Veterinary and zoonotic impact of swine influenza virus - from myths to facts Ramona Trebbien, Lars Erik Larsen National Veterinary Institute; Denmark Abstract Influenza A virus infects a number of species, including swine, humans and birds. In general, influenza A viruses are species specific, but there are several examples of viruses jumping from one species to another. Since pigs seem to have receptors for both avian and human influenza subtypes, pigs has been regarded as a possible mixing vessel for new influenza subtypes. There are two important aspects linked to influenza A infections in pigs. First, influenza A virus infections is a common cause of respiratory disease and abortions in swine. The impact on the production economic and animal welfare of influenza A are in our opinion underestimated. Secondly, the latest outbreak of a new influenza A in humans (the so called swine influenza, Mexican flu or newh1n1) has sparked an increasing public focus on the zoonotic potential of swine influenza viruses which the pig producers and advisers have to deal with in the future. The review deals with the pathogenesis, epidemiology, host range determinants, pathology, clinical signs and control of swine influenza from a veterinary point of view. Key words: swine influenza, epidemiology, host range determinants, pathology, control 1
Weterynaryjne i zoonotyczne znaczenie wirusa grypy świń - od mitów do faktów Ramona Trebbien, Lars Erik Larsen Państwowy Instytut Weterynaryjny w Kopenhadze, Dania Grypa jest jedną z najbardziej rozpowszechnionych i najstarszych chorób ludzi. Została ona opisana przez Hipokratesa już w 412 roku przed naszą erą. Grypa świń po raz pierwszy została stwierdzona w 1918 roku. Zbiegło się to w czasie z wystąpieniem pandemii grypy ludzi, znanej jako Hiszpanka, w wyniku której zmarły miliony osób na świecie. Nazewnictwo Różnorodność podtypów wirusa grypy typu A zdeterminowana jest glikoproteinami powierzchniowymi - HA i NA. Jest to związane z odpowiedzią serologiczną przeciwko wymienionym antygenom powierzchniowym, które już historycznie wykorzystywane były do określania podtypu wirusa. Obecnie do charakterystyki szczepów, uwzględniającej określenie podtypu, stosowane są nowe techniki. Bazując na metodach serologicznych, a w ostatnich latach także na sekwencjonowaniu genomu, odkryto 16 różnych podtypów HA i 9 podtypów NA. Wszystkie znane dotychczas podtypy izolowano z populacji ptaków wodnych, które uznawane są za główny rezerwuar wirusa grypy (Webster i wsp., 1992). Nazwa wirusów grypy obejmuje literę wskazującą na typ (A, B lub C), gatunek zwierzęcia (jedynie w przypadku izolatów ludzkich nie podaje się tej informacji w nazwie szczepu), miejsce izolacji, kolejny numer izolacji w laboratorium, rok izolacji i podtyp szczepu. Przykładowo szczep typu A wyizolowany w 2003 roku od świń w Danii posiada nazwę: A/świnia/Dania/12687/2003(H1N2). 2
Dryft genetyczny Właściwości antygenowe wirusów grypy ulegają ciągłym zmianom. W czasie syntezy genomu dochodzi niekiedy do zaburzenia transkrypcji, co wynika z właściwości wirusowej polimerazy RNA, która nie posiada właściwości autokorekty. Sprzyja to występowaniu mutacji, których częstotliwość podczas transkrypcji szacowana jest na około 1,5 x10-5 (Parvin i wsp., 1986). Presja selekcyjna powoduje pojawianie się mutacji najbardziej korzystnych dla wirusa, sprzyjając tworzeniu dominujących quasi gatunków. Proces ten określany jest jako dryft genetyczny. Zjawisko to jest szczególnie ważne i występuje głównie w odniesieniu do szczepów ludzkich, co prawdopodobnie związane jest z faktem dłuższej przeżywalności ludzi i większej częstotliwości reinfekcji w czasie niemal corocznych epidemii choroby. Częstotliwość występowania dryftu genetycznego u świń jest mniejsza, co wiąże się z tym, że świnie żyją znacznie krócej, w porównaniu do ludzi. Oznacza to, że szczepy wirusów grypy krążące w populacji trzody chlewnej są znacznie bardziej stabilne genetycznie, w porównaniu do ludzkich (de Jong i wsp., 2007). Jeśli mutacje wpłyną na zmianę właściwości antygenowych konsekwencją dryftu antygenowego będzie ucieczka wirusa spod kontroli układu immunologicznego gospodarza. Szyft genetyczny (skok antygenowy) Skok antygenowy ma miejsce wówczas, gdy komórka gospodarza zakażona zostanie jednocześnie dwoma różnymi szczepami wirusa grypy o różnych właściwościach genetycznych i w czasie replikacji dojdzie do wymiany segmentów genomu, czego konsekwencją będzie powstanie szczepu o nowej konstelacji genów. W przedstawionym przypadku jednoczesnej koinfekcji komórki dwoma szczepami, z uwagi na możliwość wymiany każdego z 8 segmentów, mogą powstać 254 możliwe kombinacje genetyczne. Należy zaznaczyć, że nie każda reasortacja genów musi skutkować zmianą właściwości antygenowych szczepu, jak wiadomo są one związane z białkami HA i NA. Nie mniej jednak zmiana genetyczna dotycząca innych segmentów genomu 3
może powodować zmianę właściwości biologicznych wirusa, np. może determinować zmianę adaptacji do gospodarza bądź zmianę zjadliwości szczepu. W czasie epidemii grypy w Hong Kongu, w 1997 roku, spowodowanej szczepem podtypu H5N1, 18 osób uległo zakażeniu wysoce patogennym szczepem wirusa grypy ptasiej (HPAI) H5N1; 6 osób zmarło w wyniku ciężkiego zapalenia płuc i niewydolności oddechowej (Chan, 2009). Był to pierwszy udokumentowany przypadek bezpośredniej infekcji człowieka przez wirusa grypy ptasiej i przełamania bariery gatunkowej człowiek-ptak. Dawniej sądzono, że do tego celu niezbędny jest udział dodatkowego, pośredniego gospodarza. Za tzw. mikser wirusów grypy uznawano organizm świni. Było to spowodowane rozmieszczeniem receptorów wiążących wirusa grypy i zbliżonym powinowactwem receptorów do wirusów atakujących inne gatunki, w tym przede wszystkim ludzi i ptaki. W piśmiennictwie opisano przypadki naturalnego zakażenia świń szczepami o różnych podtypach i pochodzących od różnych gospodarzy pierwotnych. Wyniki przeprowadzonych w tym zakresie badań pokazały, że świnie poza pełną wrażliwością na zakażenie szczepami świńskimi, są także podatne na zakażenie szczepami ptasimi i ludzkimi (Kida i wsp., 1994). Szczególnie w krajach słabo rozwiniętych, gdzie występują gorsze warunki chowu i brak jest pewnych zabezpieczeń uniemożliwiających bezpośredni kontakt pomiędzy zwierzętami różnych gatunków, może dojść do przedstawionych zmian genetycznych. Wolno żyjące zwierzęta różnych gatunków żyjące na tym samym obszarze, oraz w bliskim kontakcie z człowiekiem, stanowią zagrożenie i predysponują do międzygatunkowej transmisji wirusów grypy, stwarzając idealne warunki do tworzenia reasortantów. Specyficzność gatunkowa i zakażenia międzygatunkowe Ptaki wodne uznawane są za naturalny rezerwuar wirusów grypy typu A, ponieważ, jak wspomniano powyżej, wszystkie znane podtypy HA (H1-16) i NA (N1-9) były izolowane od 4
ptaków. Wirusy grypy atakujące ptaki dzieli się na dwie grupy, zależnie od ich zjadliwości na szczepy charakteryzujące się niską patogennością (LPAI) oraz szczepy o wysokiej patogenności (HPAI). Szczepy o niskiej patogenności wywołują chorobę o słabo lub średnio wyrażonych objawach klinicznych, od nietypowych (przebieg niesymptomatyczny) do typowego zakażenia górnych dróg oddechowych przebiegającego z wysoką zakaźnością i niską śmiertelnością. Wysoce patogenne wirusy wywołują infekcje systemowe o ciężkim przebiegu, wyrażające się m. in. spadkiem nieśności oraz wysoką śmiertelnością, sięgającą nawet do 100% zainfekowanych ptaków (Alexander, 2000). W wyniku zmian genetycznych polegających na insercji (podstawieniu) aminokwasów w miejscach cięcia hemaglutyniny w szczepach LPAI może dojść do zmiany ich patogenności i przekształcenia się w szczepy HPAI. Powoduje to, że szczepy HPAI stają się podatne na działanie proteaz komórkowych tnących nieaktywną cząsteczkę HA na dwie podjednostki HA1 i HA2. Stwarza to wirusowi warunki do zakażania komórek organizmu ptaka (Senne i wsp., 1996). Wysokim powinowactwem gatunkowym cechują się szczepy wirusa grypy typu A krążące w populacji ludzi i trzody chlewnej. Także inne gatunki ssaków wykazują wrażliwość na zakażenie wirusami grypy należącymi do typu A, wśród nich wymienić należy konie (H7N7, H3N8), foki (H1N1, H3, H6, H3N2, H7N7, H3N3, H4N5, H4N6), wieloryby (H13N2, H13N9), norki (H10N4, H10N7, H3N2, H1), wielbłądy (H1N1)(Yamnikova i wsp., 1993), koty (H5N1) oraz psy (H3N8, H3N2, H5N1)(Harder and Vahlenkamp, w druku ). U kotów wykryto obecność przeciwciał dla wirusów grypy typu A, ponadto zanotowano jeden przypadek infekcji bydła szczepem H3N2 (Brown i wsp., 1998). Wirusy grypy krążące w populacji ludzi i świń należą zasadniczo do 3 podtypów: H1N1, H1N2 i H3N2. Wykazano możliwość międzygatunkowej transmisji wirusów pomiędzy tymi dwoma gatunkami, stwierdzono, że zarówno zakażone świnie mogą być źródłem infekcji dla ludzi, 5
jaki i zakażeni ludzie, będący siewcami wirusa, mogą infekować świnie. Także wirusy grypy ptasiej mogą zakażać świnie. W ostatnich latach udowodniono, że wirusy grypy ptasiej zdolne są do bezpośredniej infekcji ludzi. Różne czynniki mogą wpływać na specyficzność gatunkową i ekologię wirusów grypy, jednym z bardziej istotnych wydaje sie być sam makroorganizm (gospodarz). Udowodniono, że czynnikami determinującymi specyficzność gatunkową są molekularne komponenty genomu wirusa np. wirusowe polimerazy oraz HA (Matrosovich i wsp., 2009). Lokalizacja receptorów w organizmie gospodarza może determinować, czy komórki wykazują wrażliwość czy nie są wrażliwe na zakażenie określonym szczepem wirusa grypy. Utrzymywanie zwierząt w systemie hodowli otwartej, w porównaniu do chowu zamkniętego, może zwiększać ryzyko transferu wirusa z rezerwuaru, jakim są zwierzęta wolno żyjące. Także utrzymywanie w jednym gospodarstwie różnych gatunków zwierząt, np. drobiu i świń, stwarza idealne warunki do transmisji międzygatunkowej. W Norwegii opisano przypadek transmisji pandemicznego szczepu wirusa grypy - pandemic H1N1 od pracownika obsługi do świń (Hofshagen i wsp., 2009). Także zachowanie zwierząt (ich odruchy behawioralne) oraz przemieszczanie zwierząt sprzyjają transmisji wirusa, w związku z czym są one wymieniane jako czynniki ryzyka. Dostęp zwierząt wolno żyjących do chorych ptaków lub ich zwłok także może stanowić poważny problem. W czasie występowania ognisk grypy spowodowanej szczepem podtypu H5N1 zjadanie surowego, nie poddanego obróbce termicznej mięsa drobiowego uznano z czynnik ryzyka dla ludzi. Ważną rolę mogą odgrywać także różnice fizjologiczne pomiędzy potencjalnymi gospodarzami. Przykładem może być mucyna obecna w drogach oddechowych, która może osłabiać wirusa lub nawet go inaktywować u niektórych gatunków (Gagneux i wsp., 2003). Rozmieszczenie receptorów we wrażliwych na zakażenie tkankach gospodarza jest 6
prawdopodobnie istotnym czynnikiem ułatwiającym wirusowi infekcję. Niektóre osobniki mogą siać większe ilości wirusa w czasie infekcji, zwiększając tym samym ekspozycję otoczenia na zakażenie. Ryc.1. Schemat międzygatunkowej transmisji wirusów grypy typu A (źródło: http://english.shanghaipasteur.cas.cn/ph/kb/200906/w020090630748385856765.jpg) Patogeneza Grypa świń to infekcja dróg oddechowych. Wirus przedostaje się do układu oddechowego wraz z wdychanym powietrzem (zakażenie aerozolowe), ale do zakażenia może również dojść poprzez zainfekowaną paszę, wodę oraz powierzchnie siedliska hodowlanego. Infekcja rozpoczyna się w górnych drogach oddechowych, wirus replikuje głównie w komórkach nabłonka nosa, tchawicy i oskrzeli. Zmiany chorobowe mogą rozwijać się szybko, obejmując stopniowo kolejne odcinki dróg oddechowych, w ciągu kilku godzin po zakażeniu większość komórek układu oddechowego może być objęta procesem zapalnym. W przypadku niepowikłanego przebiegu choroby zmiany ustępują w ciągu kilku dni (zazwyczaj do tygodnia), zazwyczaj z powodu osłabienia organizmu dochodzi jednak do nadkażenia bakteriami, w wyniku czego objawy chorobowe ulegają nasileniu. 7
Siewstwo wirusa z wydzieliną z jamy nosowej można zaobserwować już od 1 dnia po zakażeniu, może się ono utrzymywać do 7 dni (Brown, 1993;Choi, 2004). Wirus wykazuje tropizm przede wszystkim do tkanki płucnej, komórkami docelowymi są przede wszystkim komórki nabłonka oskrzelików. Miano wirusa w tkance płucnej jest zwykle wysokie, niemniej jednak utrzymuje się ono krótko, zwykle 2-3 dni. Izolacja wirusa z płuc nie jest zwykle skuteczna po upływie 7 dni od zakażenia. Cytokiny wydzielane w organizmie gospodarza, w odpowiedzi na zakażenie wirusem grypy, odgrywają prawdopodobnie główną rolę w rozwoju grypy świń powodując dysfunkcję układu oddechowego, rozwój procesu zapalnego, gorączkę, apatię oraz utratę apetytu. Zwykle nie dochodzi do wiremii w przebiegu grypy świń, aczkolwiek jest to możliwe, towarzyszy jej zwykle niskie miano wirusa utrzymujące się przez krótki okres czasu (Brown, 1993). Replikacja wirusa grypy świń poza układem oddechowym nie została dotychczas udowodniona (Choi, 2004). Objawy chorobowe Objawy chorobowe związane z grypą świń manifestują się ostrym stanem zapalnym dróg oddechowych, z towarzyszącą mu gorączką, brakiem apetytu, utratą masy ciała, apatią, kaszlem, dusznością, wypływem z oczu i nosa. Wtórne infekcje bakteryjne, wikłające obraz chorobowy, zdarzają się często, co wpływa na zaostrzenie objawów chorobowych. Zachorowalność jest zwykle wysoka, natomiast wskaźnik śmiertelności na ogół jest niski. W przypadku niepowikłanego przebiegu grypy choroba zwykle ustępuje samoistnie, w wyniku sekrecji przeciwciał ochronnych. Na ogół grypa przebiega jako choroba stada, a objawy chorobowe typowe dla zainfekowanego stada to: podwyższenie wewnętrznej ciepłoty ciała, osłabienie, apatia, niechęć do ruchu, a nawet do picia, zapalenie spojówek, kaszel i duszność. Lochy z wysoką gorączką mogą ronić, czego 8
konsekwencją może być niepłodność. Jeśli zakażeniu stada wirusem grypy nie towarzyszą inne wtórne infekcje w ciągu kilku tygodni dochodzi do samoistnego (spontanicznego) wyleczenia stada. Świnie wykazują wrażliwość na zakażenie wirusami grypy typu A o odmiennym niż świńskie pochodzeniu genów. Objawy choroby mogą być zróżnicowane, zależnie od podtypu wirusa zakażającego. Przykładowo wirus podtypu H4N6 przeniesiony na świnie w Kanadzie spowodował wystąpienie grypy o przebiegu zbliżonym do klasycznej grypy świń (Karasin i wsp. 2000; Karasin, 2000). W Chinach podtyp H9N2 spowodował znacznie cięższy przebieg choroby, prawdopodobnie z powodu koinfekcji z wirusem PRRS (Guo i wsp., 2000). U ludzi zakażonych wirusem grypy ptasiej H5N1 przebieg choroby może być bardzo ciężki, zakończony zejściem śmiertelnym zainfekowanych pacjentów. Zaskakującym był fakt, że zmarła młoda, pierwotnie zdrowa osoba. W przebiegu grypy H5N1 w roku 1997, w Hong Kongu, podobnie jak miało to miejsce w czasie pandemii grypy H1N1 w roku 1918, obserwowano zapalenie płuc, nadprodukcję cytokin w płucach oraz wielonarządowe zaburzenia czynnościowe (Korteweg i wsp., Gu, 2008;Subbarao i wsp., 1998;Taubenberger, 2006). Taki gwałtowny przebieg choroby nie został dotychczas opisany w odniesieniu do trzody chlewnej. W przeciwieństwie do tego, zakażenie świń szczepami wirusa grypy podtypu H5N1 skutkowało jedynie łagodnie wyrażonymi objawami lub choroba przebiegała subklinicznie (Lipatov i wsp., 2008). Epidemiologia Na półkuli północnej grypę obserwuje się najczęściej w sezonie jesienno-zimowym. Czynnikiem szczególnie predysponującym jest wprowadzenie nowych świń nosicieli wirusa do wrażliwej populacji. Często choroba występuje jednocześnie w różnych chlewniach zlokalizowanych w tym samym regionie. Straty spowodowane wystąpieniem grypy w stadzie są znaczne z powodu wysokiego wskaźnika zachorowalności. Najważniejszymi czynnikami ryzyka są: przemieszczanie zwierząt, ochłodzenie oraz nieodpowiednia wentylacja. Do zakażenia dochodzi 9
najczęściej poprzez bezpośredni kontakt zwierząt zdrowych i zakażonych, główną bramą poprzez którą wirus dostaje się do organizmu jest nos i gardło, a miano wirusa w wydzielinie z nosa wynosi >10 7 cząstek zakaźnych/ml (Landolt i wsp., 2003;Van Reeth i wsp., 2003). Wirusy, które przedostaną się do stada krążą w nim tak długo, dopóki w stadzie znajdują się osobniki immunologicznie naiwne. Czynniki stresogenne zwiększają podatność stada na zakażenie. Ostry przebieg z szybkim rozprzestrzenianiem się infekcji i możliwymi zaburzeniami w rozrodzie obserwuje się na ogół w stadach, które nie miały wcześniej kontaktu z wirusem i nie posiadają swoistej odporności przeciwko wirusowi grypy. Przetrwałe zakażenie pojedynczych osobników powoduje, że choroba może utrzymywać się w stadzie i z chwilą wprowadzenia do niego nowych świń dochodzi do ponownego jej wybuchu, dotyczy to najczęściej tuczarni. Nietypowy przebieg choroby obserwuje się w stadach, w których jedynie pewne grupy wiekowe demonstrują kliniczne objawy zakażenia, co najczęściej dotyczy tuczników w wieku 4-6 miesięcy nie posiadających odporności biernej laktogennej. Zmiany sekcyjne Zmiany widoczne po przechorowaniu grypy świń dotyczą układu oddechowego. Zmiany w płucach zlokalizowane mogą być we wszystkich płatach, mają one wygląd silnie zaczerwienionych ognisk zapalnych, stwardnień, niekiedy widoczny jest wysięk. Najczęściej obserwuje się je w części doczaszkowej (w płatach szczytowych i sercowych). 10
Ryc.2. Zmiany patologiczne w płucach świni zakażonej wirusem grypy Ryc.3. Wynik badania immunohistochemicznego skrawków płuc świni zakażonej wirusem grypy Profilaktyka swoista Dostępne są szczepionki przeciwko grypie świń. Rozważając ich stosowanie należy wziąć pod uwagę ryzyko wystąpienia dryftu i szyftu genetycznego w szczepach terenowych krążących w 11
danej populacji, których konsekwencją może być brak skuteczności profilaktyki swoistej. Dotyczy to przede wszystkim ludzi, u których częstotliwość zmian genetycznych jest bardzo duża, co stanowi poważny problem dla producentów szczepionek i wiąże się z koniecznością corocznej aktualizacji składu szczepionek przeciwko grypie sezonowej. Wirusy grypy świń nie ulegają tak częstym mutacjom, jak szczepy ludzkie, co wynika z krótkiej żywotności świni. Nie mniej jednak mutacje punktowe także akumulują się w szczepach wirusów grypy świń, w związku z czym należy testować szczepionki pod kątem ich powinowactwa do szczepów krążących w populacji w danym czasie. Aby zapewnić wysoką skuteczność szczepień należy je prowadzić w połączeniu z monitoringiem serologicznym zwierząt, pod kątem charakterystyki krążących szczepów. Należy pamiętać, że szczepienie nie zawsze zabezpiecza przed zakażeniem i siewstwem wirusa, natomiast zabezpiecza ono przed wystąpieniem objawów choroby (Macklin i wsp., 1998). Dlatego trzeba o tym pamiętać, szczególnie wprowadzając naiwne immunologicznie zwierzęta do szczepionego stada, ponieważ jak wspomniano powyżej, świnie szczepione mogą być źródłem wirusa dla świń zdrowych (naiwnych). Rozpoznanie W diagnostyce grypy świń stosowanych jest wiele metod. Niektóre z nich były wykorzystywane bardziej intensywnie, inne rzadziej, zarówno w przeszłości, jak i obecnie. Do wykrywania przeciwciał dla wirusa grypy świń najczęściej używa się testu ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) lub zahamowania hemaglutynacji (Hemagglutination inhibition test, HI). Samo stwierdzenie obecności przeciwciał nie jest wystarczające do postawienia rozpoznania ostrej infekcji, w związku z czym stosuje się badanie par surowic pobranych od tych samych zwierząt w odstępie 3 tygodni. Wiele zwierząt starszych, głównie loch, posiada przeciwciała dla najczęściej krążących podtypów wirusa grypy świń dlatego nowe zakażenie może być potwierdzone jedynie 12
poprzez wykazanie co najmniej czterokrotnego wzrostu poziomu przeciwciał w badanych parach surowic. Na ogół, obok badań serologicznych w diagnostyce grypy stosuje się izolację wirusa. Do wykrywania wirusa grypy typu A także można zastosować kilka metod laboratoryjnych. Do tego celu wykorzystuje się zazwyczaj wycinki tkanki płucnej lub wymazy z nosa (te ostatnie wykorzystywane są w diagnostyce bardziej powszechnie). Izolacji wirusa można dokonać zarówno w hodowlach komórkowych, np. wyprowadzonych z komórek nerki świni lub psa, jak i z użyciem zarodków kurzych. Obydwie metodą są przydatne do izolacji wirusa z próbek pobranych przyżyciowo bądź pośmiertnie. W ostatnich latach metody klasyczne zostają wypierane przez metody molekularne, pozwalające na charakterystykę genomu wirusa, np. RT-PCR. Są one zwykle szybsze, bardziej czułe, umożliwiają jednoczesne przebadanie dużej liczby próbek, co czyni je idealnym narzędziem w szybkim wykrywaniu ognisk choroby. Zależnie od opracowanych starterów reakcji RT-PCR może być zastosowany do wykrywania wszystkich szczepów wirusa grypy, natomiast zastosowanie primerów charakterystycznych dla określonych typów HA i NA pozwala na określenie podtypu izolatu. Immunohistochemia (IHC) nie jest rutynowo wykorzystywana w rozpoznawaniu grypy świń, choć jest to metoda pozwalająca na wykrycie antygenu wirusa w skrawkach tkanki płucnej. Zastosowanie przeciwciał skierowanych przeciwko wirusowi grypy oraz systemu barwienia pozwala na określenie lokalizacji zainfekowanych wirusem pneumocytów (Haines i Clark, 1991). Piśmiennictwo u Autorów 13