6/27/2017. Historia modelu danio (ang. zebrafish) Danio pręgowany (Danio rerio) Zagadnienia:

Transkrypt

1 Historia modelu danio (ang. zebrafish) Charakterystyka modelu doświadczalnego na podstawie Danio rerio Małgorzata Wiweger lata W Polsce, od maja 2015 r. danio zaliczane jest do zwierząt laboratoryjnych 2012 otwarcie European Zebrafish Resource Center (EZRC), Niemcy 2001 sklonowanie 1-ej mutacji otwarcie Zebrafish International Stock Center (ZIRC), USA 1998 początek sekwencjonowania genomu w Sanger, UK sze kolekcje mutantów ( Tübingen i Boston screens ) George Streisinger no. publikacji 3 Zagadnienia: Danio pręgowany (Danio rerio) - Danio pręgowany w laboratorium - Hodowla i utrzymanie ryb - Legislacja dot. hodowli ryb wykorzystywanych w celach naukowych lub edukacyjnych 2 Zdjęcie: M. Bazała Królestwo - zwierzęta ang. zebrafish Typ - strunowce Barilius rerio Podtyp - kręgowce Brachydanio rerio Gromada - promieniopłetwe Cyprinus chapalio Rząd - karpiokształtne Cyprinus rerio Rodzina - karpiowate Danio frankei (danio lamparci) Rodzaj - Danio Danio lineatus Gatunek - danio pręgowane Danio rerio (Hamilton, 1822) Nuria rerio Perilampus striatus 4 1

2 Różnorodność w obrębie gatunku Planowanie doświadczeń Doświadczenia na zwierzętach Zarodki i wczesne formy larwalne do 120 gpz w 28,5 C Doświadczenia na larwach > 120 gpz (zdolnych do samodzielnego odżywiania) i osobnikach dorosłych W 28 C ± 2 C, Zdjęcia: M. Bazała W szalkach Pertiego bez karmienia Ryby w akwarium karmione 4-6x/dzień, 5 7 Wady i zalety modelu danio Rozwój danio Rozwój zarodka danio: 0-17 gpz

3 5-cio dniowa larwa danio ma ok. 3 mm długości Porównanie modeli na podstawie McGrath., International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw 9 11 Porównanie tempa rozwoju zarodków: ryb (danio), mysich i ludzkich Long-term time-lapse. Long-term time-lapse. Time-lapse development of a Tg(kdrl:GFP) zebrafish from hpf acquired every 10 min. SPIM signal (yellow) is superimposed on tomographic reconstruction (gray). The optical tomography data are inverted in all panels. Scale bar: 100 µm. na podstawie Haldi et al., Andrea Bassi et al. Development 2015;142: Published by The Company of Biologists Ltd 3

4 ->70% ludzkich genów ma przynajmniej jeden odpowiednik u danio Fengzhu Xiong, Sean Megason Harvard Medical School -Zaletą jest dostępność różnorodnych mutantów i linii reporterowych 13 National Tsing Hua University, Department of Medical Science, YJ Chuang Lab, NTHU- NHRI Zebrafish Core Facility & Taiwan Zebrafish Core Facility Taken by Nikon A1R Long-term time-lapse. Andrea Bassi et al. Development 2015;142: Fengzhu Xiong, Ian Swinburne, Sean Megason (Harvard Medical School) Yolk syncytial layer(ysl) is an important structure in early zebrafish embryos that controls morphogenesis and regulate mesoderm/endoderm patterning. This movie provides a single-cell resolution side view of a developing zebrafish embryo from 16-cell stage to 5.5 hours post Published by The Company of Biologists Ltd 4

5 Przykład badania z użyciem modelu danio Obrazowanie przetwarzania bodźców wizulanych przez mózg larwy danio pantofelek danio Muto et al., Current Biology, 23: Linia Tg(fli:GFP) Fli1 - friend leukemia integration 1 transcription factor (FLI1) or transcription factor ERGB Muto et al., Current Biology, 23:

6 Typowe zachowanie u danio Typowe zachowanie u danio Cachat, et al., Nature Protocols 5, (2010) doi: /nprot International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw 23 Typowe zachowanie u danio Przykład badania z użyciem modelu danio Cachat, et al., Nature Protocols 5, (2010) doi: /nprot Cachat, et al., Nature Protocols 5, (2010) doi: /nprot International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

7 Toksykologia przy użyciu danio Projekt FISHMED ( Fishing for Medicines and their targets using Zebrafish models of human diseases. ) Koordynator Projektu: Prof. Jacek Kuźnicki Zastępca Dyrektora ds. naukowych: Prof. Michał Witt Menadżer Projektu: Dr Urszula Białek Wyrzykowska Czas trwania projektu: Cele: Współpraca bliźniacza siedmiu grup badawczych MIBMiK z czołowymi europejskimi ośrodkami badawczymi pracującymi z danio pręgowanym w celu rozwoju potencjału innowacyjnego z wykorzystaniem modelów ryby. Rozwój Pracowni Hodowli Danio Pręgowanego i stworzenie nowej grupy badawczej pod przewodnictwem osoby wybranej w drodze otwartego międzynarodowego konkursu. Zakup i modernizacja sprzętu badawczego dla Pracowni Hodowli Danio Pręgowanego i nowego laboratorium badawczego danio pręgowanego. Umocnienie potencjału innowacyjnego MIBMiK dzięki platformie Bio&Technology Innovations Platform (BioTech-IP) Stworzenie interaktywnej platformy w celu popularyzacji projektu FishMed i badań z wykorzystaniem modeli danio pręgowanego wśród naukowych i nienaukowych społeczności, w tym promowanie innowacyjnych wyników projektu. Dyrektor MIBMiK, Prof. dr hab. Jacek Kuźnicki Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie 25 Przykład badania z użyciem modelu danio b.uiowa.edu/pictur es22/dermnet/mel anoma_81.jpg; u.org/news/scienc e/sciencephoto/zebrafishmelanoma.jpg Projekty FISHMED realizowane w MIBMiK przy wykorzystaniu modelu danio The Bochtler group / Heisenberg group, the Austrian Institute of Science and Technology (IST), Klosterneuburg, Austria Topic: the DNA methylation and demethylation in zebrafish. The Bujnicki group / Braun group, MPI-HLR, Bad-Nauheim, Germany Topic: the development and application of bioinformatics software for the prediction of the pathogenic effects of mutations in protein- and RNA-coding loci. The Chacinska group / Stainier group, MPI-HLR, Bad-Nauheim, Germany Topic: the role of protein import pathways in zebrafish development. earch/researchlab.aspx?id=1346 ZRIC, Chau Nguyen, M.D. N Engl J Med 2004; 350:e8February 26, 2004 The Jaworski group / Harris group, University of Cambridge, United Kingdom Topic: the development of the zebrafish visual system as an in vivo model to study ztor function and dysfunction in neurons. The Kuznicki group / Bandmann group at MRC at the University of Sheffield, United Kingdom Topic: the mechanism of calcium perturbation in PINK1 mutant of zebrafish, a model of Parkinson s disease. The Miaczynska group / Gonzalez-Gaitan, Department of Biochemistry, University of Geneva, Switzerland Topic: the role of endocytic proteins in signalling and transcriptional regulation in zebrafish. The Winata group / Topic: cardiac transcription factors (TFs) and characterization of epigenetic profiles during heart development. The Zylicz group / Snaar-Jagalska, the Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, The Netherlands Topic: the Heat Shock Protein network and p53 response in zebrafish

8 Dymorfizm płciowy Zdjęcia: M. Bazała Danio nie mają chromosomów płciowych i mogą zmieniać płeć przez całe życie! International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw 31 Pochodzenie danio i jego środowisko naturalne Typy systemów Engeszer et al., (2007) ZEBRAFISH, vol 4: Przepływowe Obieg zamknięty z regularną podmianą wody Obieg zamknięty bez podmiany wody wady duże koszty utrzymania (woda/ścieki) trudniej utrzymać stabilne parametry wody musi być odpowiedni system wyższe ryzyko rozprzestrzeniania się chorób wyższe ryzyko zatrucia związkami z cyklu azotowego zalety mniejsze ryzyko przeniesienia zakażenia pomiędzy zbiornikami mniejsze koszty (woda/ścieki) łatwość utrzymania parametrów wody niskie koszty utrzymania (woda/ścieki) mały nakład pracy standard standard tox D. Parichy, International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw 32 8

9 Wybór szafy wysokość Zagęszczenie zasięg ręki i wzroku Wpływ zagęszczenie na rozwój ryb International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw 35 Systemy do utrzymania danio 5 dorosłych ryb / 1 l wody ZALECENIE UE Pojemniki do utrzymywania danio Pojemniki z pokrywką

10 Urozmaicenie środowiska Danio są bardzo aktywne: preferują długie i płytkie baseny lubią polować (żywy pokarm) Danio są zwierzętami stadnymi preferencja grup >5 sztuk w stadach < 5 sztuk ryby często robią się agresywne Nie stosuje się podłoży (względy sanitarne + obsługa), ale dobrze sprawdzają się ciemne podkładki lub podkładki np. ze zdjęciem żwiru Nie stosuje się roślin żywych (względy sanitarne), ale można stosować plastikowe Należy unikać siatek oraz dekoracji, w które danio może się zaplątać 37 Woda (2/2) Filtry: Mechaniczny Biologiczny Węglowy (musi być regularnie wymieniany) Lampy UV (min μwsec/cm 2 ) Dzienna podmiana wody 10%-50% Bardzo niebezpieczne są zanieczyszczenia (chlor, metale ciężkie, detergenty itd.) Woda RO musi być wzbogacana solami (stabilizacja ph, przewodnictwa i twardości) 39 Woda (1/2) Kontrola poziomu związków azotowych Parametry: temperatura: C przewodnictwo: ( μs) ph: jon amonowy/amoniak (NH 4+ /NH 3 ): < 0,02 mg/l azotyny (NO 2- ): < 0,1 mg/l azotany (NO 3- ): < 5-10 mg/l rozpuszczony tlen: ok. 6 mg/l twardość ogólna (GH): 2-6 twardość węglanowa (KH): ~1/2GH Filtr biologiczny podmiana wody

11 Pozyskiwanie materiału do badań Pokarm dla ryb laboratoryjnych ~ 100 jaj / para / tydzień Granulaty Płatki Wybór powinien uwzględnić: - wielkość (ryba/pokarm) - bezpieczeństwo - (standaryzację) -wpływ na eksperymenty -nakład pracy - (zbilansowanie diety) i-spone (Tecniplast) Pokarm mrożony Pokarm żywy Cykl rozwojowy danio Karma

12 Choroby zakaźne Danio w warunkach laboratoryjnych jest wrażliwy na zakażenia: - wirusowe, - bakteryjne, - grzybiczne, - pasożytnicze ZIRC, Najpoważniejsze zagrożenia: Mycobacterium spp. (fortuitum, marinum, haemophillum, chelonae, peregrinum, abscesus) Pseudomonas spp. / Aeronomas spp. Edwardsiella spp. Vibrio spp. Pseudoloma neurophilia (Microsporidia) Pseudocapilaria tomentosa UWAGA na ichtiozoonozy (choroby przenoszone z ryb na ludzi) Zdrowie i dobrostan Bezwzględne utrzymanie odpowiednich parametrów wody i przestrzeganie zasad higieny Kwarantanna (dożywotnia) dla wszystkich ryb z zewnątrz Ikra poddana zewnętrznemu odkażaniu metoda ta nie zabezpiecza przed przeniesieniem niektórych chorób Usuwanie starych ryb Bez wartości hodowlanej / wzrost podatności na choroby Obserwacja wyglądu i zachowania Natychmiastowe usuwanie wszystkich ryb z objawami Ryby testowe: - sprawdzanie nowości np. karma, podłoże, itp. - okresowe badania zdrowia Znieczulanie: Znieczulanie i eutanazja MS-222 znany także jako Tricaine, Ethyl 3-Aminobenzoate Methanesulfonic Acid, Tricaine methanesulfonate, TMS, mesylate, Finquel and Tricaine-S blokuje kanały wapniowe i potasowe z membranach nerwowych ( mg/l) olejek goździkowy - wycofany z użycia w UE schładzanie (5 vol. lód /1 vol. woda, 0-4 C) benzokaina Dawka zależna od stadium rozwojowego, wielkości i indywidualnej wrażliwości danio Eutanazja: MS-222 podchloryn sodu (1 vol. NaClO 6.15% / 5 vol. woda) zarodki <3dpz. dekapitacja / gwałtowne zamrożenie / gwałtowna maceracja 46 Pochodzenie danio laboratoryjnego Licencjonowane hodowle komercyjne (nieliczne) Licencjonowane hodowle laboratoryjne (database at ZFIN) Zebrafish Stock Centers: Zebrafish International Resource Center USA European Zebrafish Resource Center Germany Stanowisko naturalne (wymagane pozwolenie ) 48 12

13 Lista hodowców w rejestrze MNiSW 6/81 zarejestrowanych hodowców może utrzymywać danio ostatnia aktualizacja Lp. Numer w wykazie Imię i nazwisko lub nazwa użytkownika Miejscowość 45 dni Podanie do Ministerstwa Środowiska NIE Czy jest zgoda GMO? TAK TAK koniec NIE Czy jest świadectwo pochodzenia (zdrowia)? Zgłoszenie CWET Min 48h przed importem Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, Wydział Medycyny Olsztyn Weterynaryjnej, Katedra Patofizjologii, Weterynarii Sądowej i Administracji Instytut Przemysłu Organicznego, Oddział w Pszczynie Pszczyna Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, Wydział Nauk o Warszawa Zwierzętach Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej Warszawa Laboratorium Badawcze SORBOLAB Sp. z o.o. Poznań Czy są to ryby GMO? NIE Czy jest to TAK ikra? TAK NIE Czy z kraju TAK UE? NIE Czy jest zgoda Głównego Lekarza Weterynarii? TAK Czy jest świadectwo zdrowia? NIE koniec IMPORT Raport do PIW Uniwersytet Medyczny w Lublinie Ośrodek Medycyny Doświadczalnej Lublin 49 NIE Uwaga! Ryby ze szkodliwym Podanie do Głównego fenotypem wymagają dodatkowej Lekarza Weterynarii zgody LKE! tygodnie Lista użytkowników w rejestrze MNiSW 5/180 zarejestrowanych użytkowników może prowadzić doświadczenia na danio ostatnia aktualizacja Numer w wykazie Imię i nazwisko lub nazwa użytkownika Miejscowość Instytut Przemysłu Organicznego, Oddział w Pszczynie Pszczyna Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej Warszawa Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, Wydział Nauk o Zwierzętach Warszawa Uniwersytet Wrocławski, Wydział Nauk Biologicznych Wrocław Laboratorium Badawcze SORBOLAB Sp. z o.o. Poznań

14 Liczba gatunków 6/27/2017 PERM TRIAS Miliony lat wcześniej International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

15 International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw 60 15

16 Zalecenia dot. warunków utrzymania ryb danio (wspólny projekt FELASA and EuFishBioMed) THE ZEBRAFISH BOOK A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series) 1st by Christiane Nusslein-Volhard and Ralf Dahm Guidance on the housing and care of Zebrafish Danio rerio by Barney Reed and Maggy Jennings International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie 63 Companies operating (with service) in Poland International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw 62 16

17 Euthanasia Marca Więcej informacji na Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw 67 Małgorzata Wiweger mwiweger@iimcb.gov.pl W sprawach dotyczących aspektów weterynaryjnych - Piotr Jan Korzeniowski pkorzeniowski@iimcb.gov.pl 17