Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wydział Nauk o Żywności Kierunek: Technologia Żywności i Żywienie Człowieka Marta Pokora Wykorzystanie enzymów z niekomercyjnych źródeł do otrzymywania aktywnych biologicznie peptydów z białka jaja Application of enzymes from noncommercial sources in production of biological active peptides from egg white Rozprawa doktorska wykonana pod kierunkiem prof. dr hab. Józefy Chrzanowskiej w Katedrze Technologii Surowców Zwierzęcych i Zarządzania Jakością WROCŁAW 2014
Marta Pokora Wykorzystanie enzymów z niekomercyjnych źródeł do otrzymywania aktywnych biologicznie peptydów z białka jaja Praca wykonana została w ramach projektu pt. Innowacyjne technologie produkcji biopreparatów na bazie nowej generacji jaj (OVOCURA) współfinansowanego przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka, 2007-2013
STRESZCZENIE 1. STRESZCZENIE Celem podję tych badań była ocena przydatności niekomercyjnych enzymów proteolitycznych do otrzymywania biologicznie aktywnych peptydów z preparatu zdenaturowanych białek jaja, pozostają cych jako produkt odpadowy w procesie izolacji, w warunkach przemysłowych, lizozymu i cystatyny z treści jaja. Zaproponowano reakcję hydrolizy enzymatycznej jako sposób zagospodarowania tego produktu ubocznego z udziałem proteaz różnego pochodzenia. Preparat białkowy, określany jako owoalbuminowy, poddano procesowi degradacji enzymatycznej, z udziałem niekomercyjnych enzymów proteolitycznych: serynowej proteazy z dyni figolistnej (Cucurbita ficifolia) oraz serynowej i aspartylowej proteazy z drożdży Yarrowia lipolytica, jak i preparatów proteaz komercyjnych pochodzenia mikrobiologicznego (Neutrase, Seaprose). Przebieg hydrolizy białka monitorowano poprzez oznaczenie stopnia hydrolizy, przyrostu stę żenia wolnych grup aminowych oraz analizę profili peptydowych uzyskanych metodą RP-HPLC. W produktach hydrolizy oznaczano aktywność przeciwutleniają cą (określoną przez wyznaczenie zdolności wymiatania wolnych rodników DPPH, siły redukują cej oraz zdolności chelatowania kationów dwuwartościowych) i przeciwdrobnoustrojową. Podję to także próbę izolacji aktywnych frakcji peptydów z hydrolizatów o najbardziej atrakcyjnych parametrach, wykorzystują c metody: ultrafiltracji, chromatografii żelowej oraz hydrofobowej w systemie RP-HPLC. Wyizolowane frakcje biopeptydów scharakteryzowano poprzez określanie ich sekwencji aminokwasowej i masy czą steczkowej stosują c techniki spektrometrii mas (ESI- MS/MALDI-TOF-MS). W wybranych hydrolizatach lub ich frakcjach oznaczono także: aktywność inhibitorową wobec konwertazy angiotensyny I, aktywność antydiabetyczną (inhibitorową wobec α-amylazy i α-glukozydazy), a także immunomodulatorową i cytotoksyczną. Zidentyfikowane pod wzglę dem sekwencji aminokwasowej biopeptydy o najwyższej aktywności biologicznej zsyntetyzowano na drodze chemicznej. Preparat owoalbuminowy poddano też enzymatycznej hydrolizie w warunkach przemysłowych z udziałem jednego z najczę ściej wykorzystywanych, komercyjnych enzymów proteolitycznych - Neutrase. Wykazano, że zastosowanie metody hydrolizy enzymatycznej zdenaturowanych białek jaja stanowi efektywny sposób ich zagospodarowania. W zależności od warunków procesu hydrolizy, a w szczególności rodzaju zastosowanego enzymu, jego dawki i czasu trwania procesu, substrat ulegał w różnym stopniu degradacji. Spośród proteaz
STRESZCZENIE niekomercyjnych najbardziej efektywna okazała się proteaza serynowa z Cucurbita ficifolia, skutkują ca degradacją substratu na poziomie 73%, podczas gdy wśród preparatów komercyjnych najwyższy stopień hydrolizy (78%) generowała Neutraza. Korzystne dla uzyskania głę bokiej proteolizy białka okazało się także wprowadzenie modelu hydrolizy sekwencyjnej i kombinowanej, z udziałem enzymów niekomercyjnych, skutkują ce w zależności od zastosowanej dawki i układu proteaz 40-50% degradacją białka. Wszystkie uwalniane produkty hydrolizy preparatu owoalbuminowego przejawiały aktywność przeciwutleniają cą. Najwyższą zdolnością redukcji stopnia utlenienia jonów Fe (III) oraz chelatowania jonów żelaza (II) charakteryzowały się hydrolizaty uzyskane z udziałem proteazy serynowej z: dyni figolistnej i Y. lipolytica. Najwyższą zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH wykazywał hydrolizat uzyskany z udziałem proteazy aspartylowej z Y. lipolytica. Zastosowana procedura izolacji peptydów, z wybranych hydrolizatów preparatu owoalbuminowego, pozwoliła na wydzielenie homogennych frakcji, z których liczne wykazywały wysoką aktywność biologiczną. Identyfikacja uzyskanych produktów metodą degradacji Edmana oraz spektrometrii mas pozwoliła na wskazanie sekwencji 34 biopeptydów, zawierają cych w swojej strukturze od 2 do 19 reszt aminokwasowych. Wiele z nich charakteryzowało się multifunkcjonalnością. Najwyższą aktywność inhibitorową wobec konwertazy angiotensyny I (IC 50 0,27µg) wykazywała frakcja hydrolizatu uzyskanego z udziałem proteazy z dyni figolistnej, stanowią ca równomolową mieszaninę peptydów o sekwencjach: SWVE i DILN, pochodzą cych ze struktury owolabiminy: f148-151 i f86-89. Frakcja ta wyróżniała się także wysoką zdolnością wią zania rodników DPPH (1,8 μm/mg) i chelatowania jonów Fe (II) (1003,9 μg Fe 2+ /mg). W celu jednoznacznej identyfikacji sekwencji determinują cej określoną bioaktywność, przeprowadzono syntezę chemiczną poszczególnych fragmentów peptydowych z sekwencji owoalbuminy (f 147-151) zawierają cej od 2 do 5 reszt aminokwasowych. Najwyższą aktywność wobec ACE oraz aktywność antydiabetyczną wykazały peptydy: SWVE oraz SWV. Fragmenty te stanowią niekompetycyjne inhibitory konwertazy angiotensyny I. Najwyższą aktywność przeciwutleniają cą wykazał peptyd o sekwencji DILN. Skrócenie lub wydłużenie jego sekwencji powodowało spadek aktywności wobec wolnych rodników, pozostawało natomiast bez wpływu na jego aktywność chelatują cą.
STRESZCZENIE Badania cytotoksyczności wykazały, że zarówno hydrolizaty preparatu owoalbuminowego, jak i ich frakcje nie są toksyczne wobec ludzkich linii komórkowych: keratynocytów (HaCaT) oraz hepatocytów (HepG2). Ocena aktywności immunomodulatorowej wykazała ograniczone działanie induktorowe hydrolizatów i peptydów do wydzielania cytokin IL-6 i IL-10. Hydroliza zdenaturowanych białek jaja w warunkach przemysłowych z udziałem komercyjnego preparatu proteazy Neutrazy, skutkowała otrzymaniem produktu o stopniu hydrolizy na poziomie 22%. Otrzymane hydrolizaty charakteryzowały się aktywnością przeciwutleniają cą i inhibitorową wobec ACE. Przeprowadzone badania potwierdziły możliwość uzyskania bioaktywnych produktów na drodze degradacji enzymatycznej zdenaturowanych białek jaja, prowadzonej z udziałem tak niekomercyjnych, jak komercyjnych preparatów proteolitycznych. Uzyskane hydrolizaty lub ich frakcje mogą znaleźć zastosowanie jako składniki żywności funkcjonalnej czy nutraceutycznej. Natomiast wydzielone biopeptydy mogą stanowić potencjalne środki farmakologiczne.
ABSTRACT The aim of the study was to evaluate the applicability of noncommercial proteolytic enzymes to receive biologically active peptides from egg white protein preparation, obtained as by-product during isolation of lysozyme and cystatin form hen eggs. The enzymatic hydrolysis with the use of proteases from different sources, has been proposed as a method of valorization of this by-product. The protein preparation, named as ovalbumin preparation was subjected to enzymatic degradation processes with the use of noncommercial proteolytic enzymes: serine protease of fig-leaf gourd fruit (Cucurbita ficifolia), serine and aspartic protease from yeast Yarrowia lipolytica, as well as commercial proteases from microbial origin (Neutrase, Seaprose). The progress of hydrolysis was monitored by the determination of degree of hydrolysis, increase of free amino groups content and by RP-HPLC peptide profiles analysis. In obtained hydrolysates the antioxidant activity (Fe 3+ reducing activity, DPPH, chelating activity) as well as antimicrobial activity were determined. The hydrolysates exhibiting the the most attractive characteristics were separated to active fractions of peptides by ultrafiltration, size-exclusion and RP-HPLC chromatography. The characterization of obtained fractions was made based on the determination of their molecular masses (ESI-MS/MALDI-TOF-MS), amino acid composition and primary sequences analysis. Furthermore, in selected hydrolysates or their fractions also the inhibitory activity against angiotensin converting enzyme (ACE), antidiabetic activity (αamylase and α-glukozydase inhibitory activity), immunomodulating and cytotoxic activities were analyzed. Biopeptides with the highest biological activity, identified in terms of amino acid sequence, were synthesized by chemical method. The egg white protein preparation was also subjected to enzymatic hydrolysis in the large -industrial scale with the use of commercial protease - Nutrase. It was shown that protein by-product obtained after isolation of lysozyme and cystatin from egg white, which exhibit poor functional properties, can be much more valuable after its enzymatic hydrolysis. Depending on the hydrolysis process conditions, in particular the type of enzyme, the dose of enzyme and duration of the process, the substrate exhibited a different degree of degradation. Among the noncommercial proteases the most effective was serine protease from Cucurbita ficifolia, resulting in 73% degradation of the substrate, while among commercial preparations the highest degree
of hydrolysis (78%) was generated Neutrase. The use of a sequential and combined hydrolysis model involving noncommercial enzymes, was also advantageous for obtaining high proteolysis of the substrate (DH 40-50%). The analysis of biological activities showed that all products released during degradation of ovalbumine preparation revealed antioxidant activities. Among all proteolytic enzymes used for hydrolysis, Cucurbita ficifolia and Yarrowia lipolytica serine proteases were the most effective in releasing peptides with the highest ferric (Fe 3+ ) reducing ability and Fe 2+ chelating activity. The highest ability to DPPH scavenging resulting hydrolyzate obtained when the aspartyl Y. lipolytica protease was used. The compiled procedure for isolation of bioactive peptides from selected hydrolysates of egg white protein preparation was effective and resulted in obtaining homogeneous peptide fractions, many of which have high biological activity. Identification of these fractions by Edman degradation and mass spectrometry (ESI-MS/MALDI-TOF-MS), allowed to identify the sequence of 34 biopeptides, containing from 2 to 19 amino acid residues. Many of them were characterized by multifunctionality. The highest inhibitory activity against angiotensin-converting enzyme (IC 50 of 0.27 mg) showed fraction of the hydrolysate obtained with the use of fig-leaf gourd fruit protease, which was identified as equimolar mixture of peptides sequences: SWVE (f 148-151) and DILN (f 86-89). Those peptides presented also high scavenging activity in DPPH test (1.8 μm/mg) and high iron (II) chelating activity (1003.9 μg Fe2+/mg). In selected peptides the sequence dependent bioactivity was confirmed in test with their chemically synthesized analogues. Synthetic peptides, which were designed on the basis of peptide SWVE (f 147-151) were examined. It was shown that tetrapeptide of SWVE and tripeptide of SWV sequence had revealed the strongest ACE-inhibitory activity. Study of their inhibitory kinetics revealed a non-competitive binding mode. The highest antioxidant activity shown the peptide DILN. Shortening or lengthening its sequence resulted in loss of activity against free radicals, while remained not affect the chelating activity. The determination of hydrolysates cytotoxity, conducted on human keratinocytes (HaCaT) and hepatocytes (HepG2), showed that they were not toxic for those cell lines. Immunomodulatory activity evaluation of hydrolysates and peptides showed limited induction of cytokines secretion: IL-6 and IL-10.
The hydrolysis of ovalbimine preparation by Neutrase in the large -industrial scale resulted in 22% DH. The obtained hydrolysates showed the antioxidant and ACE inhibitory activities. The study confirmed the possibility of obtaining bioactive products by enzymatic degradation of denatured egg white protein preparation. The resulted hydrolysates or their fractions can be used as functional food ingredients or nutraceutical.