MIĘDZYGATUNKOWE MIESZAŃCE SOMATYCZNE ZIEMNIAKA

Transkrypt

1 1 Genetyka i hodowla MIĘDZYGATUNKOWE MIESZAŃCE SOMATYCZNE ZIEMNIAKA dr Anna Szczerbakowa Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, ul. Pawińskiego 5a, Warszawa annasz@ibb.waw.pl Współczesne odmiany ziemniaka uprawnego powstawały w ciągu dziesięcioleci w procesach hodowlanych w wyniku krzyżowań generatywnych, w tym również z gatunkami dzikimi. Jednakże odrębność gatunków zawęża możliwości krzyżowań międzygatunkowych do gatunków spokrewnionych i nie pozwala na szerokie wykorzystanie puli genowej Solanum do ulepszania np. cech odporności ziemniaka na choroby. Barierę krzyżowalności można ominąć, stosując metodę somatycznej hybrydyzacji, która polega na połączeniu (fuzji) protoplastów izolowanych z komórek somatycznych i wyprowadzeniu z nich mieszańców. Protoplasty poddane fuzji tworzą heterokariony (komórki powstałe z połączenia protoplastów dwóch różnych gatunków) o różnej proporcji DNA: symetryczne o jednakowej ilości DNA z protoplastów obu rodziców, asymetryczne o różnej ilości DNA z protoplastów obu rodziców lub cybrydy, zawierające DNA jądrowe z protoplastu jednego z rodziców, a chloroplasty i mitochondria z obu. Hybrydyzacja somatyczna daje możliwości przeprowadzenia bardzo dużej liczby kombinacji międzygatunkowych niezależnie od stopnia pokrewieństwa, ploidalności i płodności łączonych gatunków. Doskonalenie metod regeneracji i selekcji mieszańców somatycznych o pożądanych cechach pozwala otrzymywać mieszańce w ciągu pół roku od momentu przeprowadzenia fuzji protoplastów. Metoda hybrydyzacji somatycznej jest jednak obarczona niedogodnościami, które zostaną omówione poniżej. Głównymi etapami hybrydyzacji somatycznej są: (1) izolacja protoplastów z form rodzicielskich, (2) fuzja protoplastów i selekcja mieszańców, (3) kultura i regeneracja mieszańców, (4) weryfikacja mieszańców i analiza dziedziczenia cech (Wielgat, Wasilewska 2001). Protoplasty otrzymuje się najczęściej z miękiszu liści po strawieniu ścian komórkowych odpowiednimi enzymami. Maceracja enzymatyczna jest możliwa jedynie w przypadku roślin z hodowli in vitro na odpowiednich pożywkach. U roślin polowych lub szklarniowych ściany komórkowe nie są podatne na trawienie przy użyciu enzymów w stężeniu nie uszkadzającym samej komórki. Podstawą uzyskiwania regenerantów z pojedynczych komórek somatycznych jest właściwość totipotencji roślin, tzn. możliwość regeneracji całej rośliny z dowolnej, wyodrębnionej komórki. Stopień totipotencji roślin odmian ziemniaka jest na ogół wyższy w porównaniu z totipotencją roślin dzikich gatunków, np. S. bulbocastanum i S. pinnatisectum, przy zastosowaniu tych samych warun-

2 2 Ziemniak Polski 2008 nr 1 ków izolacji i regeneracji. W przypadku fuzji międzygatunkowych połączone protoplasty różnych gatunków wytwarzają merystemy, nawet gdy protoplasty jednego z gatunków rodzicielskich nie są do tego zdolne. Brak totipotencji ułatwia selekcję mieszańców międzygatunkowych, wykluczając obecność roślin dzikiego gatunku wśród regenerantów. Względna łatwość otrzymywania i fuzji protoplastów roślinnych nie oznacza automatycznie sukcesu w regeneracji roślin mieszańcowych w warunkach in vitro. Szybkość i skuteczność regeneracji zależy m. in. od ilości i jakości użytych protoplastów, o czym decydują wiek i morfologia roślin rodzicielskich, oraz od totipotencji ich komórek. Za pośrednictwem fuzji chemicznej lub fuzji w polu elektrycznym (elektrofuzji) można łączyć protoplasty dowolnych, nie spokrewnionych gatunków, omijając bariery krzyżowalności międzygatunkowej. Jednakże w wielu wypadkach proces regeneracji zatrzymuje się na etapie kilku podziałów heterokarionu lub na etapie nie różnicującego się kalusa (tzn. zespołu komórek powstałych z kolejnych podziałów heterokarionu). Etap kalusa zwykle decyduje o powodzeniu regeneracji, ponieważ wtedy powstają (lub nie) merystemy zarodkowe, dające początek pędom, po odcięciu i ukorzenieniu których otrzymujemy regeneranty mieszańcowe, zawierające genomy obydwóch rodziców (fot. 1). Z każdego różnicującego się kalusa zwykle odcina się jeden pęd, z którego po ukorzenieniu i namnożeniu powstaje jeden klon. Fot. 1. Otrzymywanie mieszańców somatycznych. A: heterokarion (strzałka) w 1. dniu po fuzji protoplastów, powiększenie 500 ; B: powstawanie pędu (strzałka) na kalusie w 8. tygodniu po fuzji, powiększenie 4 ; C: mieszaniec somatyczny pomiędzy psianką czarną (nie wytwarza bulw) a ziemniakiem uprawnym, klon NT Wstępnej identyfikacji mieszańców dokonuje się na podstawie mieszanej morfologii uzyskanych regenerantów (Szczerbakowa i in. 2003b). Udowodnienie mieszańcowości odbywa się na podstawie analizy DNA mieszańców w porównaniu z DNA form rodzicielskich. Opisując pochodzenie zweryfikowanych mieszańców somatycznych, stosujemy symbol + pomiędzy formami rodzicielskimi (P1 + P2), zamiast symbolu (P1 P2) używanego do oznaczania pochodzenia mieszańców generatywnych. Względna łatwość oraz szybkość metody hybrydyzacji somatycznej (regeneranty można otrzymać w ciągu dwóch miesięcy od dnia przeprowadzenia fuzji) decydują o jej atrakcyjności w otrzymywaniu mieszańców pomiędzy różnymi, nawet oddalonymi gatunkami. Atutem mieszańców somatycznych, w porównaniu z generatywnymi, jest posiadanie cytoplazmy pochodzącej od obydwóch rodziców, co może być ważne w przekazywaniu cech ko-

3 3 dowanych przez DNA chloroplastowe i mitochondrialne. Mankamentem zaś jest częściowa lub pełna sterylność mieszańców somatycznych, wynikająca z odległego pokrewieństwa form rodzicielskich. Trudności w otrzymywaniu generatywnego potomstwa mieszańców somatycznych ziemniaka są częściowo rekompensowane wegetatywnym rozmnażaniem ziemniaka i możliwością namnożenia wartościowego materiału mieszańcowego poprzez bulwy. Hybrydyzacja somatyczna dwóch różnych diploidalnych (2x) gatunków ziemniaka zwykle prowadzi do powstania mieszańców o różnej ploidalności, zarówno spodziewanych tetraploidów (4x), jak i heksaploidów (6x) oraz rozmaitych aneuploidów, które utraciły od kilku do kilkunastu chromosomów w ciągu wieloetapowego procesu regeneracji protoplastów. Wśród regenerantów znajdują się również chimery rośliny odznaczające się mozaikowatością tkanek o różnym pochodzeniu i różnej ploidalności. Selekcja stabilnych mieszańców symetrycznych i mniej stabilnych, ale wartościowych mieszańców asymetrycznych na podstawie cytologicznego obrazu chromosomów jest trudna, gdyż chromosomy ziemniaka i spokrewnionych z nim gatunków są bardzo małe i słabo zróżnicowane. Dlatego mieszańce identyfikuje się za pomocą techniki cytometrii przepływowej, pozwalającej ocenić ploidalność na podstawie zawartości jądrowego DNA. Metoda hybrydyzacji somatycznej zyskiwała coraz większą popularność od końca lat 70. XX wieku. Synteza mieszańców somatycznych pomiędzy oddalonymi, nie krzyżującymi się w środowisku naturalnym gatunkami wydawała się niezmiernie atrakcyjnym sposobem korzystania z zasobów genowych roślin dzikich dla tworzenia nowych odmian roślin uprawnych. Metoda ta, operując komórkami somatycznymi, rozszerza granice krzyżowań międzygatunkowych możliwych do przeprowadzenia metodami genetyki klasycznej, wzbogaca germplazmę roślin uprawnych, wykorzystuje zmienność pierwotną odległych gatunków, nie potrzebuje genów markerowych do selekcji mieszańców, nie budzi oporu społecznego i zastrzeżeń etycznych jak w przypadku roślin genetycznie modyfikowanych (GMO). Jest szczególnie przydatna w przekazywaniu do roślin uprawnych, w tym ziemniaka, cech determinowanych zarówno przez geny główne, jak i tzw. geny mniejsze, warunkujące cechy ilościowe, np. odporności na niektóre choroby (zaraza ziemniaka) lub czynniki abiotyczne (mróz czy susza). Przykładem może być wprowadzenie do ziemniaka uprawnego trwałej niespecyficznej (horyzontalnej) odporności na zarazę z meksykańskiego dzikiego diploidalnego gatunku S. bulbocastanum poprzez syntezę płodnego odpornego mieszańca somatycznego, a następnie serię krzyżowań z ziemniakiem uprawnym (Helgeson i in. 1998). W pracy przeglądowej Wielgat i Wasilewskiej (2001) zostały podsumowane dane dotyczące prób międzygatunkowej hybrydyzacji somatycznej ziemniaka wykonanych od końca lat 70. do końca lat 90. XX wieku. W cytowanych pracach jako źródła odporności na choroby oraz czynniki abiotyczne występują zarówno dzikie gatunki wytwarzające bulwy (S. acaule, S. berthaultii, S. bulbocastanum, S. chacoense, S. circaeifolium, S. commersonii, S. papita, S. phureja, S. pinnatisectum, S. torvum), jak i gatunki nie wytwarzające bulw (S. brevidens, S. etuberosum, S. nigrum). W pierwszych latach XXI wieku ukazały się nowe doniesienia dotyczące syntezy odpornych na różne choroby międzygatunkowych mieszańców somatycznych ziemniaka z dzikimi gatunkami. Na przykład odporność na alternariozę z dzikiego diploidalnego gatunku S. brevidens wprowadzono do ziemniaka uprawnego poprzez krzyżowania generatywne pomiędzy wcześniej wyselekcjonowanym mieszańcem somatycznym S. tuberosum (+) S. brevidens (Austin i in. 1986) i odmianami Katahdin oraz Atlantic użytymi jako zapylacze (Tek i in. 2004). Wykorzystywanie techniki hybrydyzacji somatycznej w badaniach genetycznych oraz w hodowli ziemniaka uprawnego zostało omówione w pracy przeglądowej Orczyka i innych (2003). Na podstawie obszernie cytowanej literatury światowej autorzy odnotowali szczególne osiągnięcia zastosowania tej metody, m. in. w przypadku introgresji kompleksowej odporności na choroby z dzikiego gatunku S. brevidens (odporność na wirusy A, X, Y i liściozwoju ziemniaka, na mokrą zgniliznę bulw i

4 4 Ziemniak Polski 2008 nr 1 zarazę ziemniaka) oraz tolerancji na mróz i zdolności adaptacji do niskiej temperatury z S. commersonii do pokoleń generatywnych międzygatunkowych mieszańców somatycznych. Autorzy podkreślili ważność tej metody dla syntezy tetraploidalnych linii ziemniaka hodowlanego z nowymi kombinacjami cech właściwych dla wyjściowych linii di(ha)ploidalnych. Niestabilność genetyczna oraz sterylność są głównymi przyczynami ograniczonego wykorzystania mieszańców somatycznych pomiędzy taksonomicznie odległymi gatunkami Solanum jako źródła nowej zmienności genetycznej w programach hodowlanych ziemniaka. Na przykład w wypadku mieszańców S. nigrum (+) S. tuberosum, skrajnie odpornych na różne szczepy Phytophthora infestans o szerokim spektrum wirulencji (Zimnoch-Guzowska i in. 2003), krzyżowania generatywne z ziemniakiem uprawnym dotychczas nie doprowadziły do uzyskania dojrzałych nasion. W mieszańcach somatycznych ziemniaka diploidalnego ze spokrewnionymi diploidalnymi dzikimi gatunkami wytwarzającymi bulwy (Szczerbakowa i in. 2003a) często jest obserwowane obniżenie odporności na czynnik chorobotwórczy w porównaniu z odpornością dzikiego gatunku rodzicielskiego. W takich wypadkach krzyżowania generatywne z odpowiednio dobranymi zapylaczami powinny prowadzić do uzyskania dojrzałych nasion i otrzymania w potomstwie form o podwyższonej odporności. Podobnie jak krzyżowania generatywne pomiędzy różnymi gatunkami/odmianami roślin powszechne w praktyce hodowlanej krzyżówki somatyczne pozwalają rozszerzyć pulę genową roślin uprawnych, korzystając z naturalnych zasobów genowych mniej lub bardziej spokrewnionych roślin dzikich o cechach pożądanych przez hodowców, przede wszystkim ich naturalnej odporności na choroby. Szybkie zmiany w populacjach czynników chorobotwórczych w następstwie zmian klimatycznych i cywilizacyjnych, globalny wzrost produkcji żywności i jednoczesny wzrost kosztów ochrony roślin uprawnych przed chorobami, dążenie konsumentów do spożywania zdrowej i bezpiecznej żywności oraz próby ograniczania użycia chemicznych środków ochrony roślin dyktują potrzebę korzystania z mechanizmów obronnych wykształconych przez poszczególne dzikie gatunki roślin. Oczywiście, niektóre z tych mechanizmów prowadzą do wytwarzania związków niekorzystnych w roślinach uprawnych. Jednak zróżnicowany charakter mechanizmów obronnych pozwala mieć nadzieję na wyodrębnienie bezpiecznych ich składników, które po wprowadzeniu do mieszańców roślin uprawnych będą je skutecznie chronić przed chorobami lub szkodnikami. Synteza i badanie właściwości oddalonych mieszańców roślin uprawnych z wykorzystaniem techniki hybrydyzacji somatycznej, przyspieszającej i upraszczającej tworzenie mieszańców, jest jednym z ważnych etapów w poznawaniu i gromadzeniu wiedzy na temat funkcjonowania i praktycznego wykorzystywania naturalnych mechanizmów obronnych roślin. Literatura 1. Austin S., Ehlenfeldt M. K., Baer M. A., Helgeson J. P Somatic hybrids produced by protoplast fusion between Solanum tuberosum and Solanum brevidens: phenotypic variation under field conditions. Theor. Appl. Genet. 71: ; 2. Helgeson J. P., Pohlman J. D., Austin S., Haberlach G. T., Wielgus S. M., Ronis D., Zambolim L., Tooley P., McGrath J. M., James R. V., Stevenson W. R Somatic hybrids between Solanum bulbocastanum and potato: a new source of resistance to late blight. Theor. Appl. Genet. 96: ; 3. Orczyk W., Przetakiewicz J., Nadolska-Orczyk A Somatic hybrids of Solanum tuberosum application to genetics and breeding. Plant Cell Tissue Organ Cult. 74: 1-13; 4. Szczerbakowa A., Bołtowicz D., Lebecka R., Radomski P., Wielgat B. 2003a. Characteristics of the interspecific somatic hybrids Solanum pinnatisectum (+) S. tuberosum H Acta Physiol. Plant. 27: ; 5. Szczerbakowa A., Borkowska M., Wielgat B Plant regeneration from the protoplasts of Solanum tuberosum, S. nigrum and S. bulbocastanum. Acta. Physiol. Plant. 22: 3-10; 6. Szczerbakowa A., Maciejewska U., Zimnoch-Guzowska E., Wielgat B. 2003b. Somatic hybrids Solanum nigrum (+) S. tuberosum: morphological assessment and verification of hybridity. Plant Cell Rep. 21: ; 7. Tek A. L., Stevenson W. R., Helgeson J. P., Jiang J Transfer of tuber soft rot and early blight resistances from Solanum brevidens into cultivated potato. Theor. Appl. Genet. 109: ; 8. Zimnoch- -Guzowska E., Lebecka R., Kryszczuk A., Maciejew-

5 5 ska U., Szczerbakowa A., Wielgat B Resistance to Phytophthora infestans in somatic hybrids of Solanum nigrum L. and diploid potato. Theor. Appl. Genet. 107: 43-48; 9. Wielgat B., Wasilewska D Hybrydyzacja somatyczna pomiędzy dzikimi i uprawnymi gatunkami ziemniaka. Biotechnologia 2: 9-15