PL B1. UNIWERSYTET ROLNICZY IM. HUGONA KOŁŁĄTAJA W KRAKOWIE, Kraków, PL BUP 19/08

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12G 3/02 ( ) C12G 1/022 ( ) C12C 11/09 ( ) C12N 11/08 ( ) (54) Sposób prowadzenia fermentacji etanolowej nastawów wysokocukrowych (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 19/08 (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET ROLNICZY IM. HUGONA KOŁŁĄTAJA W KRAKOWIE, Kraków, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/10 (72) Twórca(y) wynalazku: PAWEŁ SROKA, Kraków, PL TADEUSZ TUSZYŃSKI, Kraków, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Korzeniowski Zbigniew PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób prowadzenia fermentacji etanolowej nastawów wysokocukrowych przy produkcji napojów alkoholowych takich jak miody pitne, wina, piwa i inne napoje fermentowane za pomocą specjalnie dobranych szczepów drożdży i/lub innych mikroorganizmów Fermentacja wysokoekstraktowych brzeczek słodowych i nastawów winiarskich, a szczególnie brzeczek miodowych dwójniaka i trójniaka jest utrudniona, ze względu na duże stężenie cukrów w brzeczce i związane z tym wysokie ciśnienie osmotyczne. W czasie fermentacji środowisk o wysokim ekstrakcie często nie uzyskuje się odpowiedniej zawartości alkoholu i niekorzystnie wzrasta kwasowość lotna. Jest to związane między innymi z wysokim ciśnieniem osmotycznym roztworów, toksycznym działaniem alkoholu i innych produktów metabolizmu drożdży. Znane są liczne sposoby zwiększania stopnia odfermentowania, polegające na stosowaniu specjalnie dobranych szczepów drożdży i innych mikroorganizmów oraz modyfikowaniu składu chemicznego i parametrów fizykochemicznych fermentującego roztworu. Korzystne rezultaty osiągnięto podczas fermentacji za pomocą mikroorganizmów immobilizowanych na podłożach mineralnych np. tlenkach metali, szkle piankowym, krzemionce, ziemi okrzemkowej, co opisano w artykule Wzorek W., Bugajewska A., Bonin S., Mateusiak S., pod tytułem Badania nad ciągłą fermentacją winiarską z wykorzystaniem drożdży immobilizowanych na szkle piankowym", w czasopiśmie Przemysł Fermentacyjny i Owocowo Warzywny, z 2000, nr 6, str ; oraz artykule Bonin S., Wzorek W. pod tytułem Porównanie ciągłych fermentacji winiarskich z użyciem dwóch szczepów drożdży immobilizowanych na szkle piankowym" w Acta Scientiarum Polonorum, Technologia Alimentaria z 2004, tom 3 (2) str , oraz na podłożach organicznych. Matryce organiczne mogą być naturalne np. celuloza, alginian wapnia, agar, karagen lub syntetyczne np. poliakryloamid, kopolimery akrylowe, co opisano w pracy Kourkoutas Y., Bekatorou A., Banat I.M., Marchant R., Koutinas A.A., pod tytułem Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages production", w Food Microbiology z 2004, tom 21, str Matryce naturalne w formie hydrożeli są stosunkowo drogie, a proces immobilizacji jest zazwyczaj wieloetapowy i wymaga pracochłonnego przygotowania nośnika. W przypadku stosowania matryc mineralnych mogą występować dodatkowe problemy związane z wymywaniem do roztworu jonów metali ciężkich. Literatura patentowa opisuje metody immobilizacji komórek drożdżowych za pomocą alginianu wapnia w celu ich późniejszego wykorzystania do fermentacji etanolowej np. rozwiązanie francuskie wg patentu europejskiego EP (lnt.ci C12N11/10). Komórki unieruchomione można także stosować do fermentacji wtórnej bezpośrednio w butelce, szczególnie przy produkcji win musujących i szampanów np. rozwiązanie niemieckie wg patentu amerykańskiego US (Int.CI. 5 C12N11/10). Do immobilizacji drożdży Saccharomyces cerevisiae oraz fermentacji alkoholowej stosowano także usieciowany poliakryloamid i kopolimery akryloamidu z hydroksyetylometakrylanem, w skrócie HEMA, co opisano w pracy Öztop H.N., Öztop A.Y., Isikver Y., Saraydin D., pod tytułem Immobilization of Saccharomyces cerevisiae on to radiation crosslinked HEMA/AAm hydrogels for production of ethyl alcohol" w Process Biochemistry, z 2002, tom 37, str lub kwasem akrylowym, co opisano z kolei w pracy w/w autorów pod tytułem "Immobilization of Saccharomyces cerevisiae on to acrylamide-sodium acrylate hydrogels for production of ethyl alcohol" w Enzyme and Microbial Technology, z 2003, tom 32, str Doświadczenia prowadzone na kopolimerze kwasu akrylowego z akryloamidem wykazały, że wraz ze wzrostem ilości grup ulegających dysocjacji w hydrożelu, następuje zwiększenie chłonności i ilość wytwarzanego etanolu przez unieruchomione komórki. Syntetyczny, usieciowany poliakryloamid będący tanią alternatywą drogich hydrożeli naturalnych może zawierać pewne ilości, neurotoksycznego akryloamidu, co dyskwalifikuje ten hydrożel, jako materiał do produkcji napojów fermentowanych. Unieruchomienie komórek mikroorganizmów, takich jak drożdży i bakterii, za pomocą polimerów syntetycznych jest niezwykle proste, wystarczy umieścić nośnik w medium hodowlanym, a komórki ulegają adsorpcji na powierzchni, natomiast część z nich wnika przez pory do wnętrza spęcznianego polimeru. Sposób polega na prowadzenia fermentacji etanolowej nastawów wysokocukrowych zawierających powyżej 20 Blg ekstraktu rzeczywistego za pomocą specjalnie dobranych szczepów drożdży i innych mikroorganizmów. Istota sposobu charakteryzuje się tym, że fermentację prowadzi się w obecności 0,01-1% nierozpuszczalnego w wodzie polimeru na bazie usieciowanego poli(kwasu akrylowego), metakrylowego

3 PL B1 3 i/lub ich soli sodowych, potasowych lub amonowych. Jednym z wariatów prowadzenia fermentacji jest wprowadzanie polimeru do nastawu bezpośrednio przed dodaniem drożdży. Drugim wariantem jest wprowadzenie do nastawu drożdży uprzednio immobilizowanych na polimerze. Trzecim wariantem jest wprowadzenie polimeru do fermentującego nastawu. Zaletą sposobu jest to, że usieciowane za pomocą diwinylowych pochodnych (np. N,N'- -metyleno-bis-akryloamidu) poliakrylany i polimetakrylany są nietoksycznymi i nierozpuszczalnymi w wodzie polimerami, charakteryzującymi się zdolnością do pochłaniania dużych ilości wody i roztworów wodnych. Dzięki swoim właściwościom znane są jako superabsorbenty, w skrócie SAP, i znajdują szerokie zastosowanie do produkcji środków higienicznych (np. pieluszki jednorazowe, podpaski), w ogrodnictwie, leśnictwie, medycynie (np. opatrunki hydrożelowe) oraz jako czynnik spowalniający uwalnianie substancji czynnych w preparatach leczniczych, co opisano w monografii Buchholz F.L., Graham A.T. pod tytułem Modern superabsorbent polymer Technology", Wiley, Cechą charakteryzującą polimerów chłonących wodę lub roztwory wodne jest tzw. chłonność (pęczliwość), która określa ilość wody pochłanianej przez 1 g suchego polimeru. Wysycany wodą polimer tworzy hydrożel. Chłonność dostępnych polimerów akrylowych, dla wody demineralizowanej, waha się w granicach g/g i zależy od struktury makrocząsteczek, głównie od ilości zastosowanego w trakcie produkcji związku sieciującego. Jony obecne w roztworze, szczególnie wielowartościowe kationy, znacznie ograniczają ilość pochłoniętego przez polimer roztworu wodnego. Kwas akrylowy jest monomerem dopuszczonym w Unii Europejskiej jako nietoksyczny polimer stanowiący surowiec do produkcji tworzyw sztucznych mających kontakt z żywnością. W literaturze dotyczącej winiarstwa brak jest doniesień na temat stosowania usieciowanych poliakrylanów. Zastosowanie usieciowanego poli(kwasu akrylowego) niesie ze sobą liczne korzyści. Polimer ten jest nietoksyczny, łatwo dostępny, tani i produkowany na dużą skalę. Uwodniony polimer ma gęstość jedynie nieznacznie większą od cieczy, w której się znajduje. W odróżnieniu od innych, mineralnych substancji immobilizujących (np. szkło piankowe), nie zalega on na dnie naczynia, w którym zachodzi fermentacja, lecz jest w ciągłym ruchu. Cząstki hydrożelu wypływają w kierunku powierzchni, unoszone pęcherzykami wydzielającego się dwutlenku węgla CO 2, i zanurzają się ponownie po oddzieleniu się od polimeru pęcherzyków gazu. Stały ruch polimeru podczas fermentacji powoduje dodatkowe mieszanie cieczy oraz intensywną wymianę materii pomiędzy immobilizowanymi mikroorganizmami na powierzchni hydrożelu a otoczeniem. Aby uzyskać porównywalny efekt w przypadku stosowania np. szkła piankowego, należałoby ciecz dodatkowo intensywnie mieszać. Obecność grup kwasowych w łańcuchach polimeru prawdopodobnie powoduje adsorpcję na żelu środków powierzchniowo czynnych i ogranicza toksyczny wpływ metabolitów i składników chemicznych, odpowiedzialnych za hamowanie fermentacji. Częściowo zneutralizowany poli(akrylanu potasu) wykazuje właściwości buforujące, a więc wpływa na stabilizację ph osadzonych na nim drożdży. Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że poliakrylany zmniejszają syntezę kwasu octowego przez komórki unieruchomionych drożdży. Kwas octowy wpływa bezpośrednio na przebieg procesu (hamuje fermentację) oraz zmianę kwasowości lotnej. Jest to niezwykle istotne w przypadku fermentacji nastawów wysokocukrowych, w których wzmożona synteza kwasu octowego jest przyczyną wysokiej kwasowości lotnej. W niekorzystnych warunkach zmiana tego parametru może doprowadzić do dyskwalifikacji jakościowej otrzymanego produktu. W przypadku miodów pitnych kwasowość lotna nie powinna być wyższa niż 1,4 g/dm 3 w przeliczeniu na kwas octowy (Dz. U. 2004, nr 272, poz. 2696). Polimery akrylowe wiążą metale wielowartościowe w tym również tzw. metale ciężkie, co opisano w pracy Mouginot Y., Morlay C, Cromer M., Vittori O. pod tytułem Potentiometric study of copper(ll) and nickel(ll) complexation by a cross-linked poly(acrylic acid) gel" w Analytica Chimica Acta z 2000, nr 407 strony , a więc dodatkową zaletą ich stosowania, w przypadku obecności tych jonów w surowcu, jest możliwość usunięcia ich z odfermentowanego napoju wraz z polimerem po zakończeniu fermentacji. Zasadniczą zaletą wynalazku jest skrócenie czasu fermentacji brzeczek o zawartości ekstraktu rzeczywistego powyżej 20 Blg, przy jednoczesnym zwiększeniu stopnia odfermentowania, obniżeniu kwasowości lotnej i zawartości metali wielowartościowych oraz ułatwienie klarowania miodów pitnych, win, piwa i innych napojów fermentowanych w wyniku dodania do nastawu od 0,01 do 1% nierozpuszczalnego w wodzie hydrożelu na bazie usieciowanego poli(kwasu akrylowego), metakrylowego i/lub ich soli sodowych, potasowych lub amonowych.

4 4 PL B1 Sposób według wynalazku objaśniony jest w przykładach. P r z y k ł a d 1 (porównawczy) Przygotowano brzeczkę miodową przez zmieszanie jednej części objętościowej miodu gryczanego i dwóch części wody, dodano 0,4 g/dm 3 wodorofosforanu(v) amonu i 0,25 g/dm 3 kwasu cytrynowego. Brzeczkę o ekstrakcie 35 Blg otrzymaną poprzez sycenie (ogrzewanie do 100 C w czasie 10 min.) po ochłodzeniu szczepiono gęstwą drożdżową Saccharomyces cerevisiae rasy Johannisberg-Riesling w ilości 0,5 g s.s. na 1 dm 3 roztworu. Fermentację prowadzono w temperaturze pokojowej i po jej zakończeniu, po ok. 3 tygodniach, oznaczano zawartość etanolu i inne charakterystyczne wyróżniki. P r z y k ł a d 2 Do przygotowanej brzeczki miodowej, jak w przykładzie 1, dodawano odpowiednio: 0,2; 0,5 lub 1,0 g/dm 3 usieciowanego poli(akrylanu potasu) za pomocą 0,1% N,N'-metyleno-bis-akryloamidu i po wymieszaniu szczepiono gęstwą drożdżową w ilości 0,5 g/dm 3 s.s na 1 dm 3 nastawu. Zastosowany nierozpuszczalny polimer charakteryzował się stosunkowo dużą chłonnością (400 g/g) względem wody demineralizowanej i odczynem lekko kwaśnym (ph=6). Fermentację prowadzono w identycznych warunkach jak w przykładzie 1. Wyniki porównawcze zestawiono w tabeli 1. T a b e l a 1. Wpływ usieciowanego poli(akrylanu potasu) na zawartość etanolu w brzeczkach odfermentowanych Poli(akrylan potasu) [g/dm 3 ] Etanol [% obj.] Kwasowość lotna [g/dm 3 ] 0,0 15,1 1,26 0,2 15,5 1,16 0,5 16,5 0,69 1,0 17,4 0,42 P r z y k ł a d 3 Do przygotowanej brzeczki miodowej, jak w przykładzie 1, dodawano mieszaninę zawierającą 0,2; 0,5 lub 1,0 g/dm 3 (w przeliczeniu na suchą masę żelu) usieciowanego poli(akrylanu potasu) za pomocą 0,1% N,N'-metyleno-bis-akryloamidu, wysyconego uprzednio brzeczką wymieszaną z gęstwą drożdżową w ilości 0,5 g s.s. na 1 dm 3 nastawu. Fermentację prowadzono w identycznych warunkach jak w przykładzie 1. Otrzymane wyniki nie różniły się istotnie od wartości uzyskanych w przykładzie 2. P r z y k ł a d 4 Brzeczkę miodową zaszczepiono i poddano fermentacji jak w przykładzie 1. W drugim dniu fermentacji do brzeczki dodawano odpowiednio: 0,2; 0,5 lub 1,0 g/dm 3 usieciowanego poli(akrylanu potasu) za pomocą 0,1% N,N'-metyleno-bis-akryloamidu i dalej postępowano jak w przykładzie 1. Otrzymane wyniki nie różniły się istotnie od wartości uzyskanych w przykładzie 2. Zawartość etanolu i kwasowość lotna odfermentowanych nastawów była w tych przykładach uwarunkowana ilością dodanego polimeru, a sposób w jaki dodawano drożdże i polimer (przykład 2, 3 i 4) nie miał istotnego wpływu na uzyskane wyniki. Fermentacja brzeczek z dodatkiem poli(akrylanu potasu) była bardziej intensywna, a otrzymane brzeczki odfermentowane charakteryzowały się stężeniem etanolu wyższym od 0,4 do 2,3% obj. to jest od 2 do 15% więcej w porównaniu do odfermentowanej brzeczki porównawczej (Tab. 1). Dodatkową zaletą zastosowanego hydrożelu było przyspieszenie klarowania oraz niższa kwasowość lotna brzeczek. Pod względem organoleptycznym miody otrzymane z udziałem poli(akrylanu potasu) przewyższały próbę porównawczą. Zastosowanie polimeru powoduje szybsze klarowanie odfermentowanych brzeczek. Próby wykonane z poli(akrylanem potasu) nie były mętne bezpośrednio po zakończeniu fermentacji, podczas gdy próba porównawcza z komórkami wolnymi ulegała pełnemu wyklarowaniu dopiero po kilku miesiącach dojrzewania. Polimer prawdopodobnie absorbuje na powierzchni substancje stabilizujące zawiesinę lub wpływa na szybszą flokulację i sedymentację białek, związków fenolowych i innych składników. Po zakończeniu fermentacji oddzielony hydrożel z unieruchomionymi komórkami można wykorzystać powtórnie do kolejnego nastawu lub jako złoże do fermentacji ciągłej. Polimery akrylowe w razie potrzeby można dodatkowo zastosować do immobilizacji enzymów lub substancji pomocniczych np. aktywatorów fermentacji.

5 PL B1 5 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób prowadzenia fermentacji etanolowej nastawów wysokocukrowych zawierających powyżej 20 Blg ekstraktu rzeczywistego za pomocą specjalnie dobranych szczepów drożdży i/lub innych mikroorganizmów, znamienny tym, że fermentację prowadzi się w obecności 0,01-1% nierozpuszczalnego w wodzie polimeru na bazie usieciowanego poli(kwasu akrylowego), metakrylowego i/lub ich soli sodowych, potasowych lub amonowych. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że polimer wprowadza się do nastawu bezpośrednio przed dodaniem drożdży. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że gęstwę drożdżową uprzednio miesza się z polimerem, a następnie wprowadza do nastawu. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że polimer wprowadza się w trakcie fermentacji.

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,00 zł.