Tom XXII Rośliny Oleiste 21 Błażej Springer, Andrzej Wojciechowski Akademia Rolnicza w Poznaniu, Katedra Genetyki i Hodowli Roślin Zgodność kojarzeniowa w krzyżowaniach między Brassica napus, i Cross compatibility in the crosses between, and Słowa kluczowe: Key words: Brassiceae, krzyżowanie oddalone, zgodność krzyżowa, łagiewki pyłkowe, fluorescencja Brassiceae, interspecific hybrids, cross compatibility, pollen tubes, fluorescence W prezentowanej pracy wykonano krzyżowania zwrotne między Brassica napus var. oleifera a ssp. sarson i var. botrytis sub. cymosa. Celem tych krzyżowań było ustalenie stopnia zgodności kojarzeniowej pomiędzy krzyżowanymi formami na podstawie obserwacji kiełkowania ziaren pyłku i wnikania łagiewek pyłkowych do poszczególnych części słupka oraz na podstawie stopnia wiązania nasion. Ogółem wykonano 73 krzyżowań w 16 kombinacjach. Największą zgodność zaobserwowano między i. W przypadku krzyżowań z stwierdzono jednokierunkową zgodność krzyżową. The reciprocal crosses between four genotypes of with and were attempted with the objective to find out crossability between them. The observations of pollen germination and penetration of pollen tubes into style were made. Generally 73 cross polinations were made in 16 cross combinations. The biggest crossability was observed when cultivars were used as a female parent in all cross combinations. showed higher cross compatibility than with. In the cross with unilateral cross compatibility has been observed. Wstęp Krzyżowanie oddalone między uprawnymi a dzikimi gatunkami Brassica jest ważnym sposobem introgresji pożądanych genów do form uprawnych (Wojciechowski i in. 1997). Umożliwia ono realizację nowych zadań przed jakimi staje współczesne rolnictwo i z tych względów stosowane jest w wielu programach hodowlanych (Barcikowska i Maćkowiak 1997; Starzycki i in. 1999). Poprzez krzyżowanie oddalone można przykładowo rozwiązać takie problemy jak uzyskanie form żółtonasiennych rzepaku, a więc charakteryzujących się obniżoną zawartością włóknika przy zachowanej podwyższonej zawartości tłuszczu i białka. Cechy te próbuje się przenieść z niektórych form.
328 Błażej Springer... W ostatnich latach wzrosło także zainteresowanie uprawą rzepaku wysokoerukowego. Genetycznym źródłem wysokiej zawartości kwasu erukowego mogą być np. rośliny z gatunku, spośród których spotykane są formy o wyższej zawartości tego kwasu niż u rzepaku ozimego (Taylor i in. 1994). Z powyższych względów w Katedrze Genetyki i Hodowli Roślin AR w Poznaniu realizowany jest program krzyżowań oddalonych, którego celem jest przeniesienie wartościowych cech użytkowych z i do rzepaku ozimego. W oddalonych krzyżowaniach roślin często występują bariery niezgodności kojarzeniowej uniemożliwiające otrzymywanie mieszańcowych nasion. Poznanie tych barier może znacznie przyspieszyć prace hodowlane nad doskonaleniem rzepaku. Materiał i metodyka Materiał badawczy stanowiły dwie odmiany: Leo, Mar i dwa rody rzepaku ozimego: i oraz ssp. sarson (rzepik jary żółtonasienny) i var. botrytis sub. cymosa (brokuł). Kontrolowane krzyżowanie zwrotne roślin wykonano w szklarni Katedry Genetyki i Hodowli Roślin Akademii Rolniczej w Poznaniu. W cyklu badawczym wykonano obserwacje dotyczące oceny zgodności krzyżowej na podstawie kiełkowania ziaren pyłku (ZP) na znamieniu słupka i wnikania łagiewek pyłkowych (ŁP) do poszczególnych jego części oraz na podstawie stopnia wiązania nasion. Obserwacje kiełkowania ZP i wzrostu ŁP wykonano w słupkach utrwalonych po 6, 12, 24 i 48 godzinach od zapylenia przy zastosowaniu techniki fluorescencyjnej według Martin a (1959). Ocenę stopnia kiełkowania łagiewek pyłkowych przeprowadzono w pięciostopniowej skali ( 4), gdzie brak łagiewek, 4 najliczniejsze łagiewki. Wyniki Wyniki obserwacji kiełkowania ziaren pyłku i wzrostu łagiewek pyłkowych przedstawiono w tabeli 1. W poszczególnych kombinacjach krzyżowania zaobserwowano różną intensywność kiełkowania łagiewek pyłkowych w poszczególnych częściach słupka. Na znamieniu słupka najwcześniej kiełkujące ZP zaobserwowano w krzyżowaniach zwrotnych z. Przy czym w kombinacji, gdzie stanowił formę mateczną nieliczne ZP kiełkowały już po 6 godzinach od zapylenia, a w krzyżowaniu odwrotnym dopiero po 12 godzinach. W szyjce słupka, po tym samym czasie od zapylenia więcej łagiewek pyłkowych obserwowano również w krzyżowaniach, w których użyto jako
Tabela 1 Stopień kiełkowania ziaren pyłku oraz wnikanie łagiewek pyłkowych do poszczególnych części słupka w zwrotnych krzyżowaniach, i Degree of pollen grain germination and penetration of pollen tubes into particular parts of pistil in reciprocal crosses of with and Forma rodzicielska Parental form ssp. sarson var. botrytis ssp. sarson 6 1 2 var. botrytis znamię stigma Kiełkowanie ziaren pyłku i wnikanie łagiewek pyłkowych w poszczególne części słupka* Germination of pollen grains and penetration of pollen tubes in particular parts of pistil* szyjka style zalążnia ovary Czas od zapylenia [godz.] Time after pollination [hours] wnikanie do zalążków entering into ovules 12 24 48 6 12 24 48 6 12 24 48 6 12 24 48 4 4 1 1 3 3 3 1 4 4 1 3 3 1 1 2 4 4 1 1 4 4 4 1 1 4 4 1 1 4 4 1 3 1 4 3 1 3 2 1 2 1 3 2 1 3 2 1 2 1 3 1 1 3 2 1 2 1 3 3 1 4 2 1 2 1 2 1 2 1 1 1 1 2 1 2 1 1 2 1 2 1 2 1 2 1 1 1 1 2 1 1 1 2 * Intensywność kiełkowania ziaren pyłku i wnikania łagiewek pyłkowych oceniana w skali 4, gdzie: brak kiełkowania, 4 najliczniejsze łagiewki Intensity of pollen grains germination and pollen tubes penetration evaluated on 4 scale, where: lack of germination/penetration 4 the largest number of germinated grains/penetrated pollen tubes
33 Błażej Springer... formę mateczną. Pomimo, że w zalążni w obu przypadkach obserwowano łagiewki, to jednak w żadnym przypadku nie zaobserwowano wnikania łagiewek do zalążków. Odmienne wyniki otrzymano w krzyżowaniach. W tym przypadku kiełkowanie ZP i wzrost łagiewek pyłkowych były znacznie słabsze w porównaniu z krzyżowaniem z. Na znamieniu słupka pierwsze kiełkujące ZP obserwowano dopiero po 24 godzinach od zapylenia i były one mniej liczne w porównaniu z krzyżowaniem (tab. 1). Również w szyjce słupka rosnące łagiewki pyłkowe obserwowano dopiero po 24 godzinach. W zalążni nieliczne łagiewki pyłkowe obserwowano tylko w krzyżowaniach i tylko w tym kierunku krzyżowania tych dwóch form zaobserwowano wnikanie łagiewek do zalążków. Wszystkie 4 genotypy zapylane pyłkiem zawiązały nasiona (tab. 2). Ogółem z tej kombinacji ze 137 zapylonych kwiatów otrzymano 135 nasion z 5 łuszczyn. W krzyżowaniach odwrotnych, tj., z 29 zapyleń otrzymano 16 łuszczyn i 21 nasion. W kombinacji tej nie otrzymano nasion, gdy do zapylania użyto pyłku odmiany Mar. Tabela 2 Efektywność krzyżowań pomiędzy, i The efficiency of crosses between, and Formy rodzicielskie Parental forms ssp. sarson var. botrytis zapylonych kwiatów pollinated flowers ssp. sarson 6 29 12 36 56 45 45 63 var. botrytis 34 29 36 67 39 56 6 63 Liczba Number of otrzymanych łuszczyn obtained siliques 22 12 6 1 9 4 2 1 3 4 1 otrzymanych nasion obtained seeds 19 38 23 55 16 2 3 4
Zgodność kojarzeniowa w krzyżowaniach... 331 W krzyżowaniach z zaobserwowano jednokierunkową niezgodność. Z krzyżowań otrzymano tylko 4 nasiona w kombinacji, w której formą mateczną była linia (). Krzyżowanie odwrotne było całkowicie nieefektywne nie otrzymano nasion. Dyskusja O możliwości skrzyżowania dwóch odległych systematycznie form decydują właściwości i stopień homologii ich genomów. Bariery otrzymywania roślin mieszańcowych z krzyżowań oddalonych dzielą się na prezygotyczne przed zapłodnieniem i postzygotyczne po zapłodnieniu (Michalik 1996). W praktyce hodowlanej stosuje się różnego rodzaju techniki umożliwiające pokonanie barier niekrzyżowalności, które w swojej pracy przedstawili Khush i Brar (1992). W niniejszej pracy celem było określenie stopnia zgodności krzyżowej z i. Wykonano krzyżowania zwrotne między 4 genotypami a i. Kiełkowanie łagiewek pyłkowych w poszczególnych częściach słupka oraz wiązanie nasion zależało od kierunku krzyżowania. W przypadku krzyżowań i zaobserwowano jednokierunkową niezgodność. Ten efekt jest opisywany przez wielu autorów w krzyżowaniach różnych gatunków Brassica (Harrison i Darby 1955, Wojciechowski 1985, Batra i in. 199, Guandimeda i in. 1992, Nanda i Shivanna 1993, Choudhary i Joshi 1999). We wszystkich kombinacjach krzyżówkowych większą zgodność krzyżową obserwowano, gdy formą mateczną był gatunek o wyższym stopniu ploidalności (). Podobne obserwacje poczyniło wielu autorów m.in. Choudhary i Joshi (1999), Quazi (1988), Olsson (196), Ramanujan i in. (1943). Odmienne od powyższych wyniki dotyczące zgodności krzyżowej między formami 2n i 4n opisali Wojciechowski i in. (1997). Obserwowali oni w krzyżowaniach wyraźnie lepsze kiełkowanie łagiewek pyłkowych, gdy gatunek o niższym poziomie ploidalności (diploidalny ) był formą mateczną. Wśród barier postzygotycznych, które utrudniają otrzymywanie nasion najczęściej wymienia się zamieranie mieszańcowych zarodków na skutek zaburzeń w rozwoju bielma (Wojciechowski 1985, Olsson 196). Ponadto Wojciechowski podaje, że przyczyną zamierania zarodków może być przerost tkanki somatycznej, która odcina rozwijającemu się zarodkowi dopływ substancji odżywczych. Reasumując: najwyższą zdolność kojarzeniową wykazały krzyżowania z B.campestris. W krzyżowaniu zwrotnym tych gatunków obserwowano penetrację łagiewek pyłkowych w poszczególnych częściach słupka, jednak były one nieliczne, co znalazło odbicie w liczbie zawiązanych nasion.
332 Błażej Springer... W przypadku krzyżowań i B.oleracea w obu kierunkach krzyżowań w słupku obserwowano nieliczne łagiewki pyłkowe. Pojedyncze nasiona otrzymano tylko z kombinacji (). Na podstawie uzyskanych wyników wydaje się celowym, aby w przyszłych badaniach nad otrzymywaniem mieszańców oddalonych dla ominięcia barier prezygotycznych zastosować zapylanie na skracane słupki oraz kultury zarodków in vitro dla wyeliminowania barier postzygotycznych. Wnioski 1. Największą zgodność kojarzeniową obserwowano w krzyżowaniach pomiędzy i, a najmniejszą między i 2. Krzyżowane genotypy wykazywały większą zgodność kojarzeniową, gdy gatunek amfidiploidalny był formą mateczną 3. W krzyżowaniach zaobserwowano jednokierunkową zgodnością krzyżową Conclusion 1. The biggest compatibility among crossed species has been observed between and, the least in and cross combinations. 2. Better crossabillity was observed when cultivars were used as a female parent in cross combinations. 3. Crossing of and showed unilateral cross compatibility. Literatura Batra V., Prakash S., Shivanna K.R. 199. Intergeneric hybridization between Diplotaxis siifolia, a wild species and crop brassicas. Theor. Appl. Genet., 8: 537-541. Barcikowska B. Maćkowiak M. 1997. Pigmentacja okrywy nasiennej F 2 żółtonasiennych form Brassicaa juncea Coss. B. carinata Braun. Rośliny Oleiste, XVIII (1): 99-12. Choudhary B.R., Joshi P. 1999. Interspecific hybridization in Brassica. Proceedings of the 1th International Rapeseed Congress, Canberra, Australia. Guandimeda H.R., Prakash S., Shivanna K.R. 1992. Intergeneric hybridization between Enarthrocarpus lyratus, a wild species and crop brassicas. Theor. Appl. Genet., 83: 655-662. Harrison I.J., Darby L. 1955. Unilateral hybridization. Nature, 116: 982.
Zgodność kojarzeniowa w krzyżowaniach... 333 Khush G.S., Brar D.S. 1992. Overcoming the barriers in hybridization. In: Distant hybridization of crop plants. Kalloo C. And Chowdhurt J.B. (eds), Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Budapest, 49-61 cytat za Wojciechowski A. 1997. Martin F.W. 1959. Staining and observing pollen tubes by means fluorescence. Stain Technol., 34: 125-128. Michalik B. 1996. Otrzymywanie mieszańców międzygatunkowych i międzyrodzajowych. W: Zastosowanie metod biotechnologicznych w hodowli roślin. Praca zbiorowa, Drukrol Kraków, 36-46. Nanda Kumar P.B.A., Shivanna K.R. 1993. Intergenetic hybridization between Diplotaxis siettiana and crop brassicas for the production of alloplasmic lines. Theor. Appl. Genet., 85: 77-776. Olsson G. 196. Species crosses within the genus Brassica. II Artificial Brassica napus L. Hereditas, 46: 351-386. Quazi M.H. 1988. Interspecific hybrids between Brassica napus L. and L. developed by embryo culture. Theor. Appl. Genet., 76: 39-318. Ramanujam S., Srinvasachar D. 1943. Cytogenetical investigations in the genus Brassica and the artificial synthesis of Brassica juncea. Indian Journal of Genetics & Plant Breeding, 3: 73-88. Starzycki M., Starzycka E., Krzymański J., Matuszczak M. 1999. Alloplazmatyczny rzepak ozimy otrzymany z krzyżowań oddalonych w rodzinie Brassicaceae. Rośliny Oleiste, XX (1): 43-58. Taylor D.C., Mackenzie S.L., McCourdy A.R., Mc Vety P.B.E., Giblin E.M., Pass E.W., Stone S.J., Scarth S., Rimmer S.R., Pickard M.D. 1994. Stereospecific Analyses seed Triacyglycerols from High Erucic Acid Brassiceae. Detection of Erucic Acids at the Sn-2 Position in Brassica olearcea Genotypes. JAOCS, 71/2: 163-167. Wojciechowski A. 1985. Interspecific hybrids between Brassica campestris L. and L. I. Effectiveness of Crossing, Polen Tube Growth, Embriogenesis. Genetica Polonica, 26/4: 423-436. Wojciechowski A., Nowak K., Olejniczak J. 1997. Wstępne wyniki krzyżowań międzygatunkowych pomiędzy Brassica napus, i B. fruticulosa. Rośliny Oleiste, XVIII (1): 91-98.