Nanomateriały a środowisko naturalne kontekst mikrobiologiczny Nanomaterials and the natural environment the microbiological context Adrian Augustyniak (1) (1) Katedra Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej, Wydział Biotechnologii i Hodowli Zwierząt, Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, al. Piastów 45, 70-311 Szczecin Opiekun naukowy: dr hab. inż. Paweł Nawrotek Augustyniak Adrian: adrian.inpersona@gmail.com Słowa Kluczowe: biotechnologia, nanotechnologia, ochrona środowiska Streszczenie Nanomateriały są produkowane na dużą skalę i wykorzystywane niemal we wszystkich rodzajach przemysłu. Różnorodność kształtów i rozmiarów tych substancji, a także nowe perspektywy ich wytwarzania metodami biologicznymi powodują ciągły wzrost liczby potencjalnych zastosowań nanoproduktów. Z drugiej strony masowe stosowanie produktów nanotechnologii niesie za sobą ryzyko niekontrolowanego przedostawania się tych związków do środowiska naturalnego. Po przejściu do ekosystemów glebowych i wodnych, w pierwszej linii wejdą one w interakcję z drobnoustrojami. Z obecnych danych wynika, że to oddziaływanie może prowadzić do zaburzenia funkcjonowania konsorcjów mikroorganizmów i w związku z tym także roślin i zwierząt, poprzez zjawiska bioakumulacji, biomagnifikacji w łańcuchach troficznych, czy zmian w obiegu pierwiastków, w tym azotu. Istnieją przesłanki świadczące, że nanostruktury mogą stymulować drobnoustroje do wytwarzania substancji (np. proteaz), jednak nieznane są w tym wypadku konsekwencje dla środowiska. Poza tym wciąż niewiele wiadomo na temat biodegradacji nanomateriałów w środowisku naturalnym, a aktualne metody badawcze wymagają weryfikacji i dostosowania, by skutecznie odzwierciedlały oddziaływanie produktów nanotechnologii w ekosystemach. 1. Wstęp Nanotechnologia stała się w XXI wieku jedną z najważniejszych działalności człowieka, a z jej dobrodziejstw korzysta przemysł spożywczy, kosmetyczny, medycyna, a także budownictwo w postaci nowoczesnych materiałów budowlanych. Trwają prace nad coraz szerszym wprowadzaniem nanomateriałów do rolnictwa, np. poprzez zastosowanie ich w nawozach sztucznych. W związku z masową produkcją tych substancji sięgającą dziesiątek tysięcy ton rocznie, zwiększającą się wraz z możliwością zastosowania w tym celu dodatkowo metod
mikrobiologicznych, rozwój nanotechnologii wydaje się nieograniczony. Różnorodność produktów nanotechnologicznych odzwierciedla się w możliwościach ich aplikacji, co z kolei namacalnie przekłada się na wzrost na rynku produktów zawierających nano nie tylko w nazwie, ale i w swoim składzie. Z drugiej strony pojawia się problem transferu nanomateriałów do ekosystemów wodnych i lądowych, gdzie mogą być rozpatrywane jako potencjalne kontaminanty. W związku z rosnącymi obawami dotyczącymi skutków tego zjawiska pojawiła się potrzeba odkrywania i analizowania interakcji pomiędzy drobnoustrojami lądowymi i wodnymi a nanomateriałami, które dostają się do zasiedlanych przez nie nisz ekologicznych. 2. Opis zagadnienia Obecność nanomateriałów w środowisku naturalnym stała się faktem. Ogromna różnorodność form i wielkości tych substancji uniemożliwia dokładną i przede wszystkim wiarygodną ocenę ich oddziaływania na ekosystemy. Indywidualny charakter oddziaływań nanostruktur z ożywionymi i nieożywionymi elementami środowiska pogłębia ten problem tym bardziej, że stosunkowo niewiele danych zostało do tej pory zebranych w kontekście oddziaływania nanomateriałów na drobnoustroje i ich konsorcja, a także ewentualnych skutków przedostawania się produktów nanotechnologii do ekosystemów lądowych i wodnych. Niniejsza praca ma na celu przybliżenie aktualnego stanu wiedzy z tego zakresu z jednoczesnym podkreśleniem mikrobiologicznych aspektów nanotechnologii, a także uzasadnieniem potrzeby prowadzenia odpowiednich badań odzwierciedlających znaczenie interakcji mikroorganizm-nanomateriał. 3. Przegląd literatury Ilość produkowanych na świecie nanomateriałów rośnie z każdym rokiem i w podsumowaniu z roku 2012 dla samego dwutlenku tytanu wartość ta wynosiła około 10 tysięcy ton (Puccino i in. 2012), natomiast rynek nanomateriałów na rok 2015 został oszacowany na jeden bilion dolarów (Ge i in. 2013). Produkty nanotechnologii znajdują zastosowanie w elektronice jako przewodniki, przemyśle spożywczym i kosmetycznym jako dodatki. W medycynie nanotechnologia budzi nadzieje na opracowanie nowych terapii celowanych, np. przeciw chorobom nowotworowym. Nanomateriały weszły już do lecznictwa i dla przykładu ditlenek tytanu (TiO 2) z powodzeniem stosowany jest w stomatologii. Ze względu na właściwości przeciwbakteryjne i optyczne tego nanomateriału stosowany jest do wybielania zębów. Właściwości fotokatalityczne TiO 2 są też wykorzystywane w niektórych kosmetykach, m.in. w olejkach do opalania (Nawrotek i Augustyniak 2015). Z tego samego powodu pojawił się pomysł zastosowania ditlenku tytanu w systemach oczyszczania wody (Priester i in. 2013). Ponadto, ten i inne nanomateriały (np. nanokrzemionka) dodawane są do cementów, m.in. w celu podniesienia ich właściwości przeciwdrobnoustrojowych (Guo i in. 2012). Nowym kierunkiem rozwoju nanotechnologii jest rolnictwo. Od niedawna na rynku istnieją nawozy zawierające w swoim składzie nanocząstki metali, w tym miedzi i srebra. Nanomateriały to produkty inżynierii zbudowane z cząstek o wielkości w granicach 0,1-100 nm, a nawet 1000 nm (Narayanan i Sakthivel 2010). Najmniejsze
nanocząstki zbudowane z metali nazywane są nanokropkami lub kropkami molekularnymi (kwantowymi) (ang. Quantum dots; QD). W swoim składzie często zawierają metale takie jak miedź, żelazo, srebro, złoto, wanad, kadm, pallad, platyna czy tytan (Adil i in. 2015). Nanoprodukty mogą mieć także strukturę złożoną, taką jak w przypadku nanomateriałów krzemowych modyfikowanych np. miedzią, czy dwutlenkiem tytanu (Cendrowski i in. 2013). Poza nanomateriałami nieorganicznymi istnieją także zbudowane z substancji organicznych, np. liposomy, czy chitozan. (Gray i in. 2013; Mohan i in. 2013). Do niedawna wytwarzanie nanostruktur odbywało się wyłącznie metodami fizycznymi i chemicznymi. Metody te charakteryzują się jednak znacznymi ograniczeniami wynikającymi z trudności uzyskania nanostruktur zunifikowanych pod względem kształtu, a także kontrolowania ich toksyczności. Obecnie nastąpił wzrost zainteresowania wytwarzaniem nanomateriałów metodami biologicznymi poprzez wykorzystanie precyzyjnej syntezy mikrobiologicznej. Otrzymywane w ten sposób nanomateriały spełniają kryteria tzw. zielonej chemii i nadają takiej produkcji wymiar proekologiczny. Wiele mikroorganizmów jest zdolnych do syntezy nanocząstek. Wśród nich znajdują się zarówno bakterie, jak i grzyby (Nawrotek i Augustyniak 2015). Produkcja nanomateriałów tą drogą pozwala na zmniejszenie znaczenia problemów technologicznych, jednakże efektywność procesu wciąż nie stoi na wysokim poziomie. Najczęściej wykorzystywanie nanomateriałów w mikrobiologii wiąże się z ich właściwościami bakteriobójczymi i bakteriostatycznymi. Taką aktywność mogą wykazywać nanocząstki metali takich jak srebro, czy miedź, a także tlenki, np. tlenek cynku (ZnO) i ditlenek tytanu. Mechanizm działania jest różny i niekiedy, jak w przypadku dwutlenku tytanu wymaga dodatkowego czynnika w postaci światła UV. Podczas naświetlania nanomateriałów zawierających ten nanomateriał następuje tzw. efekt fotokatalityczny, który prowadzi do niszczenia komórek bakterii poprzez wywołanie stresu oksydacyjnego związanego ze zwiększeniem ilości reaktywnych form tlenu (ang. reactive oxygen species; ROS) (Cendrowski i in. 2013). Nanocząstki metali najczęściej działają poprzez dezintegrację błony komórkowej, a także przez zaburzanie transportu transbłonowego (Nawrotek i Augustyniak 2015). W kontekście właściwości przeciwdrobnoustrojowych, a także potencjalnej toksyczności, nanomateriałów znaczenie ma również ich wielkość. Uznaje się, że wzrastają one wraz ze zmniejszaniem średnicy nanostruktury (Paredes i in. 2014). Jak już wspomniano powszechność stosowania produktów nanotechnologii implikuje ich przedostawanie się do środowiska naturalnego, gdzie stają się one kontaminantami. Zarówno w środowiskach glebowych, jak i wodnych, pierwszymi organizmami żywymi, które wejdą z tymi substancjami w kontakt są mikroorganizmy. Wciąż jest niewiele danych dotyczących ewentualnego wpływu nanomateriałów na drobnoustroje zasiedlające określone ekosystemy, jednak pojawiają się już kolejne prace naukowe, które podkreślają konieczność prowadzenia badań w tym kierunku. Holden i in. (2014) podają pięć powodów dla których istotne jest w tym kontekście wzięcie pod uwagę mikroorganizmów.
Wymieniają tutaj możliwość zmniejszenia bioróżnorodności drobnoustrojów, zmianę fizjologii bakterii, a tym samym modyfikację obiegu substancji odżywczych, prawdopodobną zdolność mikroorganizmów do modyfikowania właściwości fizycznych nanomateriałów, a także degradację nanomateriałów i możliwość przenoszenia tych związków na wyższe poziomy troficzne. Z kolei, Handy i in. (2012) wskazują na konieczność udoskonalania metod badania rodzaju oddziaływań nanomateriałów na organizmy żywe wskazując jednocześnie słabe strony obecnie stosowanych metodyk, np. pomijanie wpływu oddziaływań mechanicznych, czy ogólny problem odniesienia badań laboratoryjnych in vitro do sytuacji panującej w środowisku. Autorzy ci sugerują, że w badaniach dotyczących gleby należy ująć m.in. zjawisko absorbcji nanomateriału do cząstek gleby, a także aby prowadzić prace nad dostępnością badanego materiału na możliwie największej powierzchni. W badaniach dotyczących wody istotnym ograniczeniem jest też słaba rozpuszczalność niektórych nanostruktur (np. grafenu), co przekłada się na problemy z powtarzalnością wyników. Należy zauważyć, ze w środowisku naturalnym nanostruktury, mogą wykazywać inną aktywność niż w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych (Holden i in. 2014). Podejrzewa się, że nanomateriały w środowisku naturalnym mogą powodować zubożenie bioróżnorodności, co może wpłynąć negatywnie na lokalny mikrobiom. Praca Ge i in. (2012) ukazuje wahania liczebności różnych drobnoustrojów po wprowadzeniu do gleby nanocząstek zbudowanych z tlenków metali (TiO 2 i ZnO). Z badań tych wynika interesująca zależność. Zgodnie z założeniem, badane nanomateriały były w opisywanym układzie toksyczne wobec większości wziętych pod uwagę mikroorganizmów, jednak liczebność bakterii z rodzaju Streptomyces zaczęła wzrastać. Zastanawiające jest czy ta zmiana polegała na zasiedlaniu zwolnionej przez inne drobnoustroje niszy ekologicznej czy wynikała ze stymulacji bakterii nanomateriałem? W powyższej pracy oznaczono także obecność zewnątrzkomórkowych proteaz, które są aktywnie wytwarzane m.in. przez promieniowce z rodzaju Streptomyces. Mimo, iż badacze nie wskazują na bezpośredni związek tych faktów, wyniki mogą sugerować efekt stymulacji aktywności enzymatycznej tych bakterii poprzez nanomateriał. Inne dane literaturowe również wskazują na możliwość stymulacji bakterii przez nanomateriał, np. w przypadku bakterii Shewanella oneidensis. Stwierdzono, że w układzie badawczym zawierającym ditlenek tytanu, bakteria ta zwiększała sekrecję flawin, co mogło być związane ze jej zdolnością do redukcji metali. Dodatkową zależnością wynikającą z przytoczonych badań było spowolnienie wytwarzania biofilmu związane najprawdopodobniej z wolniejszym przyrostem biomasy w układzie zawierającym nanomateriał (Maurer-Jones i in. 2013). Wydaje się, że obecność nanomateriałów może spowodować także obniżenie plonowania roślin, co zostało wykazane przez Priester i in. (2012), na przykładzie uprawy soi z wykorzystaniem nawozu zawierającego nanomateriały w postaci nanocząstek tlenku cynku i ditlenku cezu. Nanostruktury te negatywnie wpłynęły na plonowanie i proces obiegu azotu w glebie. Ponadto, stwierdzono obecność tlenku cezu w jadalnych częściach rośliny. Wskazane wyniki sugerują, że nanomateriały w
środowisku naturalnym mogą ulegać akumulacji w roślinach i wpływać na zmianę właściwości konsorcjów mikroorganizmów glebowych. Kumar i in. (2011) na podstawie wyników uzyskanych w badaniach konsorcjów bakteryjnych z gleb arktycznych także potwierdzają, że stosowanie nanocząstek srebra może wpłynąć na zmniejszenie liczebności bakterii wiążących azot, takich jak przedstawiciele rodzaju Bradyrhizobium, których metabolizm jest korzystny dla rozwoju roślin, szczególnie w rejonach o niskiej średniej temperaturze rocznej. Aberracje w funkcjonowaniu bakterii glebowych wywołane nanomateriałami mogą więc przyczynić się do pogorszenia warunków uprawy roślin. Nanotechnologia wykorzystywana jest w mikrobiologii najczęściej ze względu na bakterio- i grzybobójcze właściwości nanomateriałów. Nie jest to jednak predykat oddziaływania tych struktur na drobnoustroje w środowisku naturalnym. W danych źródłowych znajdują się przykłady drobnoustrojów, które zdolne są do wykazywania oporności względem nanocząstek. Przykładem takiej bakterii jest Pseudomonas aeruginosa PAO1, która wykształciła mechanizmy obronne w stosunku do kropek molekularnych kadmu i selenu w środowisku. Uwolnione z nanocząstek jony przenikały przez ścianę komórkową, a następnie były wydalane z komórki przez system wypływu (ang. efflux system) lub przekształcane w komórce na nowe nanocząstki wydzielane na zewnątrz (Yang i in. 2012). Bakterie i grzyby zdolne do biosyntezy nanomateriałów są interesującymi przykładami oddziaływania mikroorganizmów z produktami nanotechnologii, gdyż nie tylko przeżywają w obecności metali ciężkich (Ti, Ag, Se, Cd), ale także część z nich potrafi je akumulować i formować z nich nowe nanostruktury, które są unikalne pod względem kształtu i właściwości. Przykładem takich bakterii są m.in. przedstawiciele rodzajów: Pseudomonas, Arthrobacter i Marinobacter, a także grzybów z rodzajów: Aspergillus, Fusarium, Trichoderma oraz drożdży. Metodami inżynierii genetycznej udało się ponadto pozyskać szczep Escherichia coli, który jest zdolny do syntezy kropek kwantowych (QD) o różnych właściwościach optycznych (Nawrotek i Augustyniak 2015). Niektórzy autorzy sugerują, że nanomateriały mogą być w przyszłości wykorzystywane jako substancje wspomagające działanie antybiotyków. Takie stwierdzenie pojawiło się w dyskusji do badań dotyczących nanocząstek srebra, których rezultatem była istotna poprawa właściwości bakteriobójczych ampicyliny, chloramfenikolu, erytromycyny i kanamycyny (Fayaz i in. 2010). W kontradykcji stoją jednak eksperymenty wykonane przez Qiu i in. (2012), których wyniki sugerują, że obecność nanomateriałów w środowisku naturalnym może wzmagać zjawisko horyzontalnego transferu genów (ang. horizontal gene transfer; HGT). Badania prowadzone z wykorzystaniem bakterii z rodzajów Escherichia i Salmonella wykazały dwustukrotny wzrost HGT w stosunku do kontroli, co świadczy o potencjalnym ryzyku przekazywania genów oporności na antybiotyki. Może się więc okazać, że synergizm działania antybiotyku i nanomateriału nie stanowi pełnego rozwiązania problemu. W tym kontekście wymagane są dalsze badania, które szczegółowo określą mechanizm wzbudzania zjawiska HGT pod wpływem nanomateriałów.
Coraz większe zainteresowanie badaczy budzi zagadnienie biodegradacji nanomateriałów w środowisku naturalnym. Do tej pory stosunkowo dobrze udokumentowana jest degradacja nanomateriałów zbudowanych z węgla, takich jak jedno- i wielościenne nanorurki węglowe (ang. single- and multiwalled carbon nanotubes; SWCNT i MWCNT). Zhang i in. (2013) wykazali, że biodegradacji tych nanostruktur może dokonać konsorcjum bakteryjne złożone z następujących gatunków: Burkholderia kururiensis, Delftia acidovorans i Stenotrophomonas maltophilia. Z drugiej strony niewiele jest danych na temat biodegradacji nanomateriałów złożonych, np. materiałów krzemowych modyfikowanych metalami lub tlenkami metali, czy stosunkowo nowych nanomateriałów, w tym zwłaszcza takich jak grafen. Ze względu jednak na jego hydrofobowość badania prowadzi się głównie na tlenku grafenu, który można łatwiej zdyspergować. Właściwości hydrofobowe grafenu mogą stanowić przyczynę toksyczności tego związku, ponieważ w takiej formie może on potencjalnie reagować z lipidami błonowymi powodując dezintegrację błony komórkowej (Sanchez i in. 2012). Mikroorganizmy środowiskowe zdolne są do akumulowania różnorodnych zanieczyszczeń w komórkach. Dotyczy to także nanomateriałów i zostało udokumentowane na przykładzie bakterii Pseudomonas spp. (Nawrotek i Augustyniak 2015). Doświadczenia własne wskazują również na możliwość akumulacji tytanu w komórkach Streptomyces. Budzi to jednak obawy dotyczące możliwości przenoszenia tych substancji na wyższe poziomy troficzne, co zostało potwierdzone u pierwotniaków z rodzaju Tetrahymena, które żerowały na bakteriach z rodzaju Pseudomonas. Podobną zależność potwierdzono na modelu z rozwielitkami. Prace te dowodzą, że nanocząstki mogą ulegać w środowisku naturalnym tzw. biomagnifikacji, czyli procesowi, który polega na zwiększaniu stężenia danego czynnika kontaminującego na wyższych poziomach troficznych (Holden i in. 2014; Nawrotek i Augustyniak 2015). Istotną kwestią jest także biodostępność nanomateriałów, która może się zmieniać w zależności od rodzaju zanieczyszczonego nimi środowiska. W badaniach nad ditlenkiem tytanu (np. P25 ntio 2) stwierdzono, że charakter chemiczny tego związku zmienia się po przejściu do ścieków. Produkowany jako hydrofilowy, w środowisku staje się hydrofobowy i tym samym bardziej dostępny dla mikroorganizmów glebowych (Priester i in. 2013). Potwierdza to potrzebę indywidualnego podejścia do problematyki badań dotyczących oddziaływania nanomateriałów na ekosystemy. 4. Podsumowanie Nie ulega wątpliwości, że nanomateriały na stałe już zagościły w ludzkim otoczeniu. Obecne są nie tylko w produktach dostępnych na rynku, ale także w środowisku naturalnym, do którego przenikają, niekiedy bezpośrednio dodawane w postaci nawozów sztucznych. W dalszym ciągu nie uzyskano wystarczającej ilości danych eksperymentalnych, które jednoznacznie pokazywałyby jakie będą konsekwencje przedostawania się produktów nanotechnologii do ekosystemów wodnych i lądowych. Związane jest to przede wszystkim z dużą różnorodnością i szerokim zakresem zastosowań tych struktur. Aktualna wiedza dotycząca oddziaływania produktów nanotechnologii na organizmy żywe wskazuje na fakt, że
każdy nanomateriał w środowisku należy traktować indywidualnie i każdorazowo dostosowywać do niego odpowiedni układ badawczy uwzględniający warunki, w których funkcjonuje. Wymagane są dalsze badania, które ustalą zarówno dalsze losy nanomateriałów w środowisku naturalnym, a także zostaną wykorzystane do stworzenia systemu kontroli ich stosowania i uwalniania w ekosystemach. 5. Literatura Adil SF, Assal ME, Khan M i in. (2015) Biogenic synthesis of metallic nanoparticles and prospects toward green chemistry. Dalton Transactions 44: 9709 9717. Cendrowski K, Peruzynska M, Markowska-Szczupak A i in. (2013) Mesoporous silica nanospheres functionalized by TiO 2 as a photoactive antibacterial agent. Journal of Nanomedicine & Nanotechnology 4: 1 6. Fayaz AM, Balaji K, Girilal M i in. (2010) Biogenic synthesis of silver nanoparticles and their synergistic effect with antibiotics: a study against Gram-positive and Gram-negative bacteria. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 6: 103 109. Ge Y, Schimel JP, Holden PA (2012) Identification of soil bacteria susceptible to TiO 2 and ZnO nanoparticles. Applied and Environmental Microbiology 78: 6749 6758. Gray BP, Li S, Brown KC (2013) From phage display to nanoparticle delivery: Functionalizing liposomes with multivalent peptides improves targeting to a cancer biomarker. Bioconjugate Chemistry 24: 85 96. Guo M, Ling T, Poon C (2013) Nano-TiO 2-based architectural mortar for NO removal and bacteria inactivation: Influence of coating and weathering conditions. Cement and Concrete Composites 36: 101 108. Handy RD, Cornelis G, Fernandes T (2012) Nanomaterials in the Environment. Environmental Toxicology and Chemistry 31(1): 15 31. Holden PA, Schimel JP, Godwin HA (2014) Five reasons to use bacteria when assessing manufactured nanomaterial environmental hazards and fates. Current Opinion in Biotechnology 27: 73 78. Kumar N, Shah V, Walker VK (2011) Perturbation of an arctic soil microbial community by metal nanoparticles. Journal of Hazardous Materials 190: 816 822. Maurer-Jones MA, Gunsolus IL, Meyer BM i in. (2013) Impact of TiO 2 nanoparticles on growth, biofilm formation, and flavin secretion in Shewanella oneidensis. Analytical Chemistry 85: 5810 5818. Mohan T, Verma P, Rao DNS (2013) Novel adjuvants & delivery vehicles for vaccines development: A road ahead. Indian Journal of Medical Research 138: 779 795. Narayanan KB, Sakthivel N (2010) Biological synthesis of metal nanoparticles by microbes. Advances in Colloid and Interface Science 156: 1 13. Nawrotek P, Augustyniak A (2015) Nanotechnologia w mikrobiologii wybrane aspekty. Postępy Mikrobiologii 54 (3): 275 282. Paredes D, Ortiz C, Torres R (2014) Synthesis, characterization, and evaluation of antibacterial effect of Ag nanoparticles against Escherichia coli O157:H7 and
methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). International Journal of Nanomedicine 9: 1717 1729. Piccinno F, Gottschalk F, Seeger S i in. (2012) Industrial production quantities and uses of ten engineered nanomaterials in Europe and the world. Journal of Nanoparticles Research 14: 1 11. Priester JH, Ge Y, Chang V i in. (2013) Assessing interactions of hydrophilic nanoscale TiO 2 with soil water. Journal of Nanoparticles Research 15(1899): 1 13. Priester JH, Ge Y, Mielke RE i in. (2012) Soybean susceptibility to manufactured nanomaterials with evidence for food quality and soil fertility interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 109: 14734 14735. Qiu Z, Yu Y, Chen Z i in. (2012) Nanoalumina promotes the horizontal transfer of multiresistance genes mediated by plasmids across genera. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 109: 4944 4949. Sanchez VC, Jachak A, Hurt RH i in. (2012) Biological Interactions of Graphene- Family Nanomaterials An Interdisciplinary Review. Chemistry Research in Toxicology 25(1): 15 34. Yang Y, Mathieu JM, Chattopadhyay S, i in. (2012) Defense mechanisms of Pseudomonas aeruginosa PAO1 against quantum dots and their released heavy metals. ACS Nano 6: 6091 6098.