Biosurfaktanty syntetyzowane przez mikroorganizmy i ich rola w remediacji gruntu Natalia Zawrotna, Piotr Jachimowicz

Transkrypt

1 Biosurfaktanty syntetyzowane przez mikroorganizmy i ich rola w remediacji gruntu Natalia Zawrotna, Piotr Jachimowicz Naukowe Koło Mikrobiologów Molekularnych COCCUS, adres: ul. R. Prawocheńskiego1 Olsztyn, zawrotna.natalia@gmail.com Streszczenie Metale ciężkie stanowią bardzo istotny problem jeżeli chodzi o zanieczyszczenie gleby. Są one przyswajane przez rośliny, po czym dostają się do łańcucha pokarmowego i w konsekwencji dostają się do organizmu człowieka, gdzie mają szkodliwy wpływ na wiele funkcji. Biosurfaktanty to związki powierzchniowo czynne pochodzenia naturalnego. Badania nad wykorzystaniem biosurfaktantów do usuwania metali ciężkich z gleb zostały zapoczątkowane w latach 90. ubiegłego wieku. Summary Heavy metals are a very important issue in soil contamination. They are uptaken by plants and then enter the food chain and, consequently, can be found in the human body, where they have a detrimental effect on many functions. Biosurfactants that surfactants of natural origin. Research on the use of biosurfactants to remove heavy metals from the soil were initiated in the 90s of the last century. Słowa kluczowe: biosurfaktanty, remediacja gruntu, metale ciężkie, mikroorganizmy Keywords: biosurfactants, soil remediation, heavy metals, microorganisms 1. Wstęp W obecnych czasach rozwój techniki i technologii nabrał niezwykłego rozpędu. W związku z szybkim rozwojem przemysłowym świata znacznie wzrosło niebezpieczeństwo zatrucia środowiska metalami ciężkimi. Człowiekowi bardzo trudno jest nadążyć za wszelkim postępem i zneutralizować negatywny wpływ na środowisko. To co odróżnia nas od roślin to między innymi fakt, iż kiedy warunki są niesprzyjające możemy się przemieszczać. Roślina, kiedy natrafia w ryzodermie na metale ciężkie nie potrafi od nich,,uciec. Hamują one również rozwój funkcjonujących tam mikroorganizmów, co prowadzi do zakłócenia ich podstawowych

2 funkcji fizjologicznych, a przede wszystkim procesów związanych z rozkładem i przemianą substancji organicznej. Toksyczne oddziaływanie metali ciężkich na większość roślin występuje często dopiero przy wysokim zanieczyszczeniu gleb metalami ciężkimi, natomiast człowiek jest wrażliwy nawet na obecność podwyższonych ilości metali ciężkich. Jest to niepodważalny argument, by przekonać człowieka do dbania o środowisko. Biosurfaktanty to związki powierzchniowo czynne syntetyzowane przez mikroorganizmy. Wykorzystanie takich biosurfaktantów w procesach oczyszczania gleby z metali ciężkich, jest małym krokiem dla człowieka, a wielkim dla ludzkości. 2. Metale ciężkie w glebie Najczęściej metale ciężkie określa się jako pierwiastki metaliczne o liczbie atomowej mieszczącej się w zakresie i gęstości większej niż 5,0 g/cm 3 [1]. Metale ciężkie w glebie mogą pochodzić z dwóch źródeł: naturalnych i antropogenicznych. Obecnie ciągły wzrost skażenia środowiska metalami ciężkimi spowodowany jest przede wszystkim działalnością gospodarczą człowieka. Do głównych źródeł zanieczyszczeń metalami ciężkimi zalicza się: produkty wietrzenia skały macierzystej, jako źródło naturalne, odpady i ścieki o wysokiej zawartości metali ciężkich produkowane przez przemysł wydobywczy, metalurgiczny, garbarski, galwanizerski i elektrochemiczny, produkcję farb, barwników i papieru, środków ochrony roślin, tworzyw sztucznych, transport drogowy, przemysł, komunikacja oraz procesy spalania (rys.1.) [2,3] Na zawartość fitodostępnych metali ciężkich w glebie najsilniejszy wpływ mają czynniki glebowe oraz nawozowe, a tym samym przyczyniają się do akumulacji tych pierwiastków w roślinach. Spośród fizykochemicznych właściwości gleby wpływających na ilość dostępnych dla roślin form metali ciężkich decydującą rolę odgrywają: typ gleby, skład granulometryczny, zawartość substancji organicznej, właściwości sorpcyjne, odczyn oraz potencjał oksydoredukcyjny [4,5]. Toksyczne działanie metali w glebie zależy tylko w niewielkim stopniu od całkowitej zawartości tych zanieczyszczeń w gruncie. Przede wszystkim jest ono determinowane biodostępnością - stężeniem jonów metali ciężkich w roztworze glebowym. Do czynników wpływających na biodostępność metali należą: wiek i różnorodność zanieczyszczeń, fizykochemiczne właściwości danego gruntu (typ, ph, zdolność wymiany jonowej) oraz możliwości metaboliczne i liczebność bytujących organizmów [3,6-9]. W glebach metale ciężkie występują w postaci jonów, np. Cd 2+, Pb 2+ lub tworzą związki kompleksowe z występującymi w roztworze glebowym anionami nieorganicznymi, np. SO 2-4,

3 Cl - oraz małocząsteczkowymi substancjami organicznymi, takimi jak kwasy organiczne i aminokwasy, oraz z rozpuszczonymi związkami wielkocząsteczkowymi w postaci polisacharydów i polifenoli [10]. Wraz ze wzrostem odczynu udział jonowych form metali maleje, natomiast zwiększa się ilość połączeń metaloorganicznych, zwłaszcza ołowiu i miedzi [11]. Gdy stężenie metali jest duże, mogą ulegać one wytrącaniu, zwłaszcza w glebach alkalicznych, w formie tlenków, wodorotlenków, węglanów, siarczków oraz fosforanów. Skuteczność wytrącania w znacznym stopniu zależy od odczynu [11]. Do organizmu człowieka metale ciężkie są wchłaniane przez skórę, wdychane, lub też dostają się wraz ze spożywanymi produktami roślinnymi i zwierzęcymi. Zagrożenie ze strony metali ciężkich wynika bezpośrednio z ich przemieszczania się w łańcuchu troficznym gleba roślina zwierzę człowiek i możliwości kumulacji w ostatnim ogniwie, czyli organizmie człowieka [12]. Metale ciężkie w organizmach zwierzęcych czy ludzkich wywołują przede wszystkim zmiany w syntezie białka i zaburzenia wytwarzania ATP, w następstwie których może dochodzić do poważnych zmian chorobowych [13]. Długotrwała ekspozycja na metale ciężkie może powodować określone skutki zdrowotne, takie jak choroby nowotworowe, uszkodzenia organów, np. uszkodzenia nerek przez kadm i arsen lub zmiany w funkcjonowaniu układu krwionośnego wywołane związkami ołowiu [14,15]. Opady Rysunek 1. Drogi transportu metali ciężkich w środowisku [13]

4 3. Metody remediacji gruntu Problem oczyszczania środowiska gruntowego wciąż nie jest rozwiązany w sposób zadowalający. Usunięcie metali ciężkich jest zwykle zadaniem trudnym i kosztownym. Metody oczyszczania gruntu mogą być realizowane w warunkach ex situ, czyli po usunięciu gruntu z miejsca skażenia i przeniesieniu go do wytypowanego punktu w celu remediacji lub in situ, czyli bez wybierania zanieczyszczonego gruntu [16]. W poszczególnych metodach oczyszczania gruntu uwzględnia się i wykorzystuje różnice pomiędzy właściwościami zanieczyszczeń oraz właściwościami ziaren i cząstek gruntu [11]. Techniki ex situ charakteryzują się dużą skutecznością w przypadkach, gdzie wymagana jest minimalizacja czasu prowadzenia remediacji, a tereny zanieczyszczone mają niewielką powierzchnię (m.in. przygotowanie terenów inwestycyjnych). Technologia ta może być wykorzystywana, gdy ilość skażonej gleby jest stosunkowo niewielka. Niestety, podczas usuwania gruntu z miejsca skażenia, zwłaszcza na terenach o dużym i rozległym zanieczyszczeniu, trzeba uwzględnić relatywnie wysokie koszty generowania odpadu w postaci zanieczyszczonej gleby oraz uwalnianie do atmosfery nawet do 90% zanieczyszczeń lotnych. Metoda ta powoduje również zaburzenie funkcji terenu, naturalnych warunków glebowych i hydrogeologicznych [17,18]. Do metod ex situ zaliczamy: 1.Remediację ekstrakcyjną, która polega na przemywaniu gruntu w mieszalniku, a tym samym wymywaniu z niego zanieczyszczeń, które przechodzą do medium płuczącego, 2.Remediację termiczną polegającą na cieplnej obróbce wybranego gruntu. Procesy niskotemperaturowe ( C) polegają na odparowaniu zanieczyszczeń złoża i ich usunięciu metodą adsorpcyjną. Spośród procesów wysokotemperaturowych najczęściej stosowana jest termiczna likwidacja zanieczyszczeń w piecach obrotowych lub urządzeniach ze złożem fluidalnym, w temperaturze do 1100 C, 3.Elektroremediację, metoda oparta jest na przepływie prądu elektrycznego, 4.Bioremediację w reaktorach biologicznych. Do reaktora dostarczany jest tlen, mikroorganizmy oraz substancje biogenne, które przyśpieszają degradację podczas intensywnego mieszania się gruntu. 5.Kompostowanie. Metoda która polega na rozłożeniu zanieczyszczonego gruntu na cienkiej warstwie odpowiedniego, nieprzepuszczalnego podłoża w celu przyśpieszenia rozkładu zanieczyszczeń [17,18].

5 Techniki in situ należą do technik bezinwazyjnych. Usuwanie zanieczyszczeń odbywa się w miejscu, gdzie ono powstało. Metoda ta jest stosowana w przypadku, gdy teren jest rozległy oraz nie istnieje niebezpieczeństwo szybkiej penetracji skażenia do wód gruntowych [18]. Podczas ich stosowania struktura gleby pozostaje nienaruszona. Daje to możliwość prowadzenia aktywnej remediacji na terenach zurbanizowanych, przemysłowych czy komunikacyjnych z istniejącą rozwiniętą infrastrukturą, w czasie normalnego cyklu użytkowania terenu. Stosowane metody cechują się długim czasem remediacji, który rekompensowany jest relatywnie niskimi kosztami [19]. Do metod in situ zaliczamy: 1.Biodegradację, metodę polegającą na wykorzystywaniu organizmów autochtonicznych, naturalnie żyjących w gruncie lub na wprowadzeniu bakterii, 2.Wentylację gruntu, metodę stosowaną do usuwania lotnych związków organicznych, polegającą na przedmuchiwaniu gruntu w strefie nienasyconej, 3.Oczyszczanie gruntów metodą podciśnienia tzw. soil vapour extraction, SVE, polegająca na stosowaniu podciśnienia w oczyszczanym obszarze, które powoduje zasysanie lotnych zanieczyszczeń kierowanych do naziemnej instalacji oczyszczającej, 4.Przemywanie gruntu wodą pod wysokim ciśnieniem; stosuje się tłoczenie wody pod wysokim ciśnieniem w głąb gruntu, który ulega spulchnieniu i wyniesieniu na powierzchnię, gdzie poddany zostaje oczyszczaniu, 5.Wypompowywanie zanieczyszczonej wody gruntowej, metodę tę stosuje się do usuwania zanieczyszczeń rozpuszczonych, 6.Metodę biostymulacji, polegającą na zwiększeniu naturalnej aktywności mikroflory glebowej rozkładającej zanieczyszczenia poprzez dodatkowe napowietrzanie i nawożenie gleby [17,20]. 4. Właściwości biosurfaktantów Surfaktanty są związkami otrzymywanymi w drodze syntezy. Najczęściej stosowane są surfaktanty niejonowe. Jednak nie wszystkie syntetyczne niejonowe związki powierzchniowo czynne są dostatecznie biodegradowalne. Ponadto związki te mogą działać toksycznie na środowisko. Przykładem mogą być oksyetylenowane alkilofenole, których dobre właściwości użytkowe w odniesieniu do remediacji gruntów nie idą w parze z oddziaływaniem na środowisko. Są one uznawane za związki trudno biodegradowalne, a produkty ich częściowej degradacji (w tym nonylofenol) wykazują znaczną toksyczność i działają inhibitująco na proces

6 nitryfikacji, rozkładu skrobi i celulozy oraz na proces fotosyntezy. Dlatego też zainteresowano się biosurfaktantami, które są wytwarzane przez mikroorganizmy zasiedlające glebę i są łatwo biodegradowalne [17]. Biosurfaktanty wykazują amfifilowy charakter, wynikający z obecności w cząsteczce części hydrofobowej, najczęściej w postaci długołańcuchowych kwasów tłuszczowych oraz części hydrofilowej w postaci węglowodanów, aminokwasów czy alkoholi. Posiadają również zdolność obniżania napięcia powierzchniowego i międzyfazowego oraz tworzenia struktur micelarnych. W rozcieńczonych roztworach związki powierzchniowo czynne istnieją w postaci monomerów. Gdy stężenie wzrasta, monomery biosurfaktantów ulegają asocjacji w większe agregaty, tzw. micele. Asocjacja zachodzi po przekroczeniu stężenia charakterystycznego dla danego związku powierzchniowo czynnego określanego jako krytyczne stężenie micelizacji (Critical Micelle Concentration CMC) (rys.2.) [12]. Wraz ze wzrostem stężenia surfaktantów następuje obniżenie napięcia powierzchniowego, co sprzyja kontaktowaniu się danego biosurfaktantu z metalem. Rysunek 2. Zależność pomiędzy stężeniem biosurfaktantu, napięciem powierzchniowym, a powstawaniem miceli [21]

7 5. Biosurfaktanty syntetyzowane przez mikroorganizmy Biosurfaktanty można bezpośrednio syntetyzować przez mikroorganizmy lub wydzielać z niektórych produktów pochodzenia roślinnego, przy czym te drugie są mniej skuteczne przy obniżaniu napięcia powierzchniowego. Wiele mikroorganizmów jest zdolnych do syntezy biosurfaktantów (Tab.1.) [11]. Biosurfaktanty produkowane są w przeważającej większości w środowisku wodnym przez mikroorganizmy tlenowe, z substratem węglowym jako źródłem pożywienia. Ogromną zaletą jest to, że mikroorganizmy syntetyzują biosurfaktanty z wykorzystaniem tanich i łatwo dostępnych substratów, jak cukry, tłuszcze roślinne, kwasy tłuszczowe i alkohole. Emulgatory wydzielane są przez bakterie w czasie ich wzrostu, aby pomóc w transporcie nierozpuszczalnych substratów przez ścianę komórkową [17]. Tabela 1. Przykłady biosurfaktantów pochodzenia mikrobiologicznego Grupa Rodzaj biosurfaktantu Gatunek mikroorganizmu ramnolipidy Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas sp. DMS 2847 Serratia rubidea Glikolipidy soforolipidy Candida apicola Candida bombicola Candida lipolytica Candida bogoriensis trehalolipidy Arthrobacter paraffineus Corynebacterium spp. Mycobacterium spp. Rhodococcus erythropolis Norcardia sp. Lipoproteiny/lipopeptydy surfaktyna Bacillus subtilis Bacillus pumilus Fosfolipidy fosfatydyloetanoloamina Acinetobacter sp. Thiobacillus thiooxidans Rhodococcus erythropolis Związki polimerowe emulsan, liposan, kompleksy Acinetobacter calcoaceticus Candida lipolytica Corynebacterium

8 Źródło: [11] polisacharydowobiałkowe, mannoproteiny hydrocarboclastus Saccharomyces cerevisie Substancje te można zasadniczo podzielić na dwie grupy: związki o stosunkowo małej masie cząsteczkowej (glikolipidy, lipoproteiny, lipopeptydy, fosfolipidy) oraz substancje wielocząsteczkowe (emulsan, liposan, kompleksy polisacharydowo-białkowe) [22]. Glikolipidy to związki składające się głównie z cząsteczki mono- lub disacharydu połączonej wiązaniem glikozydowym z kwasem hydroksytłuszczowym. Wśród glikolipidów najbardziej rozpowszechnione są ramnolipidy, zbudowane z jednego lub dwóch pierścieni ramnozy połączonych z kwasem β-hydroksydekanowym. Zdolność do syntezy tych związków wykazują głównie Pseudomonas aeruginosa, które jako źródło węgla wykorzystują alkany, bursztynian, pirogronian, cytrynian, fruktozę, glukozę, glicerol, mannitol oraz oleje roślinne. Ramnolipidy, dzięki właściwościom przeciwdrobnoustrojowym, stosowane są również jako antybiotyki. Kolejną grupą wśród glikolipidów stanowią soforolipidy zbudowane z dwóch cząsteczek cukrowych soforozy oraz hydroksykwasu tłuszczowego, połączonych wiązaniem β- glikozydowym. Wyróżnia się dwa typy soforolipidów: kwaśne, gdzie cząsteczka hydroksykwasu posiada wolną grupę karboksylową i soforolipidy laktonowe, których pierścień laktonowy połączony jest z grupą wodorotlenową soforozy. Soforolipidy laktonowe mają większe znaczenie komercyjne i naukowe w porównaniu z kwaśnymi. Są przemysłowo wykorzystywane jako związki zwilżające przez koncern Kao Co. Ltd. w kosmetykach z serii Sofina [26]. Trehalolipidy natomiast mają strukturę estrów trehalozy i kwasu mykolowego (2-alkilo- 3-hydroksytluszczowego). Lipopeptydy są cząsteczkami cyklicznymi, zbudowanymi z łańcucha oligopeptydowego i kwasu 3-hydroksytłuszczowego, zaś fosfolipidy to związki, które obok reszt kwasów tłuszczowych zawierają również reszty kwasu fosforowego (V). Masa cząsteczkowa lipopeptydów mieści się w zakresie od 979 do 1091 Da. Najbardziej znana jest surfaktyna zbudowana z siedmiu aminokwasów: kwas glutaminowy (1), leucynę (4), kwas asparaginowy (1) i walinę (1). Biosurfaktanty polimerowe mają najczęściej strukturę lipopolisacharydu (emulsan, biodispersan) lub mannoprotein [22,23,24,25].

9 Budowa wybranych biosurfaktantów przedstawiono na rys.3. [23] Rysunek 3. Przykład y wybranych biosurfaktantów [13] Synteza biosurfaktantów powiązana jest z fazami wzrostu mikroorganizmów, a te uzależnione są od warunków procesu hodowli, od zawartości składników odżywczych w podłożu, zawartości komórek w medium hodowlanym i ilości wytwarzanych przez nie produktów ubocznych [24]. Biosurfaktanty syntetyzowane są wewnątrz komórek mikroorganizmów, gdzie pełnią rolę składników odżywczych, umożliwiają adsorpcję genów czy sekwestrację związków toksycznych [25]. Wiele badań naukowych zwraca szczególną uwagę na obecność w podłożu właściwego źródła węgla i azotu oraz dobrania odpowiednich warunków wzrostu podczas hodowli mikroorganizmów, np. temperatury i ph podłoża. Taką relację zauważono podczas syntezy

10 ramnolipidów przez Pseudomonas spp., związków aktywnych powierzchniowo syntetyzowanych przez Bacillus cereus oraz w produkcji glikopeptydów przez Pseudomonas fluorescens [24]. Miarą skuteczności biosurfaktantów w procesie remediacji gruntów jest produkcja takich związków powierzchniowo czynnych, które obniżają napięcie powierzchniowe wody z 72 do około 35 mn/m, a napięcie międzyfazowe z 40 do 1mN/m oraz tworzą agregaty micelarne w niskim stężeniu. Dla przykładu ramnolipidy obniżają napięcie powierzchniowe wody nawet do 25 mn/m, soforolipidy do 33 mn/m, oraz napięcie międzyfazowe ramnolipidy obniżają do 1mN/m, sofrolipidy do 5 mn/m [11]. 6. Mechanizm działania W badaniach nad możliwością stosowania roztworów biosurfaktantów do remediacji gruntów skażonych metalami ciężkimi stosowane są głównie biosurfaktanty niskocząsteczkowe, co wynika z dobrze opracowanych warunków produkcji i izolacji tych związków [12]. Przydatność biosurfatantów do bioremediacji gleby zanieczyszczonej metalami ciężkimi polega głównie na ich zdolności do tworzenia kompleksów z danymi metalami. Na rys.4.[12] pokazano mechanizm usuwania metali ciężkich z gleb. Cząsteczki związku powierzchniowo czynnego gromadzące się na granicy faza stałaroztwór glebowy obniżają napięcie międzyfazowe i działanie sił kapilarnych oraz biorą udział w wiązaniu metali. Procesy te wydatnie zwiększają zawartość jonów metali w roztworze glebowym. Zaadsorbowana cząsteczka metalu na powierzchni gleby ulega sorpcji przez molekuły biosurfaktantu. Tworzy się kompleks metal-biosurfaktatnt, który ulega desorpcji do roztworu gleby. Wiązanie jonowe pomiędzy kompleksem biosurfaktant-metal jest silniejsze niż wiązanie gleba-metal, dlatego kompleksy są desorbowane z matrycy gleby do roztworu glebowego, gdzie następuje włączenie metalu do miceli. Desorpcję przyśpiesza także zachodzące w fazie wodnej kompleksowanie kationów metali przez cząsteczki i micele biosurfaktantu. W micelach cząstki biosurfatantów orientują się częścią hydrofobową do środka, a hydrofilową na zewnątrz. Taki układ umożliwia tworzenie kompleksów pomiędzy kationami metali a polarną częścią biosurfaktantu. Wiązania tworzone między kationami metalu ciężkiego, a ujemnie naładowaną częścią biosurfaktantu są na tyle silne, że płukanie usuwa te kompleksy w całości. Szczególnie wysokim powinowactwem do metali charakteryzują się biosurfaktanty anionowe. W końcowym etapie następuje wytrącenie biosurfaktantu z powstałego kompleksu.

11 Wykorzystanie biosurfaktantów do eliminacji metali ciężkich z gleby można prowadzić ex situ lub in situ. W warunkach ex situ niewielka ilość gleby przenoszona jest do zbiornika, najczęściej cementowego, do którego dodawany jest także roztwór związku powierzchniowo czynnego. Po zakończeniu płukania glebę oddziela się od fazy wodnej, zawierającej kompleksy biosurfaktant metal ciężki. Kolejne etapy polegają na precypitacji związku powierzchniowo czynnego połączone z wydzieleniem jonów metalu do wody. Z kolei w warunkach in situ wprowadzenie/odbiór roztworu biosurfaktantu przeprowadza się systemem drenów i rowów, bezpośrednio w miejscu skażenia gleby [11,26]. Rysunek 4. Mechanizm działania biosurfaktantu w glebie zanieczyszczonej metalami [21] 7. Podsumowanie Zanieczyszczenie gleb metalami ciężkimi może mieć bardzo drastyczne skutki jeżeli chodzi o zdrowie i życie człowieka.

12 Metoda usuwania metali ciężkich z gleby za pomocą płukania biosurfaktantami jest dynamicznie rozwijanym kierunkiem badań. Stanowi alternatywę dla typowych procesów chemicznych, a przede wszystkim jest przyjazna środowisku i człowiekowi. Do tej pory najczęściej wykorzystywano ramnolipidy z uwagi na ich dostępność na rynku i niską cenę. Badania technologiczne koncentrują się na poszukiwaniu najbardziej wydajnych biosurfaktantów, przy relatywnie niskich kosztach produkcji. Reasumując, wykorzystanie natury przy niewielkim udziale człowieka może w znaczny sposób podnieść jakość naszych gleb, a tym samym naszego zdrowia, które stanowi jeden z najważniejszych aspektów naszego życia. Literatura [1] Hodson M.E., Heavy metal-geochemical bogey men?, Environmental Pollution, 2004, 129, , [2] (materiały pomocnicze), r., [3] Paraszkiewicz K., Długoński J. Wykorzystanie drobnoustrojowych surfaktantów do usuwania metali ciężkich z gleby, Biotechnologia 2007,2(77), 81-94, [4] Gębski M., Czynniki glebowe oraz nawozowe wpływające na przyswajanie metali ciężkich przez rośliny, Postępy Nauk Rolniczych, 1998, 5, 3-16, [5] Kabata-Pendias A., Pendias H.: Biogeochemia pierwiastków śladowych. Wyd. II. PWN, Warszawa, 1999 [6] Weber J., Karczewska A., Biogeochemical processes and the role of heavy metals in the soil environment, Geoderma 2004, 2, , [7] Kaasalainen M., Yli-Halla M., Use of sequential extraction to assess metal partitioning in soils." Environmental Pollution 2003,126(2), , [8] Słaba, M., Długoński J., Mikrobiologiczne usuwanie i odzyskiwanie metali ciężkich, Postępy Mikrobiologii 2003,2(41), , [9] Słaba, M., Długoński J., Heavy metals uptake by microscopic fungi, Biotechnologia 2003,4, , [10] Karczewska A., Ocena możliwości zastosowania metody wspomaganej fitoekstrakcji do rekultywacji gleb zanieczyszczonych emisjami hutnictwa miedzi, 2008, Wydawnictwo Zante, [11] Wojnowskiej-Baryły I, Trendy w biotechnologii środowiskowej, UWM 2011 [12] Mulligan C.N., Environmental applications for biosurfactants, Environmental pollution 2005, 133(2), , [13] Ociepa-Kubicka A., Ociepa E., Toksyczne oddziaływanie metali ciężkich na rośliny, zwierzęta i ludzi, Inżynieria i Ochrona Środowiska 2012, 15, , [14] Pruvot, C., Douay, F., Hervé, F., & Waterlot, C.. Heavy Metals in Soil, Crops and Grass as a Source of Human Exposure in the Former Mining Areas (6 pp). Journal of Soils and Sediments, 2006, 6(4),

13 [15] Poggio, L., Vrščaj, B., Schulin, R., Hepperle, E., & Marsan, F. A., Metals pollution and human bioaccessibility of topsoils in Grugliasco (Italy).Environmental Pollution, 2009, 157(2), , [16] Khan, F., Tahir Husain, and Ramzi Hejazi. "An overview and analysis of site remediation technologies." Journal of environmental management 2004, 71.2, [17] Hallaman E., Fizykochemiczne aspekty oczyszczania zaolejonych gruntów z wykorzystaniem surfaktantów syntetycznych i biosurfaktantów, Rozprawa doktorska, Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra technologii Tłuszczów i Detergenty, 2008 [18] Radwan K., Ślosorz Z., Rakowska J. Efekty środowiskowe usuwania zanieczyszczeń ropopochodnych Bezpieczeństwo i Technika Pożarnicza 2012, [19] Kalisz M., Krupanek J., Innowacyjne metody chemicznego i biologicznego oczyszczania zanieczyszczonych gleb i wód podziemnych-projekt UPSOIL, Otwarte seminaria 2012, [20] Koreleski K., Przegląd metod rekultywacji gleb zanieczyszczonych związkami organicznymi, Komisja Geodezji i Inżynierii Środowiska PAN, 2014, [21] Pacwa-Płociniczak M., Environmental Applications of Biosurfactants: Recent Advances, International Journal of Molecular Sciences, 2011, 12, [22] Rosenberg, E., Ron E.Z., High-and low-molecular-mass microbial surfactants, Applied microbiology and biotechnology 1999, 52.2, [23] Krzyczkowska J., Bialecka-Florjanczyk E., Biotechnologiczna synteza związków powierzchniowo czynnych i przykłady ich praktycznego zastosowania, Żywność Nauka Technologia Jakość 2012, 19(4),2012, [24] Desai J.D., Banat I.M., Microbial production of surfactants and their commercial potential, Microbiology and Molecular biology reviews , [25] Van Hamme, Jonathan D., A. Singh, O. P.Ward., Physiological aspects: Part 1 in a series of papers devoted to surfactants in microbiology and biotechnology, Biotechnology Advances 24.6, 2006, , [26] Pacwa-Płociniczak M., Environmental Applications of Biosurfactants: Recent Advances, International Journal of Molecular Sciences, 2011,12,