Wrocław, 6 czerwca 2017 r.

Transkrypt

1 Wrocław, 6 czerwca 2017 r. Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Anny Biernackiej pt. Rozwój metody BLESS i jej zastosowanie do badania podwójnych pęknięć DNA w wybranych organizmach eukariotycznych wykonanej pod kierunkiem dr. hab. Krzysztofa Ginalskiego oraz dr Magdaleny Skrzypczak w Laboratorium Bioinformatyki i Biologii Systemów Centrum Nowych Technologii Uniwersytetu Warszawskiego Rozprawa doktorska mgr Anny Biernackiej dotyczy udoskonalenia metody wykrywania i mapowania w genomie dwuniciowych pęknięć DNA o nazwie BLESS (ang. direct in situ Breaks Labelling, Enrichment on Streptavidin and next generation Sequencing) w celu zastosowania ich w organizmach modelowych. Badania nad komórkowymi mechanizmami wykrywania i naprawy dwuniciowych pęknięć DNA oraz mechanizmami ich powstawania w wyniku zaburzeń metabolizmu DNA czy działania innych czynników endogennych czy egzogennych są kluczowe dla poznania przyczyn niestabilności genomu, chorób nowotworowych i immunologicznych, niepłodności czy wykrywania substancji genotoksycznych. Do niedawna nie były dostępne metody analizy DNA, które pozwalałaby na wykrywanie dwuniciowych pęknięć DNA in situ w skali genomowej. Opracowanie dla komórek zwierząt metody BLESS, która umożliwia wykrywanie dwuniciowych pęknięć DNA z wysoką rozdzielczością (nawet do jednego nukleotydu) i czułością (do jednego pęknięcia), moim zdaniem stanowi przełom w genetyce, gdyż pozwoli w niedalekiej przyszłości na weryfikację wielu hipotez, co nie było dotąd możliwe ze względu na brak odpowiednich narzędzi badawczych. Głównym organizmem modelowym w badaniach na komórkową odpowiedzią na uszkodzenia DNA są drożdże Saccharomyces cerevisiae, które jednak przy wielu swoich zaletach mają mniejszą ilość DNA i mniejsze rozmiary jądra komórkowego w porównaniu do komórek zwierząt, co utrudnia detekcję i mapowanie pęknięć DNA u drożdży i do tej pory nie była dostępna żadna metoda pozwalająca na dokładną lokalizację dwuniciowych pęknięć DNA generowanych w komórkach drożdży. Po opracowaniu metody BLESS dla

2 komórek ssaków naturalnym krokiem była próba adaptacji tej techniki do komórek drożdży, co stało się głównym celem rozprawy doktorskiej mgr Anny Biernackiej. W pierwszym rozdziale Doktorantka opisała przyczyny powstawania dwuniciowych pęknięć DNA oraz mechanizmy wykrywania i naprawy tych uszkodzeń. Niestety to drugie zagadnienie zostało przedstawione nieco chaotycznie i fragmentarycznie: np. nie wspomniano o udziale innych białek w resekcji końców DNA (np. EXO1, BLM-DNA2, EXD2), nie opisano roli białek Rad52/Brca2 i Rad55/Rad57 w wymianie białek RPA na Rad51 na jednoniciowym końcu DNA, czy wreszcie nie uwzględniono kilku alternatywnym sposobów zakończenia naprawy na drodze homologicznej rekombinacji, tj. SDSA (ang. synthesis-dependent strand annealing), kiedy nie dochodzi do utworzenia podwójnej struktury Holliday'a, czy też rozplątania tej struktury przy udziale kompleksu helikazy i topoizomerazy BLM-TOP3-RMI1-RMI2 (Sgs1-Top3-Rmi1 u S. cerevisiae). Opis ścieżek naprawy dwuniciowych pęknięć DNA powinien być także zilustrowany odpowiednimi schematami. W kolejnym wstępnym rozdziale Doktorantka opisała dotychczas dostępne techniki wykrywania dwuniciowych pęknięć DNA w komórkach, zwracając uwagę na ich zalety i wady. W tej części brakuje mi informacji, które z tych metod można używać u drożdży, np. jakie informacje daje nam zastosowanie PFGE u drożdży, czy możliwy jest do wykonania test kometkowy u drożdży? Warto byłoby wspomnieć o zastosowaniu szczepu drożdży z kolistym chromosomem III, który wchodzi w żel podczas PFGE tylko w formie liniowej powstałej w wyniku dwuniciowego pęknięcia (Ma W, Resnick MA, Gordenin DA, 2008, Nucleic Acids Res 36: ). Opis uzyskanych w pracy wyników został podzielony na trzy części, każda złożona z wstępu, celu pracy, wyników i dyskusji. W związku z tym, że w pracy podjęto trzy wątki badawcze powiązane metodologicznie, ale jednak dotyczące różnych tematów, taki układ pracy jest zasadny. Brakuje mi może tylko jakiegoś końcowego podsumowania i rozważań natury ogólnej dotyczących perspektyw wykorzystania techniki BLESS (zob pytania poniżej). W pierwsza część wyników poświęcona jest opracowaniu metody BLESS dla komórek drożdży. Doktorantka wprowadziła szereg modyfikacji do oryginalnej procedury BLESS stosowanej w komórkach zwierząt i w serii skrupulatnych eksperymentów wykazała, że opracowany przez Nią protokół pozwala z wysoką specyficznością i wydajnością mapować dwuniciowe pęknięcia DNA w genomie drożdży. W drugim etapie badań opracowaną przez Siebie technikę wykorzystała do zbadania uszkodzeń DNA indukowanych przez radiomimetyk zeocynę oraz hydroksymocznik, który generuje stres replikacyjny. W pracy wykazano, że zeocyna generuje uszkodzenia w całym genomie, przy czym zauważono większą częstość pęknięć DNA w regionach stabilnych struktur drugorzędowych lub regionach, w których takie struktury mogą powstawać, czyli w genach trna, promotorach i miejscach inicjacji replikacji. Zastanawiam się jednak czy 2

3 inną przyczyną tego zjawiska może być fakt, że regiony te są również często pozbawione nukleosomów albo chromatyna jest w stanie rozluźnionym. Proszę Doktorantkę o komentarz. W przypadku hydroksymocznika Doktorantka pokazała, że w mutancie mec1 sml1 dwuniciowe pęknięcia generowane są w obrębie miejsc inicjacji replikacji, wskazując że śmiertelność mutanta mec1 sml1 pod wpływem działania hydroksymocznika prawdopodobnie spowodowana jest rozpadem zatrzymanych widełek replikacyjnych. W tym miejscu chciałbym zapytać Doktorantkę jakie zastosowanie może znaleźć technika BLESS u drożdży w przyszłości oraz czy metoda ta ma jakieś ograniczenia, np. w kontekście badania genotoksyczności substancji o nieznanym mechanizmie działania? Czy któryś z etapów procedury BLESS u drożdży jest szczególnie trudny i wymaga unikalnego doświadczenia i praktyki? Jakie ma Pani porady praktyczne i wskazówki, tzw. troubleshootings? Mam też pytanie jakie regiony i struktury zaliczone zostały do grupy stabilnych struktur drugorzędowych (Rys. 20) i w jaki sposób zostały wyznaczone aktywne widełki replikacyjne (Rys. 21)? W kolejnych dwóch rozdziałach Doktorantka przedstawiła wyniki zastosowania techniki BLESS w komórkach ludzkich i mysich. Dzięki analizie pęknięć DNA i dynamiki ich naprawy w komórkach ludzkich linii AsiSI-ER-U20S wykonanej przez Doktorantkę, w połączeniu z szeregiem innych eksperymentów wykonanych w laboratorium prof. Legube (Uniwersytet w Tuluzie, Francja), udało się wykazać, że dwuniciowe pęknięcia DNA powstałe w transkrypcyjnie aktywnych genach w komórkach fazy G1 nie są naprawiane na mutagennej ścieżce niehomologicznego łączenia końców i tworzą charakterystyczne skupiska oczekując na naprawę na drodze homologicznej rekombinacji w kolejnych fazach cyklu komórkowego. Natomiast dwuniciowe pęknięcia DNA w regionach niekodujących lub genach nieaktywnych transkrypcyjnie są wydajnie naprawiane na drodze niehomologicznego łączenia końców i nie tworzą skupisk. Metoda BLESS znalazła również zastosowanie w badaniach nad funkcją wiążących jednoniciowe DNA białek Ssb1 i Ssb2. W ramach współpracy z grupą prof. Khanna (QIMR Berghofer Medical Research Institute, Australia) Doktorantka wykonała eksperymenty przy użyciu techniki BLESS, które wykazały, że w komórkach mysiego szpiku kostnego pozbawionych białek Ssb1 i Ssb2 niestabilność genomu spowodowana jest m.in. przez dwuniciowe pęknięcia DNA, które powstają w miejscach wiązania białek SSB, w tym najczęściej w obrębie genów ulegających transkrypcji. Te i inne wyniki wskazały na kluczową rolę białek Ssb1 i Ssb2 w homeostazie i samoodnawianiu się komórek macierzystych hematopoezy i komórek progenitorowych poprzez ochronę komórek przed endogennymi uszkodzeniami DNA spowodowanymi przez stres replikacyjny. Opisane powyżej wyniki zostały opublikowane w bardzo dobrych czasopismach, więc przeszły już surową ocenę kilku recenzentów. Jest to dowód na wysoki poziom wykonanych badań, ich duże znaczenie dla rozwoju 3

4 podstawowych dziedzin nauki oraz możliwe praktyczne wykorzystanie uzyskanej wiedzy m.in. w diagnostyce i terapiach chorób nowotworowych. W ostatnim rozdziale zatytułowanym Materiały i Metody opisano dokładnie i wyczerpująco wszystkie etapy procedury BLESS w komórkach drożdży i zwierząt, łącznie z sekwencjonowaniem DNA nowej generacji oraz analizą statystyczną końcowych danych. Mam jednak zastrzeżenia do opisu procedury hodowli i indukcji podwójnych pęknięć (Rozdz. 4.3, str. 58, 6 pierwszych wersów od góry). Opis jest nieprecyzyjny i dopiero po przeczytaniu wyników nabrałem przekonania, że zastosowano właściwe warunki hodowli. Mam też pytanie jak monitorowano wydajność synchronizacji komórek drożdży w fazie G1 oraz progresję cyklu komórkowego z fazy G1 do S? Ponadto genotypy szczepów powinny być zapisane kursywą (Tabela 2, str. 57) oraz nie podano składu pożywek YPD i YPR (str. 57). Wywiązując się z obowiązków recenzenta muszę wymienić kilka drobnych błędów i niedociągnięć, które jednak nie mają wpływu na wysoką wartość naukową pracy: str. 3, cyt. "Do spontanicznych pęknięć w komórkach dochodzi rzadko", powinno być "Do spontanicznych pęknięć DNA w komórkach dochodzi rzadko", str. 7, apoptoza i zaprogramowana śmierć komórki nie są synonimami, str. 8, cyt. "W odróżnieniu od ATM, ATR nie jest aktywowana przez DSBs, a przez obecność jednoniciowego DNA", w tym kontekście ATM jest sensorem podwójnych pęknięć DNA i rzeczywiście jest przez nie aktywowana, ale gdy końce pęknięcia zostaną poddane resekcji to kinaza ATR też jest aktywowana i jest niezbędna do odpowiedzi na tego typu uszkodzenia, str. 8, cyt. "Na skutek aktywacji kinazy ATM fosforylowany jest również histon H2AX w obszarach DNA otaczających pęknięcie" a powinno być raczej "w obszarze chromatyny sąsiadującej/po obu stronach pęknięcia", str. 16, cyt. histon H2AX stanowi 2-10% H2A, poprawnie jest 2-10% nukleosomów zawiera wariant sekwencyjny H2AX (zamiast histonu kanonicznego H2A), str. 17, w opisie funkcji fosforylacji H2AX pominięto istotną rolę tej modyfikacji w amplifikacji i podtrzymaniu sygnału o uszkodzeniu w celu zatrzymania cyklu komórkowego, str. 34, cyt. "Delecja SML1 skutkuje supresją ekspresji RSZs (strefy powolnej replikacji)", powinno być "Delecja SML1 skutkuje usunięciem inhibitora reduktazy rybonukleotydowej, co prowadzi do wzrostu poziomu wolnych dntp", niefortunne sformułowania, np. "wykształcone przez człowieka mutagenne związki chemiczne" (str. 1), "nagła fosforylacja" (str. 16), "załamanie lub załamywanie widełek" (wielokrotnie), str. 55, piąty wers od góry powinno być "miejscach startu transkrypcji" a nie "replikacji", 4

5 stosowanie angielskich skrótów i słów: "bp" zamiast "pz" na oznaczenie par zasad, "foci" zamiast "skupiska", "R-loops" zamiast "pętle R, błędne polskie wersje nazw angielskich, np. "digoxigenina" - powinno być "digoksygenina", "duplex" - powinno być "dupleks", "litikaza" - powinno być "litykaza", "α-faktor" - powinno być "czynnik α" albo najlepiej "feromon α", "tamoksyfen" a nie "tamoxifen", brak opisu osi na kilku rycinach, np. Rys. 20, 21, 26A, 28, bibliografia nie została opracowana według jednego wzoru, np. część tytułów zapisana jest wielką literą, a łacińskie nazwy gatunkowe nie są zapisane kursywą, brak wykazu skrótów. Na koniec chciałbym przedyskutować z Doktorantką, które tłumaczenie słów "DNA double-strand break jest lepsze/bardziej poprawne, czy używane w pracy "podwójne pęknięcia DNA" czy preferowane przeze mnie "dwuniciowe pęknięcia DNA" albo np. "pęknięcie obu nici DNA"? Wniosek końcowy Uważam, że przedstawiona mi do oceny praca doktorska w pełni odpowiada ustawowym wymogom stawianym rozprawom doktorskim określonym w art. 13 ust. 1 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. z 2016 r. poz. 882), i składam wniosek do Rady Naukowej Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN o dopuszczenie mgr Anny Biernackiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Ze względu na wysoką wartość naukową i innowacyjność uzyskanych wyników oraz ich częściowe opublikowanie w prestiżowych czasopismach, tj. Shi W. i wsp. (2017) Blood 129(18): (IF ) oraz Aymard F. i wsp. (2017) Nat. Struct. Mol. Biol. 24(4): (IF ), składam również wniosek o wyróżnienie rozprawy doktorskiej mgr Anny Biernackiej. Prof. dr hab. Robert Wysocki 5