RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201712 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 361679 (51) Int.Cl. A61C 8/00 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 14.08.2003 (54) Sposób otrzymywania prezerwy zęba, zwłaszcza ludzkiego (73) Uprawniony z patentu: Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa,Katowice,PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: 21.02.2005 BUP 04/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.05.2009 WUP 05/09 (72) Twórca(y) wynalazku: Henryk Bursig,Nakło Śląskie,PL Mariusz Duda,Katowice,PL Stanisław Dyląg,Katowice,PL Barbara Skop,Katowice,PL (74) Pełnomocnik: Zieliński Stefan PL 201712 B1 (57) 1. Sposób otrzymywania prezerwy zęba, zwłaszcza ludzkiego, polegający na przechowywaniu zęba dojrzałego lub zawiązku zębowego w niskich temperaturach, znamienny tym, że bezpośrednio po usunięciu zęba przeważnie z zębodołu ze względów ortodontycznych, protetycznych lub chirurgicznych przechowuje się korzystnie w temperaturze + 4 C do 50 godzin w pojemniku na podłożu RPMI-1640 stanowiącym mieszaninę nieorganicznych soli buforowanych w roztworze aminokwasów oraz witamin i substancji zawierającej składniki kwasów nukleinowych z dodatkiem soli sodowej czerwieni fenolowej o ph=7,2 (±0,2) korygowanej kwaśnym wodorowęglanem sodu i ciśnieniu osmotycznym od 270-300 mosm/l z dodatkiem antybiotyku, który stanowi 4% roztworu, następnie przemywa się ząb świeżym podłożem transportowym korzystnie dwukrotnie i przenosi się do naczynia zawierającego podłoże transportowe, po czym roztwór w którym znajduje się ząb równoważy się czterokrotnie po 5 minut w temperaturze +4 C aż do uzyskania medium konserwującego o zawartości do 90% wagowych podłoża transportowego i 10% wagowych dimetylosulfotlenku, z kolei zamknięty pojemnik zamraża się do temperatury -82 C w ciągu do 30 minut oraz umieszcza się w parach ciekłego azotu w temperaturze do -160 C i utrzymuje się w tej temperaturze do kilkudziesięciu miesięcy lub korzystnie przechowuje się w ciekłym azocie, następnie pojemnik z zębem przeznaczony do transplantacji rozmraża się w łaźni wodnej do kilkunastu minut i po pobraniu próbki na posiew, odwrotnie czterostopniowe równoważy się roztwór krwioprezerwacyjny po 5 minut, aż do uzyskania wyjściowego roztworu transportowego.
2 PL 201 712 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania prezerwy zęba, zwłaszcza ludzkiego. Rozwiązanie techniczne według wynalazku jest przeznaczone dla krioprezerwacji preparatu zęba, zwłaszcza ludzkiego szczególnie dla celów autotransplantacji w stomatologii. Książka pod redakcją Leszka Krysta pt. Chirurgia stomatologiczna PZWL W-wa 1981 r. str. 215-217 podaje postępowanie przy replantacji zęba i transplantacji zęba. W pierwszym etapie przy zabiegu replantacji po znieczuleniu nasiękowym lub przewodowym usuwa się zakwalifikowany do zabiegu ząb. Podczas usuwania zęba zwracać należy uwagę na to, aby nie uszkodzić przyzębia. Podstawowym warunkiem replantacji jest usunięcie zęba w całości. Usunięty ząb umieszcza się w ciepłym roztworze fizjologicznym NaCl, a zębodół łyżeczkuje się bardzo ostrożnie i wypełnia się jałową gazą. W drugim etapie zabieg odbywa się poza jamą ustną pacjenta. Polega on na opracowaniu ubytku próchniczego, wyłuszczeniu miazgi zęba i usunięciu mas zgorzelinowych z kanałów, wyjałowieniu ich według zasad stomatologii zachowawczej i wypełnieniu kanałów cementem. Następnie wierzchołki korzeni resekuje się i zaokrągla ich brzegi, guzki na powierzchni żującej obniża się co ma na celu wyłączenie zęba ze zgryzu. Ubytek próchnicowy wypełnia się najczęściej amalgamatem. Przez cały czas opracowania ząb owinięty tamponem gazowym, przepojonym ciepłym roztworem fizjologicznym NaCl, trzyma się w palcach. Po takim przygotowaniu ząb poddaje się kąpieli w roztworze fiozjologicznym NaCl, a następnie wkłada się do zębodołu za pomocą kleszczy. Niekiedy minimalny ucisk palcem lub nagryzienie poprzez tampon wystarczy, aby ząb wszedł do zębodołu. Zęby replantowane mocuje się przeważnie do zębów sąsiednich za pomocą ligatury drucianej lub szyny. Zęby wielokorzeniowe nie wymagają dodatkowego umocowania. Metodę replantacji dwuetapowej stosuje się również w przypadkach całkowitego wybicia zęba z zębodołu. Ząb taki nie może być replantowany natychmiast po wybiciu, gdyż jest zanieczyszczony. Również nie może być replantowany na jednym posiedzeniu ząb z ostrym zapaleniem ozębnej. Zęby takie umieszcza się w płynach lekko dezynfekujących (rywanol, trypoflawina, roztwór soli fizjologicznej z antybiotykiem) aż do zlikwidowania stanu zapalnego. Po przeleczeniu ząb wkłada się do zębodołu. W procesie wygajania się zęba zasadniczą rolę odgrywa ozębna. Im więcej zachowanej ozębnej, tym pomyślniejszy jest proces wygajania. Transplantacja zęba zwana postępowaniem biologiczno-chirurgicznym sprowadza się do usunięcia zęba drogą operacyjną z łożyska wewnątrzkostnego w którym spoczywał, a następnie usunięty ząb trepanuje się według zasad stomatologii zachowawczej. Po usunięciu miazgi, dezynfekcji kanału i wypełnieniu go cementem ząb transplantowany umieszczony jest w zębodole usuniętego zniszczonego zęba. Niejednokrotnie kształt zębodołu musi być skorygowany i dostosowany do kształtu transplantowanego zęba. Dokonuje się tego za pomocą wierteł różyczkowych i szczelinowych dużego kalibru. Ząb transplantowany zostaje unieruchomiony przez przywiązanie do zębów sąsiednich za pomocą ligatury drucianej. Książka pod redakcją Stanisława B. Bartkowskiego pt. Chirurgia szczękowo-twarzowa wydana przez Colleguim Medicum UJ Kraków 1996 r. str.147 i 148 przedstawia przeszczepianie zębów. Technika zabiegu: zęby z niezakończonym rozwojem korzenia i zdrową miazgą (posiadające szeroki otwór wierzchołkowy) można do dwóch godzin po wybiciu reimplantować z zachowaniem żywej miazgi (możliwość rewaskularyzacji, to jest własnego zaopatrzenia miazgi w naczynie krwionośne wnikające do miazgi z tkanek przyzębia), a po tym czasie konieczne jest przeprowadzenie leczenia kanałowego. Leczenie kanałowe jest wskazane w zębach z zakończonym rozwojem, niezależnie od czasu reimplantacji. Maksymalny okres od utraty zęba do reimplantacji nie powinien przekroczyć 12 godzin, im jest krótszy, tym rokowania w gojeniu reimplantowanego zęba jest lepsze. Powodzenie reimplantacji zależy również od sposobu przechowywania wybitego zęba. Ząb należy umieścić w przedsionku jamy ustnej lub owinąć w gazik namoczony roztworem soli fizjologicznej lub zwykłą wodą. Po opłukaniu zęba roztworem soli fizjologicznej z zanieczyszczeń przystępuje się do zabiegu reimplantacji z zachowaniem zasad aseptyki. W przypadku konieczności przeleczenia endodontycznego zęba kolejny etap polega na otwarciu komory, wyłuszczeniu miazgi z komory i kanałów korzeniowych oraz wypełnieniu zgodnie z zasadami stomatologii zachowawczej. Kolejno wykonuje się resekcję wierzchołka korzenia i wygładzenie guzków zęba celem wyłączenia ze zgryzu. Dalsze etapy postępowania są wspólne dla reimplantacji zarówno zębów z miazgą żywą, jak i po uprzednim leczeniu endodontycznym. Okolice zębodołu znieczula się nasiękowo (środkiem znieczulającym bez dodatku adrenaliny), delikatnie aby nie uszkodzić ścian kostnych zębodołu, usuwa się z niego skrzepy.
PL 201 712 B1 3 Po kolejnej kąpieli zęba odpowiednimi kleszczami wprowadza się go do zębodołu. Konieczne jest następnie unieruchomienie zęba za pomocą szyny nazębnej lub ligatury stalowej, łącząc go z co najmniej dwoma sąsiednimi zębami na okres 4-6 tygodni. Po dwóch tygodniach wykonuje się kontrolne zdjęcie radiologiczne w celu oceny ewentualnych zmian resorpcyjnych w korzeniu zęba reimplantowanego. Po wybiciu zęba, zwłaszcza u dzieci, u których utrata zęba ma szczególnie niekorzystny wpływ na rozwój kości szczękowych jest celowe wykonanie auto-transplantacji. Polega ona na przeszczepieniu własnego, świeżo usuniętego zęba (zawiązka) w inny lub nowo wytworzony zębodół. Dotychczas do doświadczeń nad prezerwacją w niskich temperaturach zębów używano zawiązków zębowych i dojrzałych zębów zwierzęcych a także zębów ludzkich w różnym stadium rozwoju (BARTLETT P.F., READE P.C. (1972). Cryopreservation of developing teeth. Cryobiology. 9, 205-211., COBURN R.J., HENRIQUES, B.L. (1962). The effect of cold storage on the potential tooth transplant. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. 15, 99-105). Badano różne substancje jako zawiesiny do zamrażania, poszukiwano odpowiedniego sposobu obniżenia temperatury oraz jej podwyższenia w trakcie zamrażania i rozmrażania zębów (COSTICH E.R., AVERY J.K., MACKENZIE R.S., Haley E.W. (1966). Freezing and in vitro culture of hamster teeth before transplantation and replantation. J. Oral Surg. 24, 500-515 i KRISTERSON L., SODER P., OTTESKOG P. (1976). Transport and storage of human teeth in vitro for autotransplantation and replantation. J. Oral Surg. 34, 13-18). Rozpatrywano także możliwość preinkubacji zębów w kulturach tkankowych przed zamrożeniem (PFRAGNER R., SADJAK A., ESKICI A., WALSER V. (1981). Pretransplantation treatment of human teeth in tissue culture combined with storage in liquid nitrogen. A scanning electron microscopic study. Exp. Pathol. 20, 128-132). Do doświadczeń ze środkami krioochronnymi używano glicerolu (PRICE P.J., CSEREPFALVI M. (1972). Pulp vitality and the homotransplantation of frozen teeth. J. Dent. Res. 51, 39-43) i DMSO - dimetylosulfotlenku (Bartlett et al, 1972, Kristerson et al, 1976), poszukując odpowiednich stężeń optymalnych dla przechowywania zębów. Glicerol okazał się przydatny jedynie w krioprezerwacji zawiązków zębowych u myszy i świnek morskich (Bartlett et al, 1972), w przypadku dojrzałych zębów u małp przy zastosowaniu glicerolu obserwowano martwicę komórek ozębnej (SCHWARTZ O., ANDREASEN J.O. (1983). Cryopreservation of mature teeth before replantation in monkeys. (I) Effect of different cryoprotective agents and freezing devices. Int. J. Oral Surg. 12, 425-436). Lepsze wyniki w odniesieniu do samych komórek ozębnej zębów u małp i zębów ludzkich uzyskano, eksperymentując z 5% DMSO, który pozwolił na utrzymanie ich żywotności (Schwartz et al, 1983). Szybkość schładzania i ocieplania oraz odpowiednio niska temperatura przechowywania mają również znaczenie dla właściwej krioprezerwacji. Zbyt szybkie schładzanie lub temperatura przechowywania rzędu -10 lub -20 C nie mają zastosowania w przypadku zębów (Coburn et al, 1962). O pomyślnych przypadkach zabiegów replantacji zębów u ludzi po ich przechowywaniu przez dłuższy czas w temperaturze -196 C donoszą nieliczni autorzy (Kristerson et al, 1976, Pfragner et al, 1981, SCHWARTZ O. (1986). Cryopreservation as long - term storage of teeth for transplantation or replantation. Int. J. Oral Maxillofac. Surg 15, 30-32 i YANG Z.P., CHANG C.S. (1990). A 3-year follow- -up of a homotransplanted tooth from a tooth bank. J. Endod. 16, 34-37). W roku 1986 przedstawiono metodę, która pozwala na przechowywanie ludzkich zębów w stanie zamrożonym z zachowaniem żywej ozębnej. Całkowicie uformowany ząb przedtrzonowy u dwudziestoczteroletniej kobiety usunięto ze względów ortodontycznych. Ząb zamrożono na okres 18 miesięcy i wszczepiono w miejscu 15, które uzyskano w ciągu 1,5 roku ortodontycznego leczenia. Autotransplantację przeprowadzono metodą klasyczną i w 2 lata po zabiegu ząb wykazywał zadowalający stan tkanek przyzębia, zarówno w badaniu klinicznym jak i radiologicznym (Schwartz, 1986). Od tej pory nie spotkaliśmy się z dalszymi doniesieniami na temat stosowania metody w zamrażaniu zębów ludzkich. Z kolei w roku 1990 opisano przypadek autotransplantacji drugiego górnego zęba przedtrzonowego, który był uprzednio zamrożony. Ząb wszczepiono do świeżego poekstrakcyjnego zębodołu w pozycji środkowego siekacza. Po 3 latach obserwacji zanotowano radiologicznie zadowalający stan tkanek około wierzchołkowych i tylko nieznaczną ankylozę, natomiast klinicznie ząb nie powodował żadnych dolegliwości, nie stwierdzono także patologii przyzębia ani ruchomości transplantu (Yang et al, 1990). Pomimo rozpowszechnionego przechowywania żyjących komórek lub kompleksów biologicznych, krioprezerwacja zębów nie jest w chwili obecnej stosowana a jak wynika z piśmiennictwa dotychczasowe próby mają charakter doświadczalny lub incydentalny.
4 PL 201 712 B1 Zagadnieniem technicznym wymagającym rozwiązania jest opracowanie sposobu przechowywania dojrzałego zęba lub zawiązka zębowego w niskich temperaturach przy utrzymaniu żywotności komórek ozębnej zęba przeznaczonego dla przeprowadzenia szczególnie autotransplantacji w stomatologii. Wytyczone zagadnienie rozwiązuje sposób otrzymywania prezerwy zęba, zwłaszcza ludzkiego, polegający na przechowywaniu zęba dojrzałego lub zawiązku zębowego w niskich temperaturach, charakteryzujący się tym, że bezpośrednio po usunięciu zęba przeważnie z zębodołu ze względów ortodontycznych, protetycznych lub chirurgicznych przechowuje się korzystnie w temperaturze + 4 C do 50 godzin w pojemniku na podłożu RPMI-1640 stanowiącym mieszaninę nieorganicznych soli buforowanych w roztworze aminokwasów oraz witamin i substancji zawierającej składniki kwasów nukleinowych z dodatkiem soli sodowej czerwieni fenolowej o ph=7,2 (±0,2) korygowanej kwaśnym wodorowęglanem sodu i ciśnieniu osmotycznym od 270-300 mosm/l z dodatkiem antybiotyku, który stanowi 4% roztworu. Następnie przemywa się ząb świeżym podłożem transportowym korzystnie dwukrotnie i przenosi się do naczynia zawierającego podłoże transportowe. Następnie roztwór w którym znajduje się ząb równoważy się czterokrotnie po 5 minut w temperaturze +4 C aż do uzyskania medium konserwującego o zawartości do 90% wagowych podłoża transportowego i 10% wagowych dimetylosulfotlenku. Z kolei zamknięty pojemnik zamraża się do temperatury -82 C w ciągu do 30 minut oraz umieszcza się w parach ciekłego azotu w temperaturze do -160 C i utrzymuje się w tej temperaturze do kilkudziesięciu miesięcy lub korzystnie przechowuje się w ciekłym azocie. Następnie pojemnik z zębem przeznaczony do transplantacji rozmraża się w łaźni wodnej do kilkunastu minut i po pobraniu próbki na posiew, odwrotnie czterostopniowo równoważy się roztwór krwioprezerwacyjny po 5 minut, aż do uzyskania wyjściowego roztworu transportowego. Antybiotyk wchodzący w skład podłoża transportowego zawiera 10 000 j.m. penicyliny, 10 mg streptomycyny i 25 μg amfoterycyny w 1 ml 0,9% NaCl. Ząb po przemyciu podłożem transportowym kieruje się do naczynia zawierającego podłoże transportowe wraz z 20% wagowo inaktywowaną surowicą, korzystnie ludzką. W łaźni wodnej podczas rozmrażania pojemnika z zębem temperatura wynosi 37 C. Sposób otrzymywania prezerwy zęba, zwłaszcza ludzkiego według wynalazku umożliwia przechowanie zęba w niskich temperaturach, który po rozmrożeniu zawiera żywe komórki ozębnej. W czasie badań hodowli tkankowej następuje proces wzrostu fibroblastów. Początkowo wyrastają pojedyncze komórki migrujące na podłoże od strony zęba. Ich liczba w polu widzenia mikroskopu zwiększa się stopniowo aż do powstania mniej lub bardziej gęstej sieci komórek uzyskującej w niektórych przypadkach postać hodowli konfluetnej. Obserwacja prowadzonej hodowli komórkowej in vitro wskazuje na duży dynamizm komórek ozębnej wkrótce po ich rozmnożeniu. Fibroblasty mają wygląd typowych dla młodych, aktywnych metabolicznie komórek - są wydłużone, mają kilka wypustek i wyraźne duże jądro komórkowe. Dzielą się mniej lub bardziej intensywnie w poszczególnych przypadkach i pod koniec trzeciego tygodnia hodowli w przeważającej większości hodowle uzyskują postać większych grup komórek, gęstej sieci lub hodowli konfluetnej. Przeprowadzone badania wykazują, że komórki ozębnej zębów ludzkich poddane procesowi krioprezerwacji utrzymują swoją żywotność. Jedynie w stosunku do poniżej 10% odmrożonych zębów po 21 dniach inkubacji nie zauważono żywych komórek. Z kolei w obserwacjach in vitro badania prowadzone po dwóch tygodniach, w miesiąc, rok oraz dwa i pół roku po zabiegu wykazały prawidłowy obraz kliniczny. Pacjent normalnie użytkował uzupełnienie protetyczne oparte na autotransplantowanym zębie i nie zgłaszał dolegliwości. Przedmiot wynalazku przedstawia bliżej jego przykład wykonania. P r z y k ł a d. Materiał do badań in vitro stanowiło 25 zdrowych ludzkich zębów, które zostały usunięte ze względów ortodontycznych (21 przypadków), protetycznych (2 przypadki) lub chirurgicznych (2 przypadki). Ekstrakcje przeprowadzono u 15 pacjentów w wieku od 10 do 44 lat. Po ekstrakcji zęby przechowuje się w temperaturze. + 4 C przez 13 do 48 godzin w podłożu transportowym do momentu zamrożenia. Pojemnik transportowy napełnia się podłożem RPMI 1640 o składzie: L-arginina, L-asparagina, kwas L-asparaginowy, kwas L-glutaminowy; L-cystyna, glicyna, L-histydyna; L-hydroksyprolina; L-izoleucyna; L-leucyna; L-lizyna HCl; L-metionina; L-fenyloalanina; L-prolina; L-seryna; L-treonina; L-tryptofan; L-tyrozyna; L-walina; d-biotyna; L-glutamina; glutation; pantotenian wapnia; chlorek choliny; kwas foliowy; I-inozytol; amid kwasu nikotynowego; kwas p-aminobenzoesowy; pirydoksyna HCl; ryboflawina; tiamina HCl; witamina B 12 ; glukoza; sól sodowa czerwieni fenolowej; NaCl; KCl; Ca(NO 3 ) 2 x 4 H 2 O; MgSO 4 x 7 H 2 O; Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O i NaHCO 3 oraz uzupełnia się antybiotykiem Antibiotic Antymycotic Solution (AAS) w składzie 10000 j. m. penicyliny, 10 mg streptomycyny i 25 μg amfoterycyny B w 1 ml 0,9% NaCl, przy czym antybiotyk stanowi 4%
PL 201 712 B1 5 roztworu. Do zamrażania używa się plastikowych sterylnych pojemników z zakrętką o pojemności 5 ml. Początkowo ząb dwukrotnie przemywa się podłożem transportowym przenosi do naczynia zawierającego to medium wraz z 20% inaktywowaną surowicą cielęcą. W badaniach zrezygnowano z użycia surowicy ludzkiej. Następnie roztwór, w którym znajduje się ząb przygotowuje się do mrożenia poprzez czterostopniową kąpiel po 5 minut w temperaturze + 4 C w roztworze zawierającym roztwór oraz DMSO-dimetylosulfotlenek o zwiększającym się udziale procentowym DMSO. W pierwszym kroku roztwór zawiera 2,5% wagowych DMSO, w drugim kroku roztwór zawiera 5% wagowych DMSO, w trzecim kroku roztwór zawiera 7,5% wagowych DMSO a w czwartym kroku roztwór zawiera 10% wagowych DMSO. Czterostopniowe równoważenie po 5 minut prowadzi do uzyskania medium konserwującego o zawartości 70% roztworu transportowego, 20% surowicy cielęcej i 10% DMSO - dimetylosulfotlenku. Zamknięty pojemnik zamraża się do temperatury -82 C w ciągu do 30 minut oraz umieszcza się w parach ciekłego azotu o temperaturze do - 160 C. Zęby przechowuje się przez 7 do 10 miesięcy w pojemnikach w parach ciekłego azotu. Po tym czasie pojemniki z zębami rozmraża się w seriach po 5 zębów w łaźni wodnej o temperaturze 37 C w ciągu kilku minut, aż do uzyskania temperatury pokojowej i pobiera się próbki na posiew (II posiew), po czym odwrotnie czterostopniowe równoważy się roztwór krioprezerwacyjny po 5 minut, aż do uzyskania wyjściowego roztworu transportowego z dodatkiem 20% surowicy cielęcej. W ciągu jednej godziny zęby przebywające w roztworze transportowym z 20% surowicą cielęcą dostarcza się do pracowni hodowli komórkowej. Hodowlę tkankową przeprowadzono w inkubatorze przez okres 3 tygodni w temperaturze +37 C i atmosferze 5% CO 2. Pożywkę zmieniano dwa razy w tygodniu jednocześnie obserwując hodowlę pod mikroskopem świetlnym i sprawdzając jej czystość. Po zakończeniu hodowli komórki uzyskane w jej trakcie wybarwiono hematoxyliną i eozyną, oglądano pod mikroskopem świetlnym oraz wykonywano fotografie. Badanie in vitro dotyczyło przypadku autotransplantacji, w którym całkowicie zatrzymany kieł 13 przeszczepiono w miejsce zęba trzonowego jako filar dla stałego uzupełnienia protetycznego przy brakach skrzydłowych. Przeszczepiony ząb posiadał w pełni uformowany korzeń, przy czym przez 4 miesiące po operacyjnym usunięciu był przechowywany w niskich temperaturach z zastosowaniem opisanej powyżej metody. Po jego rozmrożeniu dokonano autotransplantacji zęba w pozycji 36. Celem uzyskania odbudowy wyrostka zębodołowego wokół przeszczepionego zęba zastosowano technikę sterowanej regeneracji kości z użyciem substytutu kostnego Bio-oss i membrany kolagenowej Bio-gide (Geistlich Pharma AG, Szwajcaria). Po leczeniu endodontycznym ząb został wykorzystany jako filar mostu. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania prezerwy zęba, zwłaszcza ludzkiego, polegający na przechowywaniu zęba dojrzałego lub zawiązku zębowego w niskich temperaturach, znamienny tym, że bezpośrednio po usunięciu zęba przeważnie z zębodołu ze względów ortodontycznych, protetycznych lub chirurgicznych przechowuje się korzystnie w temperaturze + 4 C do 50 godzin w pojemniku na podłożu RPMI-1640 stanowiącym mieszaninę nieorganicznych soli buforowanych w roztworze aminokwasów oraz witamin i substancji zawierającej składniki kwasów nukleinowych z dodatkiem soli sodowej czerwieni fenolowej o ph=7,2 (±0,2) korygowanej kwaśnym wodorowęglanem sodu i ciśnieniu osmotycznym od 270-300 mosm/l z dodatkiem antybiotyku, który stanowi 4% roztworu, następnie przemywa się ząb świeżym podłożem transportowym korzystnie dwukrotnie i przenosi się do naczynia zawierającego podłoże transportowe, po czym roztwór w którym znajduje się ząb równoważy się czterokrotnie po 5 minut w temperaturze +4 C aż do uzyskania medium konserwującego o zawartości do 90% wagowych podłoża transportowego i 10% wagowych dimetylosulfotlenku, z kolei zamknięty pojemnik zamraża się do temperatury -82 C w ciągu do 30 minut oraz umieszcza się w parach ciekłego azotu w temperaturze do -160 C i utrzymuje się w tej temperaturze do kilkudziesięciu miesięcy lub korzystnie przechowuje się w ciekłym azocie, następnie pojemnik z zębem przeznaczony do transplantacji rozmraża się w łaźni wodnej do kilkunastu minut i po pobraniu próbki na posiew, odwrotnie czterostopniowe równoważy się roztwór krwioprezerwacyjny po 5 minut, aż do uzyskania wyjściowego roztworu transportowego.
6 PL 201 712 B1 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że antybiotyk wchodzący w skład podłoża transportowego zawiera 10 000 j.m. penicyliny, 10 mg streptomycyny i 25 μg amfoterycyny w 1 ml 0,9% NaCl. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ząb po przemyciu podłożem transportowym kieruje się do naczynia zawierającego podłoże transportowe wraz z 20% wagowo inaktywowaną surowicą, korzystnie ludzką. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w łaźni wodnej podczas rozmrażania pojemnika z zębem temperatura wynosi 37 C. Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,00 zł.