrypt

1 Prof. dr hab. Ryszard Oliński Katedra Biochemii Klinicznej Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Collegium Medium im. L.Rydygiera w Bydgoszczy Ocena rozprawy na stopień doktora nauk biologicznych mgr Anny Biernackiej Rozwój metody BLESS i jej zastosowanie do badania podwójnych pęknięć DNA w wybranych organizmach eukariotycznych Materiał genetyczny żywych organizmów jest w sposób ciągły narażony na działanie czynników wprowadzających chemiczne modyfikacje. Zarówno czynniki środowiskowe, jak i te powstające jako wynik metabolizmu mogą generować w każdej komórce, w przeciągu doby tysiące takich zmian. Wiele z nich może powodować trwałe zmiany w cząsteczce DNA, które mogą upośledzić albo pozbawić komórkę, a także organizm, możliwości prawidłowego funkcjonowania. Spośród tej olbrzymiej ilości uszkodzeń, zdecydowaną większość, przyjmuje się, że 75%, stanowią jednoniciowe pęknięcia, (ssb), które są szybko naprawiane. Część z tych uszkodzeń może jednak być przekształcona w pęknięcia podwójne (dsb), które są dla komórki zdecydowanie bardziej niebezpieczne, ponieważ mogą być przyczyną śmierci komórki lub prowadzić do jej transformacji nowotworowej. Im więcej tego typu uszkodzeń DNA w pojedynczej komórce tym większe ryzyko mutacji prowadzących do rearanżacji materiału genetycznego i zapoczątkowania procesu nowotworzenia. Niezwykle istotne wydaje się więc poszukiwanie nowych czynników prognostycznych i obiektywizacja dotychczasowych kryteriów pozwalających na rokowanie przebiegu choroby nowotworowej. Precyzyjna ocena ilości dsb jest jednym z czynników potrzebnych do pełniejszego zrozumienia procesu nowotworzenia. 1

2 Podstawowym celem badań było opracowanie nowej metody, opartej na metodzie BLESS (ang. in situ Breaks Labelling, Enrichment on Streptavidin and next-generation Sequencing) do znakowania podwójnych pęknięć DNA (dsdna, dsb) in situ dla komórek drożdżowych. Autorka dobrze uzasadnia decyzję wyboru argumentując, że genom drożdżowy mimo, że jest znacznie mniejszy od ludzkiego, to istnieje pomiędzy nimi wiele istotnych podobieństw, z punktu widzenia genetyka molekularnego. Najbardziej istotnym jest fakt, że jedna trzecia genów drożdżowych jest homologiczna do genów ludzkich, wiele genów zaangażowanych w kontrolę cyklu komórkowego drożdży ma swoje homologi u człowieka, a 20% genów związanych z ludzkimi chorobami posiada funkcjonalny ekwiwalent u drożdży. Tak więc analiza dsb na prostym drożdżowym genomie może zaowocować pogłębieniem informacji dotyczących etiologii chorób degeneracyjnych człowieka. Dlatego tematyka rozprawy mgr Anny Biernackiej jest atrakcyjna i niezwykle aktualna. Proponowany temat/cel pracy jest również bez wątpienia oryginalny ponieważ jak do tej pory nie było możliwe wykorzystanie jednej z najbardziej czułych i precyzyjnych metod analizy dsb - techniki BLESS do bezpośredniej identyfikacji podwójnych pęknięć DNA w komórkach drożdży. Rozprawa ma układ bardzo przejrzysty, napisana jest dobrym językiem, a wyniki ujęte są w czytelnych tabelach i na rycinach. Praca ma typowy układ charakterystyczny dla prezentacji badań eksperymentalnych. Mimo zwartej formy Wstęp stanowi bardzo dobre i wyczerpujące wprowadzenie do zagadnień będących przedmiotem rozprawy. Sadzę, że zgromadzone w tym rozdziale informacje po wprowadzeniu niewielkich skrótów-modyfikacji, mogą posłużyć do zredagowania pracy przeglądowej, która powinna być wysłana do renomowanych ogólnopolskich czasopism naukowych, takich jak Postępy Biochemii czy Postępy Biologii Komórki. Gorąco Doktorantkę do tego namawiam. W części teoretycznej znalazły się, jak 2

3 się wydaje, wyczerpujące informacje dotyczące powstawanie dsb, ich naprawy jak i konsekwencji związanych z ich obecnością w komórce. Nie bez znaczenia jest jasny i klarowny język, jakim Doktorantka posługuje się przy opisie niejednokrotnie trudnych i specjalistycznych zagadnień. Ogólny cel pracy (patrz wyżej) został uzupełniony o następne zadania badawcze, których podstawowym założeniem była analiza konsekwencji występowania dsb w genomie komórek mysich i ludzkich. Jestem przekonany, że oba dodatkowe cele (zrealizowane w ocenianej rozprawie) mogłyby z powodzeniem stanowić tematy odrębnych prac doktorskich. Ze szczególnym uznaniem pragnę podkreślić fakt, że do realizacji tych celów Doktorantka zastosowała, bardzo trafnie, szerokie spektrum nowoczesnych technik i analiz, używanych w najlepszych laboratoriach genetyki molekularnej. Detaliczny opis używanych przez Autorkę technik można znaleźć w egzemplarzu pracy. Żeby nie być gołosłownym dodam tylko, że jednym z podstawowych narzędzi metodycznych było sekwencjonowanie nowej generacji próbek BLESS i związane z tą metodyką techniki. Wydaję się, że niewielu Doktorantów może się pochwalić wykorzystaniem, dodam, że niezwykle owocnym, tak wyrafinowanej metodologii. Trudno pominąć zastosowanie do oceny wyników bardzo specyficznych, najwyższej próby, analiz bioinformatycznych (zainteresowanych zachęcam do lektury krótkiego podrozdziału z opisem tej analizy). Chciałbym również zaakcentować bardzo trafnie dobrany odpowiedni materiał badawczy, którym były różne szczepy komórek drożdży z unikatowymi genotypami dostarczone przez grupę prof. Philippe Pasero (Institute of Human Genetics, CNRS, Francja); komórki ludzkie produkującą białko fuzyjne AsiSI ER (prof. Gaelle Legube (CNRS-Francja), oraz komórki mysiego szpiku kostnego z konstytutywną i warunkową delecją białekssb1/ssb2 (prof. Kum Kum Khanna BMRI Australia). Perfekcyjny dobór metodyki i materiału biologicznego pozwolił na pełną realizację ambitnych celów pracy. 3

4 W recenzowanej pracy imponuje ilość przeprowadzonych doświadczeń, zarówno in vitro jak in vivo oraz różne podejścia eksperymentalne mające na celu wszechstronne zbadanie efektu związanego z wyznaczonymi zadaniami badawczymi/celami molekularnymi. Tak obszerna metodycznie i tematycznie praca mogła powstać tylko w bardzo dobrze zorganizowanym zespole, a więc uznanie należy się nie tylko Autorce, ale i Promotorom. Nie bez znaczenia dla realizacji doktoratu i osiągnięcia tak wspaniałych wyników jest współpraca z renomowanymi, zagranicznymi ośrodkami: z grupą prof. Gaelle Legube (CNRS-Francja) i z grupą prof. Kum Kum Khanna (BMRI Australia). Pierwszym zadaniem badawczym zrealizowanym przez Doktorantkę, jak zaznaczono powyżej, było opracowanie metody znakowania pęknięć dsb, in situ w komórkach drożdży w oparciu o zmodyfikowaną wersję metody BLESS. Uzyskane wyniki podkreślają niezwykle wysoką specyficzność opracowanej metody oraz rzadko spotykaną w tego typu analizach czułość (możliwość wykrycia jednego pęknięcia występującego w jednej komórce w skupisku komórek). Opracowaną metodę zastosowano do scharakteryzowania dsb indukowanych zeocyną (pochodną radiomimetyku bleomycyny), oraz pęknięć powstałych na skutek działania hydroksymocznika w mutantach drożdży z zaburzonym punktem kontrolnym replikacji. Jak można się było spodziewać zeocyna powoduje powstawanie pęknięć w obrębie całego genomu, a dsb generowane podczas inkubacji z hydroksymocznikiem są ograniczone do miejsc inicjacji replikacji. Drugie zadanie obejmowało badanie możliwości tworzenia skupisk dsb w komórkach ludzkich. Stosując oryginalną metodę BLESS Autorka znakowała pęknięcia w komórkach zsynchronizowanych w fazie G1: przed, po indukcji pęknięć oraz po naprawie powstałych pęknięć. W pełni oryginalnym osiągnięciem było wykazanie, że tworzenie skupisk dsb w uszkodzonych genach dotyczy pęknięć powstałych w transkrypcyjnie aktywnych genach i zachodzi głównie w fazie G1, co jest powiązane z ich opóźnioną naprawą. 4

5 Ostatnim, ale na pewno równie ważnym zagadaniem badanym przez Autorkę, były badania nad funkcją białek Ssb1 i Ssb2, prowadzone we współpracy z grupą prof. Kum Kum Khanna. Utrata tych białek indukuje m.inn. stres replikacyjny, podwójne pęknięcia DNA w obrębie całego genomu, aktywację p53 oraz stymuluje komórki macierzyste hematopoezy w fazie spoczynku do rozpoczęcia proliferacji, co może prowadzić do apoptozy. Otrzymane przez Doktorantkę oryginalne wyniki pokazały, że dsb występują w specyficznych regionach i korelują z miejscami wiązania Ssb1 i Ssb2 oraz, że są one związane z genami należącymi do szlaku hematopoezy. Podsumowując badania te wykazały, że Ssb1 oraz Ssb2 pełnią funkcję strażników homeostazy samoodnawiających się organów. W przekonaniu recenzującego pracę każde z w/w zrealizowanych zadań badawczych, po niewielkich uzupełnieniach, mogłoby stanowić odrębną pracę zasługującą na przyznanie stopnia doktora nauk biologicznych (patrz także wyżej). Uzyskane wyniki autorka omawia w rozdziale Dyskusja. Rozdział ten ma trochę nietypowy układ i podzielony jest na części odnoszące się do poszczególnych etapów badań, co ułatwia komentarz do dużej liczby danych, których praca dostarcza. Chciałbym z uznaniem podkreślić ogrom pracy i dużą ilość zgromadzonych w rozprawie interesujących rezultatów, jak i rzadkie na tym etapie rozwoju naukowego krytyczne podejście do wyników zarówno własnych, ale także innych autorów. Tej polemice towarzyszy przejrzystość i logika prowadzonych wywodów naukowych. Dobrym przykładem jest przedstawiona na stronie 47 rozprawy hipoteza Autorki wyjaśniająca mechanizm powstawania skupisk dsb w jądrach komórek człowieka. Prezentacji oryginalnych i ciekawych rezultatów towarzyszą zwykle pytania i komentarze, co też niniejszym czynię. Na godzinę przed końcem hodowli komórki drożdżowe traktowane były zeocyną (100μg/ml,) lub hydroksymocznikiem (0,2 M), Zastanawiają b. wysokie stężenia obu 5

6 związków- (chyba letalne dla komórki?) Opracowana metoda charakteryzuje się b. wysoką czułością w związku z tym pytanie dlaczego niezbędne były tak wysokie stężenia obu cytotoksycznych związków? Zeocyna w znaczącym stopniu zmienia strukturę DNA jest czynnikiem interkalującym i może łączyć się z DNA. I pytanie czy nie miało to wpływu na przebieg znakowania dsb DNA drożdży po inkubacji z tym antybiotykiem? Formaldehyd, stosowany w metodzie BLESS, jest związkiem o bardzo wysokim potencjale sieciowania tworzenia wiązań między- i wewnątrz - niciowych w DNA jak i wiązań DNA - białko. Wydaje się więc, że jego stosowanie w różnych stężeniach i zmiennym czasie inkubacji, jak to ma miejsce w przypadku różnych modyfikacji metody, może mieć wpływ na interpretacje wyników. Czy można więc bezpośrednio porównywać wyniki i wyliczoną ilość dsb jeżeli stosuje się różne wersje metodyki oparte o w/w różnice. Indukując wiązania poprzeczne (międzyniciowe i DNA białko) formaldehyd może stabilizować strukturę chromatyny. Czy w związku z tym możliwe jest wprowadzanie w ten sposób artefaktów, które mogłyby wpływać na odczyt dsb? Powyższe uwagi/komentarze sprowokowane oryginalnymi i ciekawymi rezultatami i równie ciekawą ich interpretacją, mają charakter dyskusyjny/polemiczny i niczym nie umniejszają mojej wysokiej oceny rozprawy doktorskiej mgr Anny Biernackiej. W moim przekonaniu obrona pracy będzie dobrym miejscem na wymianę poglądów/dyskusję dotyczącą moich komentarzy. Rozprawa jest napisana bardzo starannie pod względem edytorskim, a wszystkie jej części świadczą o dużej wiedzy Autorki i Jej dojrzałości naukowej, co jak wspomniano powyżej, nieczęsto się zdarza na tym etapie rozwoju. Uważam, że rozprawa, jest oryginalnym osiągnięciem naukowym, wnoszącym nowe dane do wiedzy związanej z genetyką molekularną i odpowiada wymogom stawianym rozprawom doktorskim. 6

7 Uwzględniając wartość poznawczą rozprawy, wykazaną w pracy bardzo dobrą znajomość problematyki badań, wnoszę do Wysokiej Rady Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk o przyjęcie rozprawy i dopuszczenie mgr Anny Biernackiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Ze względu na bardzo wysoki poziom rozprawy oraz fakt opublikowania części wyników w Nature Struct Mol Biol i Blood (oba czasopisma z IF powyżej 10) wnoszę również o rozważenie możliwości wyróżnienia jej stosowną nagrodą. Bydgoszcz