Metoda produkcji wysokiej jakości materiału rozmnożeniowego czosnku z zastosowaniem kultur in vitro.

Transkrypt

1 zadanie 1.5 System oceny jakości, zdrowotności, czystości odmianowej i tożsamości genetycznej roślin ogrodniczych rozmnażanych metodą in vitro Metoda produkcji wysokiej jakości materiału rozmnożeniowego czosnku z zastosowaniem kultur in vitro. W. Kiszczak, T. Orlikowska, K. Górecka, T. Malinowski, A. Wojtania M. Markiewicz, U. Kowalska

2 Znaczenie wysoki popyt -wysokie ceny tys. ton (3 tys. ha) działanie farmakologiczne wysokie walory przyprawowe zawodna uprawa drogi materiał sadzeniowy Poznań Zielona Góra Błonie Nowy Dwór Mazowiecki Ożarów Mazowiecki Zamość

3 Cel materiał nasadzeniowy wirusy: OYDV (Onion yellow dwarf virus), LYSV (Leek yellow stripe virus), SLV (Shallot latent virus), GCLV (Garlic common latent virus), GarV-X (Garlic virus X), ShV-X (Shallot virus X), GarV-A (Garlic virus A), GarV-B (Garlic virus B), GarV-C (Garlic virus C), GarV-D (Garlic virus D), GarMbMV (Garlic mite-borne mosaic virus), IYSV (Iris yellow spot virus), GYSV (Garlic yellow streak virus), GCLV (Garlic common latent irusv) Już przy współdziałaniu dwóch wirusów może dojść do straty plonu nawet o 78% (Fidan i in. 2009).

4 cel brak chemicznej metody in vitro WIRUSY w ramach Zadania 1.5 Programu Wieloletniego prowadzono badania nad opracowaniem technologii wytwarzania metodami in vitro wolnego od wirusów materiału nasadzeniowego czosnku, uwzględniającą ocenę zdrowotności i tożsamości genetycznej.

5 Metodyka MATERIAŁ ROŚLINNY Ornak Jarus Krakowska Hodowla i Nasiennictwo Ogrodnicze POLAN Spółka z o.o. WARUNKI IN VITRO OBECNOŚĆ WIRUSÓW STERYLIZACJA OCENA ZDROWOTNOŚCI CEBULOWANIE INICJACJA I STABILIZACJA ODWIRUSOWYWANIE TOŻSAMOŚĆ GENETEYCZNA REGENERACJA

6 Fot. 1 Fot. 3 WYNIKI Konferencja "Dziś i jutro fitopatologii r. Olsztyn LYSV żółtej pasiastości pora Fot. 2 SLV utajony szalotki Fot. 4 OYDV żółtej karłowatości cebuli IYSV żółtej plamistości irysa Fot. 1,2 Pappu et al doi: /php rs. Fot. 3 Parrano et al. 2012, doi: Fot. 4 Gent D. H., Ocamb C. M. 2017,

7 WYNIKI - wyjaławianie Odmiana Sposób wyjaławiania Liczba wyłożonych merystemów Liczba niezakażonych merystemów % czystych kultur Ornak I ,7 II ,0 III ,5 Jarus I ,5 II ,3 III ,7 } I- 2 godziny 5% PPM, II - 10 min. w 5% podchlorynie wapnia CaClO 2 +Tween 20 płukanie III 2 min. 70% etanolem, 3 x sterylna woda zadanie 1.5 System oceny jakości, zdrowotności, czystości odmianowej i tożsamości genetycznej roślin ogrodniczych rozmnażanych metodą in vitro

8 Eksplant wyjściowy - fragmenty mięsistych łusek z merystemem i częścią piętki wycinane z cebul tzw.,,twin scales. Pozywka inicjalna - B5 (Gamborg 1968): 30 g sacharozy/l 10 mg/l kinetyny, 0,1 mg/l NAA ph 5,6 zadanie 1.5 System oceny jakości, zdrowotności, czystości odmianowej i tożsamości genetycznej roślin ogrodniczych rozmnażanych metodą in vitro

9 Rybawiryna WYNIKI odwirusowywanie odm. Ornak sposób odwirusowywania kultury wszystkie wolne zawirusowane szt. szt. % szt. % kontrola warunki in vitro termoterapia chemioterapia dni fitotron 10 mg/l +40 o C zadanie 1.5 System oceny jakości, zdrowotności, czystości odmianowej i tożsamości genetycznej roślin ogrodniczych rozmnażanych metodą in vitro

10 Rybawiryna WYNIKI odwirusowywanie odm. Jarus sposób odwirusowywania kultury wszystkie wolne zawirusowane szt. szt. % szt. % kontrola warunki in vitro termoterapia chemioterapia dni fitotron 10 mg/l +40 o C +40 o C zadanie 1.5 System oceny jakości, zdrowotności, czystości odmianowej i tożsamości genetycznej roślin ogrodniczych rozmnażanych metodą in vitro

11 Wyniki tożsamość genetyczna startery największy polimorfizm pozwalający na różnicowanie badanych odmian w największym stopniu Analiza AFLP Analiza ISSR 5 STARTERÓW 5 STARTERÓW Pst-TC/Mse-TC Pst-AA/Mse-AC Pst-CC/Mse-CC Pst-CC/Mse-GG Pst-TT/Mse-CC

12 Rybawiryna Rybawiryna Analiza ISSR WYNIKI odwirusowywanie na zmienność genetyczną odm. Ornak brak zmienności brak zmienności +40 o C Analiza AFLP +40 o C zmienność 2,8% zmienność 4%

13 WYNIKI regeneracja odm. Jarus Kategoria namnożenia Rodzaj pożywki (%) Cz-1* Cz-2* Cz-1* Cz-2* Rozeta ziel. prawidł. ukorz. 0,0 30,4 30,0 38,1 Rozeta ziel. prawidł. 40,0 13,0 0,0 23,8 Rozeta żółto/zielona 0,0 4,3 5,0 0,0 Rozeta żółta 0,0 0,0 0,0 0,0 Rozeta kalusowa ta 0,0 0,0 0,0 0,0 Zielony zaczątek rozety 10,0 0,0 20,0 4,8 Rozeta ziel. nie w pełni wykształcone. 0,0 8,7 5,0 0,0 Rozeta żółta nie w pełni wykształcona 0,0 0,0 0,0 0,0 Kalus zielony 0,0 0,0 5,0 4,8 Rozeta zamarła 15,0 0,0 15,0 0,0 Zamarły zaczątek rozety 25,0 26,1 10,0 14,3 Kalus zamarły 10,0 17,4 10,0 9,5 Liczba probówek szt Cz -1 ; 10 mg/l kinetyny Cz-2; 0,5 mg/l 2iP zadanie 1.5 System oceny jakości, zdrowotności, czystości odmianowej i tożsamości genetycznej roślin ogrodniczych rozmnażanych metodą in vitro MS B5

14 WYNIKI regeneracja odm. Jarus Kategorie namnożeń Odczyn ph 5,6 5,8 Rozeta ziel. prawidł. ukorz. 9,1 22,7 Rozeta ziel. prawidł. 0,0 4,5 Rozeta żółto/zielona 0,0 0,0 Rozeta żółta 0,0 0,0 Rozeta kalusowa ta 0,0 0,0 Zielony zaczątek rozety 18,2 18,2 Rozeta ziel. nie w pełni wykształ. 0,0 0,0 Rozeta żółta nie w pełni 0,0 0,0 wykształcona Kalus zielony 0,0 9,1 Rozeta zamarła 13,6 13,6 Zamarły zaczątek rozety 18,2 36,4 Kalus zamarły 31,8 4,5 Liczba probówek szt zadanie 1.5 System oceny jakości, zdrowotności, czystości odmianowej i tożsamości genetycznej roślin ogrodniczych rozmnażanych metodą in vitro

15 WYNIKI regeneracja odm. Jarus B5-Cz-2 B5-Cz-4 B5-Cz-5 B5-Cz-6 B5-Cz-7 B5-Cz-2*; 10mg/L Kin 0,1mg/L NAA B5-Cz-4*;1mg/L BAP, 0,1% PPM B5-Cz-5*; 1mg/L TDZ, 1mg/L NAA, 0,1% PPM B5-Cz-6*; 0,1mg/L TDZ, 0,1mg/L NAA, 0,1% PPM B5-Cz-7*; 10mg/L Kin, 0,1mg/L NAA, 0,1% PPM zadanie 1.5 System oceny jakości, zdrowotności, czystości odmianowej i tożsamości genetycznej roślin ogrodniczych rozmnażanych metodą in vitro

16 WYNIKI regeneracja odm. Jarus Kategorie namnożeń Rodzaj pożywki B5-Cz-2* B5-Cz-4* B5-Cz-5* B5-Cz-6* B-5Cz-7* Rozeta ziel. prawidł. ukorz. 11,7 21,3 1,7 10,0 5,0 Rozeta ziel. prawidł. 30,0 16,4 41,7 28,3 21,7 Rozeta żółto/zielona 1,7 3,3 6,6 11,7 8,3 Rozeta zółta 1,7 0,0 0,0 0,0 0,0 Rozeta kalusowata 6,7 0,0 1,7 0,0 3,3 Zielony zaczątek rozety 15,0 19,7 5,0 15,0 16,7 Rozeta ziel. nie w pełni wykształ. 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Rozeta żółta nie w pełni wykształ. 5,0 3,3 0,0 1,7 3,3 Kalus żółty 0,0 3,3 3,3 0,0 1,7 Kalus zielony 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Rozeta zamarła 8,3 4,9 11,7 1,7 0,0 Zamarły zaczątek rozety 15,0 13,1 13,3 13,3 21,7 Kalus zamarły 10,0 16,7 16,7 20,0 11,7 Liczba probówek zadanie 1.5 System oceny jakości, zdrowotności, czystości odmianowej i tożsamości genetycznej roślin ogrodniczych rozmnażanych metodą in vitro

17 WYNIKI kontaminacja bakteriami Etap - Inicjacja, Stabilizacja 27 izolatów 13 ORNAK 14 - JARUS Najczęściej izolowaną bakterią była Microbacterium testaceum Etap - Regeneracja Biocydy: PPM Chloramfenikol Rifampicyna Tobramycyna Cetrimid I pasaż Wszystkie wpływały ujemnie na kondycję kultur i wydajność namnażania czosnku odmiany Ornak. II pasaż pozytywny efekt PPM 0,4 % i rifampicyna 50 mg/l - zwiększenie liczby pędów - biocydy stymulowały tworzenie zaczątków pędów, najbardziej chloramfenikol 30 mg/l i rifampicyna zadanie 1.5 System oceny jakości, zdrowotności, czystości odmianowej i tożsamości genetycznej roślin ogrodniczych rozmnażanych metodą in vitro

18 Rozeta WYNIKI cebulowanie odm. Jarus Rodzaj eksplantatu B5-Cz-2 B5-Cz-4 B5-Cz-5 B5-Cz-6 B-5Cz-7 z zacz. cebul i korzeniem 2,4 5,6 1,9 21,1 21,4 bez korzenia 41,0 27,8 31,1 36,8 26,8 kalusowata 1,2 11, zaczątek 24,1 50,0 52,8 34,2 37,5 zdeformowana 12,0 5,6 0,9 2,6 1,8 Kalus 19,3 0,0 13,2 5,3 12,5 Liczba probówek B5-Cz-2*; 10mg/L Kin 0,1mg/L NAA B5-Cz-4*;1mg/L BAP, 0,1% PPM B5-Cz-5*; 1mg/L TDZ, 1mg/L NAA, 0,1% PPM B5-Cz-6*; 0,1mg/L TDZ, 0,1mg/L NAA, 0,1% PPM B5-Cz-7*; 10mg/L Kin, 0,1mg/L NAA, 0,1% PPM zadanie 1.5 System oceny jakości, zdrowotności, czystości odmianowej i tożsamości genetycznej roślin ogrodniczych rozmnażanych metodą in vitro

19 Cel zadania 1.5 na rok 2017 Celem zadania było opracowanie systemu oceny zdrowotności, tożsamości genetycznej i kondycji fizjologicznej wybranych roślin ogrodniczych rozmnażanych in vitro (truskawki, maliny, jagody kamczackiej, czosnku) na etapie ukorzeniania pędów in vitro. JAGODA KAMCZACKA, MALINA, TRUSKAWKA Cel na 2017 zrealizowano w 100 %

20 Etap III 2017 r. Cele szczegółowe dla podzadań 1. Ukorzenianie metodą in vitro (w przypadku czosnku także proces formowania cebul) truskawki, maliny, jagody kamczackiej, czosnku; 2. Ocena zdrowotności pod względem obecności patogenicznych wirusów, bakterii i grzybów materiału roślinnego w trakcie ukorzeniania metodą in vitro truskawki, maliny, jagody kamczackiej, czosnku; 3. Wykrywanie i eliminacja zanieczyszczeń mikrobiologicznych w trakcie ukorzeniania metodą in vitro truskawki, maliny, jagody kamczackiej, czosnku; 4. Ocena wzrostu i rozwoju roślin truskawki, maliny, jagody kamczackiej, czosnku oraz ich kondycji fizjologicznej podczas ukorzeniania metodą in vitro; 5. Ocena tożsamości genetycznej roślin truskawki, maliny, jagody kamczackiej, czosnku podczas ukorzeniania metodą in vitro.

21 Podzadanie 1 Ukorzenianie metodą in vitro truskawki, maliny, jagody kamczackiej Gatunek/odmiana Pożywka/rodzaj i stężenie auksyny [mg L - 1 ] % ukorzenionych pędów Liczba korzeni/pęd Jagoda kamczacka Pożywka MS (1962) 'Zojka' 'Wojtek' + 4,0 IBA + 2,5 IAA + 4,0 IBA ,2 3,9 Malina Pożywka MS (1962) 'Polana' 'Polka' + 0,75 IBA + 0,75 IBA ,8 8,4 Truskawka 'Selva' Pożywka MS (1962) IBA ,0 'Grandarosa' Pożywka wg Boxusa (1962) + 0,1 IBA ,4

22 Wpływ pożywki stężenia IBA na ukorzenianie in vitro jagody kamczackiej odm. Wojtek 0,1 mg. L -1 1,0 mg. L -1 2,5 mg. L -1 4,0 mg. L -1 IBA odm. Zojka 0,1 mg. L -1 1,0 mg. L -1 2,5 mg. L -1 4,0 mg. L -1 IBA

23 Wpływ pożywki mineralnej na ukorzenianie i jakość pędów truskawki odm. Selva i Grandarosa'

24 Podzadanie 2 Ocena zdrowotności pod względem obecności patogenicznych wirusów, bakterii i grzybów materiału roślinnego w trakcie ukorzeniania metodą in vitro truskawki, maliny, jagody kamczackiej Gatunek /odmiana Wykaz badanych wirusów/grzybów Metoda wykrywania Obecność patogena Malina 'Polka' 'Polana Phytophthora Technika RT- PCR Nie stwierdzono Truskawka 'Grandarosa' 'Selva' Wirusy- SMoV, SCrV, SMYEV, SVBV Technika RT- PCR Czosnek pospolity 'Ornak' 'Jarus' Wirusy SLV, LYSV, GCLV i OYDV Technika RT- PCR Nie stwierdzono Jagoda kamczacka 'Zojka' 'Wojtek Wirus CaMV Technika RT- PCR Nie stwierdzono

25 Podzadanie 3 Wykrywanie i eliminacja zanieczyszczeń mikrobiologicznych w trakcie ukorzeniania metodą in vitro truskawki, maliny, jagody kamczackiej, czosnku; Wykryto bakterie w malinach Eliminacja zanieczyszczeń bakteryjnych z kultur maliny przy podaniu biocydów w podciśnieniu Wykonano 5 doświadczeń, których celem było opracowanie sposobu podawania biocydów w podciśnieniu dla wyeliminowania bakterii z kultur namnożeniowych maliny. Zastosowano 5 biocydów w różnych stężeniach. Jedynym, który skutecznie eliminował bakterie z eksplantatów pędowych był HgCl 2 w stężeniach 0,05 i 0,1%. Poniżej podano najbardziej obiecujące wyniki.

26 Podzadanie 3 Wykryto bakterie w malinach Eliminacja zanieczyszczeń bakteryjnych z kultur maliny przy podaniu biocydów w podciśnieniu Biocydy Powtórzenie I Powtórzenie II Powtórzenie III % żywych % bez bakterii % żywych % bez bakterii % żywych woda PPM 0.2 % Rifampicyna 50 mg/l NaOCl % HgCl % % bez bakterii

27 stopień polimorfizmu [%] Podzadanie 5 Ocena tożsamości genetycznej roślin truskawki, maliny, jagody kamczackiej, czosnku podczas ukorzeniania metodą in vitro. zmienność genetyczna pod wpływem pożywki - TRUSKAWKA Kontrola pożywka Boxus a 100% N, 40g glukozy IBA 0 mg/l IBA 0,1 mg/l IBA 1,0 mg/l IBA 0 mg/l IBA 0,1 mg/l IBA 1,0 mg/l IBA 0,1 mg/l IBA 1,0 mg/l IBA 0 mg/l IBA 0,1 mg/l IBA 1,0 mg/l 100% N 50% N 100% N + glukoza 40g 50% N + glukoza 40g Selva Grandarosa SELVA AFLP ŚREDNI stopień zmienności 0,8% najwyższy na pożywce 100%N, bez cukru oraz IBA. GRANDAROSA ŚREDNI stopień zmienności - 3,2 % AFLP najwyższy na pożywce 100%N i IBA 0,1mg/L.

28 stopień polimorfizmu [%] Podzadanie 5 zmienność genetyczna pod wpływem pożywki JAGODA KAMCZACKA Kontrola Pożywka MS 100%N, sacharoza 30g). 0 0,1 mg/l 4,0 mg/l 0,1 mg/l 4,0 mg/l 0,1 mg/l + 0,1 mg/l 1,0 mg/l + 1,0 mg/l 2,5 mg/l + 4,0 mg/l 0,1 mg/l + sacharoza 30 g/l 0,1 mg/l + glukoza 30g/L 15 C 23 C IBA IAA IBA + IAA NAA IBA 0,5 mg/l + 50% KNO3, NH4NO3 Zojka Wojtek WOJTEK ŚREDNI stopień zmienności AFLP ISSR 0,7 % 3,6 % Najwyższy na pożywce NAA 0,1mg/L + sacharoza 30g/L ZOJKA ŚREDNI stopień zmienności AFLP ISSR 1,0% 11,8 % Najwyższy na pożywce IBA 0,5mg/L + 50%N, temp. 23 C

29 Malinowski T., Kowalska U., Kiszczak W., Górecka K: Próba uwolnienia od wirusów dwóch polskich odmian czosnku. Konferencja Dziś i jutro fitopatologii. Olsztyn, września 2017 r. Cieślińska M: Zróżnicowanie genetyczne izolatów wirusa krzaczastej karłowatości maliny (Raspberry bushy dwarf virus, RBDV). Konferencja Dziś i jutro fitopatologii. Olsztyn, września 2017 r. Orlikowska T, Malinowski T, Trzewik A: Nowatorskie sposoby ograniczania zanieczyszczeń bakteryjnych w kulturach in vitro maliny EUROBIOTECH 2017, Kraków Sowik I., Wojtania A., Markiewicz M: Wpływ zróżnicowanego poziomu węglowodanów i KNO 3 na aktywność fotosyntetyczną i tworzenie pędów Fragaria ananasa 'Selva' i 'Grandarosa' w warunkach in vitro. Konferencja Ziemia Roślina Człowiek Jubileusz 30-lecia Polskiego Towarzystwa Nauk Ogrodniczych, Kraków Kiszczak W., Kowalska U., Górecka K.: Badania nad mikrorozmnażaniem czosnku. Konferencja Ziemia Roślina Człowiek Jubileusz 30-lecia Polskiego Towarzystwa Nauk Ogrodniczych, Kraków Markiewicz M., Gabryszewska E., Góraj-Koniarska J: Ocena tożsamości genetycznej jagody kamczackiej (Lonicera caerulea) podczas opracowywania metodyki rozmnażania w warunkach in vitro. Konferencja Ziemia Roślina Człowiek Jubileusz 30-lecia Polskiego Towarzystwa Nauk Ogrodniczych, Kraków Markiewicz M.: Ocena tożsamości genetycznej wybranych roślin ogrodniczych rozmnażanych metodą in vitro. Konferencja Nauka-Praktyce, Skierniewice Góraj-Koniarska J., Gabryszewska E.: Wpływ auksyn na wzrost i rozwój roślin jagody kamczackiej (Lonicera caerulea) w kulturach in vitro Konferencja Nauka-Praktyce, Skierniewice

30 Kierownik zadania: dr Agnieszka Wojtania Zastępca : dr Waldemar Kiszczak mgr Monika Markiewicz Ocena zdrowotności pod względem obecności patogenicznych wirusów materiału roślinnego truskawki, maliny, jagody kamczackiej oraz czosnku w trakcie ukorzeniania roślin in vitro Dr hab. Mirosława Cieślińska, prof. IO Dr Tadeusz Malinowski Grażyna Szczechowicz Dorota Starzec Ukorzenianie metodą in vitro maliny. Wykrywanie i eliminacja zanieczyszczeń mikrobiologicznych w trakcie ukorzeniania roślin in vitro Prof. Dr hab. Teresa Orlikowska Mgr Aleksandra Trzewik Lucyna Ogórek Ukorzenianie metodą in vitro oraz ocena kondycji fizjologicznej roślin czosnku Dr Waldemar Kiszczak Mgr Urszula Kowalska Danuta Prochaska Ukorzenianie metodą in vitro oraz ocena kondycji fizjologicznej roślin truskawki Dr Iwona Sowik Dr Agnieszka Wojtania Mgr Monika Markiewicz Grażyna Korpas Ewelina Wojciechowska cie: I.Sowik Ukorzenianie metodą in vitro oraz ocena kondycji fizjologicznej roślin jagody kamczackiej Dr hab. Bożena Matysiak, prof. IO Dr hab. Małgorzata Podwyszyńska, prof. IO Dr Justyna Góraj Inż. Agnieszka Rojek Inż. Lidia Tułacz Jadwiga Białek