Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego. w Warszawie. Wydział Nauk o Zwierzętach. Mirosław Łańcut

Transkrypt

1 Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Wydział Nauk o Zwierzętach Mirosław Łańcut Pracownia hodowli i badań prowadzonych na modelu danio pręgowanego (Danio rerio) w Ośrodku Medycyny Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie - projekt, wyposażenie i hodowla Praca dyplomowa na kierunku Zwierzęta laboratoryjne hodowla, utrzymanie i użytkowanie Praca wykonana pod kierunkiem Lek. wet. Piotr Korzeniowski Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie

2 Oświadczenie promotora pracy Oświadczam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i stwierdzam, że spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie tytułu zawodowego. Data... Podpis promotora pracy... Oświadczenie autora pracy Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza praca dyplomowa została napisana przeze mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami. Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur związanych z uzyskaniem tytułu zawodowego w wyższej uczelni. Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją elektroniczną. Data... Podpis autora pracy... 1

3 Spis treści: 1. Wstęp str Ośrodek Medycyny Doświadczalnej str Regulamin Ośrodka Medycyny Doświadczalnej UM w Lublinie str Pracownia hodowli ryb Danio pręgowanego str Opis gatunku str Hodowla str Zdrowie i dobrostan w hodowli str Rozmnażanie ryb w warunkach laboratoryjnych str Żywienie str Znieczulenie i uśmiercanie str Import i eksport str Choroby str Piśmiennictwo str. 41 2

4 Wstęp Ośrodek Medycyny Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie powstał w 2015r. Jest to nowoczesny kompleks badawczy z zapleczem hodowlanym, wybudowany na zapotrzebowanie kadry naukowej Uniwersytetu Medycznego, dla której stworzył odpowiednie warunki do badań z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych. Ośrodek Medycyny Doświadczalnej spełnia wymagania zgodne z rozporządzeniem Ministerstwa Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 10 marca 2006r w sprawie szczegółowych warunków utrzymania zwierząt laboratoryjnych w jednostkach doświadczalnych, jednostkach hodowlanych i u dostawców oraz dyrektywą 123 Unii Europejskiej w sprawie ujednolicenia praw, regulacji i decyzji administracyjnych państw członkowskich dotyczących ochrony zwierząt używanych do eksperymentów i innych celów naukowych wraz z aneksami. Obiekt został zaprojektowany, wybudowany i wyposażony przy współfinansowaniu przez Unię Europejską ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Rozwoju Polski Wschodniej Ośrodek Medycyny Doświadczalnej Aby wypełnić wszystkie założone zadania Ośrodek Medycyny Doświadczalnej został zaprojektowany zgodnie z najlepszą wiedzą dotyczącą takich obiektów. Na powierzchni 2000 tys. m2 Ośrodka znajduje się część laboratoryjna, w której powstały specjalistyczne pracownie naukowe z pełnym wyposażeniem w aparaturę badawczą, sale operacyjne z pomieszczeniem pooperacyjnej opieki lekarskiej, część hodowlana, w której warunki środowiskowe spełniają wymagania hodowli SPF, czyli wolnej od specyficznych patogenów, kwarantanna oraz część gospodarcza w postaci zaplecze gospodarczo-technicznego z magazynami, myjnią dwustrefową (czystą i brudną), sterylizatornią, stacją uzdatniania wody. Pomieszczenia hodowlane oraz utrzymania zwierząt w eksperymencie, sale operacyjne i pokoje laboratoryjne są klimatyzowane poprzez nowoczesny system zapewniający optymalne warunki do utrzymania zwierząt laboratoryjnych. Każde pomieszczenie ma stałe warunki środowiskowe na poziomie 55% wilgotności powietrza z temperaturą 22 +/- 2 st. C i 15-krotną wymianą powietrza na godzinę. Period świetlny dzień/noc wynosi 12 godzin i jest regulowany przez oprogramowanie. Wszystkie parametry środowiskowe jak i monitoring pomieszczeń są pod nadzorem centralnego programu monitorującego Ośrodek. 3

5 Pomieszczenia hodowlane wyposażone są w specjalistyczny sprzęt do hodowli i utrzymania zwierząt, klatki indywidualnie wentylowane (IVC), umożliwiające utrzymanie najwyższych rygorów sanitarnych hodowli, stacje bezpiecznej wymiany klatek i stację usuwania ściółki, zapewniające maksymalną ochronę operatora, jak i środowiska przed patogenami przenoszonymi drogą powietrzną. Część hodowlana jak i laboratoryjna są izolowane od pomieszczeń ogólnie dostępnych za pomocą śluz osobowo-towarowych, do których dostęp zabezpieczony jest systemem kart indywidualnego dostępu. Integralną częścią zaplecza gospodarczo-technicznego jest zmywalnia wyposażona w automatyczną myjnię tunelową, myjącą regały, klatki hodowlane i butelki. Szczelna komora myjni służy także do sterylizacji sprzętu i aparatury w atmosferze nadtlenku wodoru. Centralna sterylizatornia wyposażona jest w trzy autoklawy przelotowe. Sterylizacji podlega cały sprzęt hodowlany, a także woda do picia, pasza i ściółka dla zwierząt. Zaplecze gospodarcze posiada również magazyny ściółki, paszy oraz sprzętu hodowlanego. Ten nowoczesny kompleks o charakterze naukowo-hodowlanym, umożliwia realizację największych projektów badawczo-rozwojowych, stwarza warunki pracy naukowej dla eksperymentatorów wywodzących się z jednostek Uniwersytetu Medycznego, oraz wszystkich chętnych do współpracy najlepszych specjalistów z kraju i zagranicy. Najważniejszą funkcją Ośrodka jest stworzenie platformy badawczej skupiającej wszystkie badania prowadzone z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych. Infrastruktura badawcza w postaci nowoczesnej aparatury badawczej, to takie urządzenia jak Aparat Rezonansu Magnetycznego o mocy 7 tesli, system do przyżyciowego obrazowania czy w pełni wyposażona pracownia hodowli komórkowej, pracownia badań ryb z gatunku Danio rerio. 4

6 Plan pomieszczeń OMD, kolorem niebieskim oznaczone pomieszczenia pracowni hodowli i badań ryb Danio rerio. REGULAMIN ORGANIZACYJNY OŚRODKA MEDYCYNY DOŚWIADCZALNEJ UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W LUBLINIE I. POSTANOWIENIA OGÓLNE 1 1. Ośrodek Medycyny Doświadczalnej zwany dalej OMD lub Ośrodkiem jest ogólnouczelnianą jednostką Uniwersytetu Medycznego w Lublinie o charakterze eksperymentalno-hodowlanym. 2. OMD działa na podstawie: a) Statutu Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, 5

7 b) Ustawy z dnia 15 stycznia 2015r. o ochronie zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych lub edukacyjnych, c) aktów wykonawczych wydanych na podstawie w/w ustawy, d) wytycznych wydanych przez instytucje nadzoru weterynaryjnego, e) niniejszego Regulaminu. 3. Użyte w Regulaminie pojęcia oznaczają: UM w Lublinie Uniwersytet Medyczny w Lublinie Eksperymentator osoba przeprowadzająca lub uczestnicząca w doświadczeniach z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych, Personel obsługujący opiekunowie zwierząt, wyznaczeni pracownicy OMD Użytkownik osoba fizyczna, osoba prawna lub jednostka nieposiadająca osobowości prawnej, która wykorzystuje zwierzęta w procedurach OMD zlokalizowany jest w budynku przy ul. Dra K. Jaczewskiego 8 d w Lublinie. 2. Jednostką podległą OMD jest Laboratorium Badań Behawioralnych zlokalizowane przy ul. W. Chodźki 8 w Lublinie. 3 Nadzór merytoryczny i finansowy nad działalnością OMD sprawuje Prorektor do Spraw Nauki UM w Lublinie. 4 Niniejszy Regulamin określa zasady i zakres działalności OMD. II. ZADANIA OMD 5 1. Podstawowym rodzajem działalności Ośrodka jest hodowla zwierząt laboratoryjnych. 6

8 2. OMD umożliwia realizację szkoleń w zakresie czynności wykonywanych z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych. 3. Wyposażenie i aparatura OMD mogą być wykorzystywane wyłącznie w celach hodowlano eksperymentalnych z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych, między innymi w zakresie badań biologicznych. 4. Wyposażenie i aparatura OMD mogą być wykorzystywane przez zespoły badawcze w skład których wchodzą pracownicy Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, tworząc samodzielne zespoły lub współpracujące z osobami zatrudnionymi w zewnętrznych podmiotach i instytucjach badawczych, zgodnie z Zarządzeniem Nr 49/2014 Rektora UM w Lublinie z dnia 24 kwietnia 2014r. w sprawie wprowadzenia Regulaminu wykorzystania aparatury badawczej. III. ZARZĄDZANIE OMD 6 1. Ośrodkiem kieruje Kierownik OMD, który zarządza jednostką zgodnie z obowiązującymi przepisami. 2. Kierownik OMD jest bezpośrednim przełożonym wszystkich pracowników OMD. 3. Kierownik OMD odpowiada za działalność Ośrodka wobec Prorektora do Spraw Nauki UM w Lublinie 7 1. Do obowiązków Kierownika OMD należy w szczególności: a) planowanie, organizacja i koordynacja pracy OMD, b) nadzór nad prawidłowym funkcjonowaniem OMD, c) nadzór nad należytym zapewnieniem dobrostanu zwierząt laboratoryjnych, d) nadzór nad badaniami prowadzonymi z użyciem zwierząt laboratoryjnych, e) prowadzenie ewidencji zwierząt laboratoryjnych wykorzystywanych do doświadczeń, 7

9 f) realizacja obowiązków sprawozdawczych między innymi na temat stanu epidemiologicznego i sanitarnego OMD, stanie liczebnym zwierząt oraz wykonywanych doświadczeniach. 2. Ponadto Kierownik OMD: a) przedstawia Prorektorowi do Spraw Nauki wnioski dotyczące budżetu OMD, b) sprawuje nadzór nad przestrzeganiem praw i obowiązków podległych mu pracowników, c) dba o należyty stan powierzonego mienia, za które wg obowiązujących przepisów ponosi odpowiedzialność, d) odpowiada za organizację szkoleń dla osób wyznaczonych do sprawowania opieki nad zwierzętami utrzymywanymi w Ośrodku, wyznaczonych i odpowiedzialnych za planowanie procedur i doświadczeń oraz za ich przeprowadzanie, wyznaczonych do wykonywania procedur, uczestniczących w procedurach, opiekujących się zwierzętami oraz uśmiercających zwierzęta wykorzystywane w procedurach. IV. FUNKCJONOWANIE OMD 8 1. Spośród pracowników naukowo-dydaktycznych zatrudnionych w UM w Lublinie powołuje się Radę Naukową dla OMD 2. Przewodniczącym Rady jest Prorektor do Spraw Nauki UM w Lublinie 3. Do zadań Rady Naukowej dla OMD należy: a) koordynacja realizowanych projektów naukowych b) inicjacja nowych projektów badawczych c) pozyskiwanie partnerów zewnętrznych do badań naukowych d) nadzór nad wdrażaniem procedur związanych z uzyskaniem Certyfikatu GLP (Good Laboratory Practice), będącego międzynarodowym świadectwem dobrej jakości prowadzonych badań. 8

10 e) stałe utrzymywanie standardów GLP w Ośrodku Medycyny Doświadczalnej Spośród pracowników Uniwersytetu Medycznego w Lublinie powołuje się Zespół Doradczy do Spraw Dobrostanu Zwierząt. 2. Do zadań Zespołu należy: a) udzielanie porad w sprawach związanych z zapewnieniem dobrostanu zwierząt oraz innych dotyczących opieki i postępowania ze zwierzętami, b) opracowanie i dokonywanie przeglądu wewnętrznych zasad postępowania ze zwierzętami utrzymywanymi w Ośrodku, c) monitorowanie przypadków uśmiercania zwierząt w celu pozyskania narządów lub tkanek, d) monitorowanie dobrostanu zwierząt utrzymywanych w Ośrodku, e) zgłaszanie przypadków naruszenia dobrostanu zwierząt i określaniu czynności, które należy podjąć w celu przywrócenia tego dobrostanu, f) kontrola przeprowadzania doświadczeń i ich wyników, z uwzględnieniem wpływu tych doświadczeń na wykorzystywane w nich zwierzęta oraz ocenie zgodności przeprowadzanych doświadczeń z zasadami zastąpienia, ograniczenia i udoskonalania W Ośrodku Medycyny Doświadczalnej wyznacza się osoby, posiadające odpowiednie kwalifikacje do: a) nadzoru nad osobami sprawującymi opiekę nad zwierzętami oraz dobrostanem zwierząt utrzymywanych w Ośrodku, b) świadczenia usług weterynaryjnych, c) opieki nad zwierzętami 9

11 11 Użytkownik przekazuje Kierownikowi OMD pisemne wyznaczenia osób odpowiedzialnych za: a) planowanie procedur i doświadczeń b) przeprowadzanie procedur i doświadczeń c) wykonywanie procedur d) uczestniczenie w wykonywaniu procedur e) uśmiercanie zwierząt 12 W budynku OMD wyróżnia się niżej wymienione strefy, w których udostępnia się eksperymentatorom określone pomieszczenia i laboratoria: 1. Strefa hodowlana 2. Strefa laboratoryjna a) Laboratorium badań behawioralno-metabolicznych b) Laboratorium hodowli komórkowych c) Laboratorium modyfikacji genetycznych d) Laboratorium biologiczne e) Laboratorium biochemiczne f) Laboratorium hematologiczne g) Sala zabiegowa h) Sala sekcyjna i) Sale operacyjne z salą pooperacyjną j) Pomieszczenia zamrażarek 3. Strefa eksperymentalna a) Laboratorium rezonansu magnetycznego MRI 10

12 b) Laboratorium badań przyżyciowych IVIS c) Pomieszczenia zwierząt w eksperymencie 4. Kwarantanna a) Laboratorium badań genetycznych i behawioralnych ryb b) Pomieszczenie do hodowli ryb c) Pomieszczenie do kwarantanny zwierząt 5. Izolatka 6. Strefa czysta ze sterylizatornią 7. Strefa brudna 8. Strefa administracyjno-socjalna 9. Strefa gospodarczo-techniczna 13 Na terenie OMD wyodrębnia się specjalne pomieszczenia i wyposażenie przeznaczone na działalność Zakładu Inżynierii Genetycznej, w zakresie zamkniętego użycia GMO Realizację projektów badawczych polegających na wykonywaniu doświadczeń z użyciem zwierząt laboratoryjnych poprzedza: a) uzyskanie indywidualnego wyznaczenia, o którym mowa w 11, b) złożenie wniosku do Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach, c) w przypadku podmiotów zewnętrznych - zawarcie umowy z UM w Lublinie na realizację prac badawczo rozwojowych, zgodnie z Zarządzeniem Nr 49/2014 Rektora UM w Lublinie z dnia 24 kwietnia 2014r. w sprawie wprowadzenia Regulaminu wykorzystania aparatury badawczej. 2. Po spełnieniu wymogów, o których mowa w 14 Kierownikowi OMD należy dostarczyć: a) kopię wniosku, o którym mowa w 14 ust.1 lit. a, 11

13 b) decyzję Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach, c) kopię aktualnych wyznaczeń wszystkich osób uczestniczących i wykonujących doświadczenie, d) wypełnionej Karty Zgłoszenia Eksperymentu, uwzględniającego zapotrzebowanie na akcesoria oraz sprzęt laboratoryjny z podaniem dokładnych terminów ich wykorzystywania e) w treści Zgłoszenia Eksperymentu, o którym mowa powyżej należy uwzględnić również zapotrzebowania na zwierzęta laboratoryjne, o ile w doświadczeniu przewiduje się wykorzystanie zwierząt aktualnie hodowanych w OMD Na terenie OMD przebywać mogą tylko osoby wyznaczone do czynności, o których mowa w Osoby korzystające z aparatury OMD obowiązuje konieczność pisemnego potwierdzenia zaznajomienia się z Regulaminem Ośrodka oraz obsługą wybranych urządzeń. 3. Osoby korzystające z wyposażenia OMD UM w Lublinie obowiązuje konieczność pisemnego potwierdzenia zaznajomienia się z wewnętrznymi procedurami i szczegółowymi wytycznymi, wydanymi przez Kierownika OMD. 16 OMD zapewnia eksperymentatorom: a) pomieszczenia laboratoryjne wyposażone w sprzęt laboratoryjny, b) pomieszczenia zwierząt w eksperymencie, c) zwierzęta laboratoryjne, z uwzględnieniem 14 ust.2 lit. e, d) jednorazowe kombinezony, rękawiczki, czepki i okulary ochronne tylko do pracy za barierą eksperymentalną 17 OMD nie zapewnia eksperymentatorom niżej wymienionych materiałów wykorzystywanych do pracy w laboratoriach: 12

14 a) odzieży ochronnej wielokrotnego użytku (obuwie, fartuch), b) materiałów i sprzętu jednorazowego oraz odczynników chemicznych Opiekę nad zwierzętami sprawują wyznaczeni do tego celu i odpowiednio wykwalifikowani pracownicy OMD. 2. Opieka nad zwierzętami w OMD obejmuje: a) karmienie i pojenie zwierząt, b) wymianę klatek, c) utrzymywanie pomieszczeń w porządku, d) informowanie eksperymentatora o wszelkich dostrzeżonych zmianach w zachowaniu zwierząt i ich stanie zdrowia. e) kontrolę sprawowaną przez lekarza weterynarii W OMD przeprowadza się badania naukowe z użyciem zwierząt laboratoryjnych: a) aktualnie hodowanych w Ośrodku b) zamawianych, przez jednostki naukowe lub eksperymentatorów zgodnie obowiązującymi w UM w Lublinie procedurami, z innych placówek krajowych lub zagranicznych wpisanych do rejestru dostawców zwierząt laboratoryjnych prowadzonego przez właściwego ministra. 2. Na terenie OMD obowiązuje łagodne i humanitarne traktowanie zwierząt laboratoryjnych W przypadku wykorzystania w badaniach naukowych zwierząt laboratoryjnych o których mowa w 19 ust.1 lit. b należy, z co najmniej 30 dniowym wyprzedzeniem: a) poinformować Kierownika OMD o planowanym terminie przybycia zwierząt, 13

15 b) przedłożyć Kierownikowi OMD kopię właściwych certyfikatów i zaświadczeń dotyczących pochodzenia i stanu zdrowia zwierząt laboratoryjnych 2. Zwierzęta laboratoryjne dostarczone do OMD poddawane są obowiązkowej kwarantannie. Dalsze postępowanie ze zwierzętami uzależnione jest od ich ogólnej kondycji, stwierdzonej przez osobę wykonującą obowiązki lekarza weterynarii. V. POSTANOWIENIA KOŃCOWE Wszelkie zmiany Regulaminu wymagają zastosowania trybu przewidzianego do jego wprowadzenia. 2. Naruszenie postanowień niniejszego Regulaminu stanowi naruszenie obowiązków pracowniczych w rozumieniu art. 100 Kodeksu pracy. 3. W sprawach nieuregulowanych niniejszym Regulaminem mają zastosowanie odpowiednie przepisy aktów prawnych wymienionych w 1 niniejszego Regulaminu. Pracownia hodowli ryb danio W ramach nowo powstałego Ośrodka Medycyny Doświadczalnej a w odpowiedzi na zapotrzebowanie kadry naukowej Uniwersytetu Medycznego na nowy model zwierząt laboratoryjnych, powstała Pracownia hodowli i badań danio pręgowanego. Ze względu na zaawansowany stopień prac budowlanych w Ośrodku w momencie podjęcia decyzji o stworzeniu laboratorium ryb, projekt dla tego laboratorium musiał uwzględniać istniejące pomieszczenia Ośrodka. Na Pracownię hodowli i badań ryb zostały zaadaptowane cztery pomieszczenia w strefie kwarantanny. Pomieszczenia laboratorium zostały odgraniczone od korytarza i pozostałych pomieszczeń kwarantanny przez śluzę osobową. Pracownia mieści cztery pomieszczenia: pomieszczenie hodowli ryb, kwarantanna ryb, utrzymania ryb w doświadczeniu, oraz laboratorium badań na modelu danio. Wejście do części hodowlanej, kwarantanny i utrzymania ryb w eksperymencie prowadzi przez śluzę osobową wyposażoną w szczelne drzwi z zamkiem dostępowym. W śluzie 14

16 znajduje się lampa UV przepływowa, podajnik środka do odkażania rąk i pojemnik z jednorazowymi rękawiczkami. Ze śluzy prowadzą szczelne drzwi do pomieszczeń Pracowni. Pomieszczenie hodowlane o powierzchni m 2 wyposażone jest w system doprowadzenia wody uzdatnionej do regałów hodowlanych, system odprowadzenia wody zużytej, kratkę ściekową w centralnej części podłogi, system zasilania w energię elektryczną przez uziemione wodoszczelne gniazda, system klimatyzacji i wymiany powietrza utrzymujący stałe warunki środowiskowe, system programowanego periodu świetlnego dzień/noc. W pomieszczeniu hodowlanym zainstalowano sześć wolnostojących regałów hodowlanych ryb typu Stand-Alone model Active Blue (Tecniplast), uwzględniając przestrzeń do obsługi i wymiany pojemników bytowych ryb. Regał hodowlany typu Stand-Alone model Active Blue Kolejne przejście prowadzi do pomieszczenia kwarantanny ryb. Kwarantanna to pomieszczenie o powierzchni 5.33 m 2 wyposażone jest w system doprowadzenia i odprowadzenia wody uzdatnionej do regałów hodowlanych, kratkę ściekową w centralnej 15

17 części podłogi, system zasilania w energię elektryczną przez uziemione wodoszczelne gniazda, system klimatyzacji i wymiany powietrza utrzymujący stałe warunki środowiskowe, system programowanego periodu świetlnego dzień/noc. W kwarantannie zainstalowano jeden wolnostojący regał hodowlany Active Blue, stół, krzesła i szafki laboratoryjne z materiałów wodoodpornych. Trzecie szczelne drzwi prowadzą do pomieszczenia utrzymania ryb w doświadczeniu. Na powierzchni m 2 zainstalowano podobnie jak w poprzednich pomieszczeniach system doprowadzenia i odprowadzenia wody, kratkę ściekową w centralnej części podłogi, system zasilania w energię elektryczną przez uziemione wodoszczelne gniazda, system klimatyzacji i wymiany powietrza utrzymujący stałe warunki środowiskowe, system programowanego periodu świetlnego dzień/noc. W pomieszczeniu zainstalowano dwa wolnostojące regały do genotypowania ryb typu (Genotype Stand-Alone Aquatic System, Tecniplast) i dwa wolnostojące regały toksykologiczne typu Stand-Alone ( Tox Aquatic System, Tecniplast). Regał toksykologiczny typu Stand-Alone Tox Aquatic System. 16

18 Regały do genotypowania ryb typu Genotype Stand-Alone Aquatic System. Pomieszczenie laboratorium badań na modelu danio o powierzchni m 2 posiada oddzielne wejście z korytarza zabezpieczone szczelnymi drzwiami. Laboratorium zostało wyposażone w meble laboratoryjne zapewniając cztery stanowiska pracy. Specjalistyczny sprzęt do badań na modelu danio w postaci trzech stanowisk do mikromanipulacji zaopatrzone w mikroskopy Stemi 508 (Zeiss), mikromanipulatory i mikro-iniektory Programmable Microinjector IM 300 (Narishige), mikroskop fluoroscencyjny Stereo Discovery V8 (Zeiss), aparaturę do badań behawioralnych ZebraBox i ZebraCube (ViewPoint), inkubatory hodowlane, stanowi wyposażenie laboratorium. 17

19 Stanowiska do mikromanipulacji wyposażone w mikroskopy stereoskopowe. Stanowisko do obrazowania wyposażone w mikroskop fluoroscencyjny Stereo Discovery V8 Aparatura do badań behawioralnych ryb View Point Zebrabox 18

20 Opis gatunku - danio pręgowany (Danio rerio; Hamilton 1822) Danio pręgowany należący do rodziny karpiowatych (Cyprinidae) w naturze występuje w wolno płynących i stojących wodach Indii, Pakistanu, Bangladeszu, Nepalu i Birmy, jest to ryba smukła, posiadająca na bokach ciała pięć równoległych niebieskich pasów. Długość jej ciała osiąga 4,5 5,0 cm. Posiada silnie zaznaczony dymorfizm płciowy. Samce są smuklejsze a ich ubarwienie posiada wyraźną domieszkę barwy pomarańczowej, szczególnie dotyczy to płetw. Samice o ubarwieniu żółto-srebrnym mają wyraźnie uwydatnioną partią brzuszną. Cechy te są dobrze wyrażone u linii posiadających ubarwienie charakterystyczne dla typu dzikiego (WT). W przypadku ryb o innym fenotypie, szczególnie gdy są młode, określenie płci na podstawie ubarwienia może być trudniejsze. Danio pręgowany charakteryzuje się łatwością utrzymania w warunkach laboratoryjnych. Krótki cykl rozwojowym ok. 2 4 miesięcy od zapłodnionego jaja do osiągnięcia dojrzałości płciowej jest dodatkowym atutem modelu. Dostępność dużej ilości materiału do badań, łatwość manipulacji genetycznych oraz zasobność kolekcji mutantów i linii transgenicznych sprzyja prowadzeniu prac badawczych. Przezroczystość ciała danio we wczesnych stadiach rozwojowych, w połączeniu z małym rozmiarem larw umożliwia prowadzenie bardzo zaawansowanych badań mikroskopowych in vivo. Genom danio został zsekwencjonowany. Danio pręgowany posiada 25 chromosomów, na których znajdują się odpowiedniki ponad 70% genów ludzkich, co daje duże podobieństwo zjawisk zachodzących u tej ryby do tych, które zachodzą w organizmie człowieka. Kierunki badań z zakresu biologii i medycyny prowadzone z zastosowaniem danio pręgowanego: genetyka i rozwój, neurologia i neuropatologia, kardiologia, onkologia, farmakodynamika i toksykologia. biochemia 19

21 behawior kontrola środowiska Behawior ryb Danio są bardzo aktywnymi zwierzętami stadnymi, które powinny być utrzymywane w grupach powyżej 5 sztuk. W stadach liczących mniej ryb często robią się agresywne. Odpowiednimi są dla nich długie i płytkie baseny. Lubią polować (żywy pokarm). Posiadają bardzo czułe zmysły, pozwalające szybko reagować na bodźce pochodzące z otoczenia. Danio ma tendencję do skakania w momentach działania stresora, na co trzeba zwrócić uwagę przy pracy (ryzyko utraty ryb oraz zagrożenie pomieszania linii o identycznym ubarwieniu). Inną reakcją na stres jest szybkie pływanie lub pozostanie w bezruchu przy dnie zbiornika. W momentach silnego przestraszenia gatunek ten ma zdolność do opróżnienia przedniej części przewodu pokarmowego ( pseudożołądek ) z treści pokarmowej. Może dojść również do intensywniejszego oddawania kału. Spokojne ryby przebywają w górnych i środkowych partiach zbiornika. Podczas karmienia, żywo reagują na obecność opiekuna i jeszcze przed podaniem pokarmu gromadzą się przy powierzchni wody. Naturalne zachowanie swobodne pływanie po całym zbiorniku 20

22 Reakcją na stres jest pływanie przy dnie. Podczas karmienia ryby gromadzą się przy powierzchni wody. 21

23 Hodowla ryb danio W pracowni hodowli OMD, ryby danio utrzymuje się w akwariach o pojemności 3,5 litra oraz 8 litrów w zautomatyzowanych systemach typu Stand-Alone model Active Blue. Systemy do hodowli zapewniają: - filtracje wody posiadają wydajne układy filtracji mechanicznej, chemicznej i biologicznej oraz lampy UV. - monitorowanie parametrów środowiskowych oraz prawidłowego działania sprzętu - system powiadomień i alarmów co zapewnia większe bezpieczeństwo hodowli - utrzymanie odpowiednich parametrów wody - automatyczną wymianę wody - uniezależnienie się od złej jakości wody wodociągowej (system przygotowuje wodę na bazie wody RO z dodanymi roztworami soli i wodorowęglanu sody) Dla ryb w OMD środowiskiem jest woda systemowa o następujących parametrach: temperatura 26 28,5 C, ph 6,9 7,5, przewodnictwo wody µs, Zawartość związków azotowych - NH4+ /NH3 0,0 mg/l, - NO2 0,0 0,1 mg/l, - NO3 1 5 mg/l, Bardzo ważne jest manualne monitorowanie i kontrola parametrów wody systemowej w zakresie zawartości w wodzie związków azotowych ze względu na zagrożenie toksycznością amoniaku i azotynów. Kontrola w OMD prowadzona jest z zastosowaniem testów firmy JBL. Monitorowane są również następujące parametry : Twardość ogólna 3 6 twardość węglanowa 1 3, zawartość rozpuszczonego tlenu >6 mg/l lecz nie przekraczająca 15 mg / l średni dobowy cykl wymiany wody z systemu 10 15%. 22

24 Oprócz odpowiedniej jakości wody ważne jest także zapewnienie odpowiedniego oświetlenia. W pracowni zainstalowano lampy jarzeniowe o białej barwie, zapewniające co najmniej 350 luksów i pracujące ( w pracowni danio) w cyklu 14/10 godzin (dzień/noc) z możliwością programowania natężenia światła i czasu rozjaśniania. Sterowanie parametrami oświetlenia realizowane jest przez programowalny panel sterowania. Procedura nr 1 Hodowla ryb Danio rerio Utrzymanie ryb w akwariach w OMD 5 sztuk na 1 litr wody Przed wejściem do pomieszczeń należy zdezynfekować ręce i założyć rękawiczki! Sprawdzić we wszystkich regałach: wyświetlacze (parametry i alarmy; prawidłowe parametry to ph 6.9-7,5, temp 28 stopni, przewodność 600 lub 1000 w regale gdzie narybek karmi się wrotkami) pojemniki z roztworami soli morskiej i węglanów oraz sondy w sumpach (sondy muszą być zanurzone w roztworze); w razie potrzeby roztwory należy uzupełnić. W przypadku wcześniejszego pozostawienia ryb do rozmnażania należy podnieść przegrody w pojemnikach. 8:00 karmienie wszystkich ryb: podnosi się przepływy po podaniu karmy należy odczekać 15 minut aż ryby zjedzą po zakończeniu karmienia należy opuścić przepływy Czyszczenie pojemników w regałach- nie więcej niż 5 pojemników dziennie w jednym regale zmywarka Wymiana filtrów w zależności od zanieczyszczenia (intensywność karmienia, grupy wiekowe). 9:30 odłowienie ryb po tarle, płukanie ikry roztworem E3, rozłożenie ikry na szalkach 23

25 Petriego (50 sztuk na szalkę), włożenie szalek do inkubatora (temp. 28,5 stopni) 10:00 karmienie młodego narybku 11:30 odłączenie napowietrzania w pojemniku z artemią i jej pozyskanie, nastawienie nowej hodowli artemii. 12:00 karmienie wszystkich ryb 14:00 karmienie młodego narybku 16:00 karmienie wszystkich ryb W przypadku przygotowywania ryb do rozmnażania, należy nalać wody systemowej do małych pojemników tarliskowych a następnie odłowić ryby do rozrodu 2 samice na 4 samce, 1 samica na 3 samce lub 1 samica na 1 samca (oddzielenie samic od samców przegrodą). Pozostałe czynności Codzienne mycie pojemnika z artemią. Dwa razy w tygodniu odnawianie hodowli wrotek. Raz w tygodniu kontrola poziomu azotanów, azotynów, amoniaku. Raz na dwa tygodnie kontrola parametrów ph, przewodność, temp. przy użyciu mierników, ewentualna kalibracja. Raz w miesiącu badanie bakteriologiczne, mikologiczne, parazytologiczne ryb wskaźnikowych (sentinele) oraz badanie osadu biologicznego. Badania wykonuje lekarz weterynarii. Raz w miesiącu mycie regałów. Raz w miesiącu zliczamy wszystkie ryby. Co pół roku wysyłamy ryby do badań bakteriologicznych, mikologicznych, parazytologicznych i wirusologicznych ryb wskaźnikowych (sentineli). Zdrowie i dobrostan ryb w hodowli Obowiązuje zasada czystości i sterylności całego sprzętu stanowiącego wyposażenie pracowni, dokładne mycie, odkażanie i sterylizacja sprzętu, oraz przestrzegania zasad higieny pracowników zasada czystych rąk. Przed wejściem do pracowni zainstalowano urządzenia do sterylizacji rąk i podajniki rękawiczek jednorazowych. 24

26 Ryby które wprowadzamy do pracowni hodowli przechodzą kwarantannę w oddzielnym pomieszczeniu kwarantanny i wydzielonym autonomicznym systemie hodowlanym. Ryby, które po 30-dniowej obserwacji, w trakcie której nie wykazały objawów chorobowych, mogą otrzymać zgodę na dopuszczenie do tarła, ale dopiero odkażona ikra takich ryb jest wprowadzana do hodowli w systemie głównym akwakultury. Kwarantanna ma więc charakter ostateczny a nie okresowy. Odkażanie ikry - zewnętrzne odkażanie ikry nie zabezpiecza przed przeniesieniem niektórych chorób (np. transmisja spor Pseudoloma neurophilia). Do odkażania ikry używane są wodne roztwory podchlorynu sodu, a następnie ikra jest inkubowana w temperaturze 28.5 C w E3 przez 5 dni. W trakcie prowadzenia zabiegów hodowlanych usuwane są stare ryby bez wartości hodowlanej, ponieważ dodatkowo mogą wykazywać wzrost podatności na choroby, w wyniku zmniejszającej się z wiekiem wydolności układu immunologicznego. Prowadzi się intensywną obserwację wyglądu i zachowania ryb. Natychmiast usuwane, bądź izolowane są ryby z objawami klinicznymi chorób oraz wprowadzana jest szybka diagnostyka lekarskoweterynaryjna, celem wyeliminowania szerzenia się infekcji w systemie. Do hodowli wprowadzone są ryby testowe (strażnicy) które poddawane są okresowym badaniom zdrowia. W pakiecie badań prowadzi się badania: bakteriologiczne, mikologiczne i parazytologiczne, na podstawie których podejmowane są dalsze decyzje co do przydatności ryb do hodowli. Prowadzone są także badanie osadu biologicznego gromadzącego się w systemie. Osad lub tzw. nawis biologiczny zazwyczaj składa się z niewywołujących chorób u ryb: śluzowców, wrotków, pierwotniaków, licznych bakterii oraz z zalegających resztek pokarmu i odchodów ryb. Stanowi jednak idealne środowisko rozwoju bakterii i grzybów patogennych dla ryb. W osadach również mogą przetrwać liczne formy przetrwalnikowe patogenów. Przyrost zanieczyszczeń biologicznych należy ograniczać poprzez regularne, mechaniczne oczyszczanie wszystkich dostępnych elementów systemu: zbiorników hodowlanych, filtrów, rynien odpływowych, systemu rozprowadzenia wody. Przekroczenie górnej wartości stężeń azotynów i amoniaku grozi zatruciem objawiającym się zaburzeniami oddychania (duszność), nadprodukcją śluzu ze zmętnieniami gałek ocznych i skóry oraz martwicą płetw. Ostre zatrucie prowadzi w krótkim czasie do śmierci ryb. Zagrożenie to jest większe szczególnie przy intensywnym karmieniu i wzroście 25

27 zagęszczenia ryb w hodowli. Woda systemowa nie może zawierać substancji, takich jak: chlor, metale ciężkie (miedź, rtęć, ołów, chrom i kadm), środków ochrony roślin czy detergentów, które są wysoko toksyczne dla ryb. Zachwianie cyklu świetlnego prowadzi do zaburzeń w rozmnażaniu, ogólnych zaburzeń behawioralnych oraz zmian w żerowaniu. Realizacja dobrostanu jest zapewniona przez utrzymanie kontrolowanych, właściwych warunków środowiska, optymalne żywienie, umiejętne postępowanie z rybami, gwarantujące minimalizację stresu w czasie manipulacji, prawidłowo stosowaną anestezję i analgezję oraz właściwe metody eutanazji ograniczające cierpienie. Gwarancją spełnienia tych warunków jest doświadczony, autoryzowany personel, posiadający uprawnienie przewidziane polskim ustawodawstwem regulującym postępowanie ze zwierzętami laboratoryjnymi. Istotna jest rola nadzorująca powołanego zespołu d/s dobrostanu zwierząt. Procedura nr 4 - Mycie regałów i akcesoriów używanych w hodowli Mycie regałów (częstotliwość mycia w/g grafiku rozkładu pracy) Przed myciem należy przełowić ryby do czystego akwarium pamiętając o tym, aby do nowego akwarium wlać 1/3 objętości wody z akwarium w którym ryby były utrzymywane do tej pory, w celu utrzymania niezmienionych parametrów wody w regale. Do mycia używamy wyłącznie wody demi. Myciu ręcznemu podlegają : - filtry, pokrywy, syfony - tylne rynny z przegrodami - rury odpływowe - wnętrze sumpa - podstawy na których stoją akwaria w regale Myciu mechanicznemu podlegają - akwaria pojemniki 3,5 litra oraz 8 litrów Procedura mycia mechanicznego w myjni - uruchomienie sprężarki 26

28 - włączenie zasilanie myjni - wybór program STD Chemical Wszelkie stałe elementy regału należy przetrzeć używając wody demi. Mycie akcesoriów używanych w hodowli - pojemniki do rozmnażania - siatki do przeławiania ryb - osprzęt do hodowli wrotków oraz artemii Wszelkie elementy używane w hodowli a wykonane z materiałów zdatnych do autoklawowania sterylizuje się w temp 120 stopni Celsjusza przez 15 minut. Rozmnażanie danio w warunkach laboratoryjnych Przed nastawieniem ryb do tarła należy rozdzielić samce od samic do oddzielnych akwariów Tarło prowadzi się w systemie: Tarła indywidualne (jedna samica, jeden samiec) Tarła zbiorowe (jeżeli to możliwe z przewagą liczebną samców) Należy pamiętać o tym, że oprócz tareł planowych, w grupach mieszanych dochodzi do spontanicznego rozrodu. Do przeprowadzenia tarła planowego konieczne są pojemniki wyposażone w ruszty i siatki, które zapewniają zabezpieczenie ikry przed zjadaniem przez tarlaki. Ryby przeławia się do pojemników tarliskowych w godzinach popołudniowych. Do tarła dochodzi następnego dnia, w godzinach porannych, po zapaleniu się światła lub po wyciągnięciu przegrody. Po kilku minutach do godziny, ryby przystępują do tarła. Pozyskaną ikrę zbiera się na sitku, przepłukuje się roztworem E3 i sortuje.\ 27

29 RECEPTURY Roztwór E3 Mieszaninę soli 17,4g NaCl + 0,8g KCl + 2,9g (CaCl2 x 2H2O) + 4,89 (MgCl2 x 6H2O)= sól sól + woda demi = 1 litr roztworu = 60x koncentrat Przy użyciu NaOH doprowadzamy do uzyskania w roztworze 7,2 ph Sterylizujemy i utrzymujemy w temp 4 stopni 16,5 ml koncentratu (60x) rozcieńczamy w 1 litrze wody demineralizowaną i trzymamy w temp. pokojowej. Podchloryn Sodu 360 µl NaOCl (podchloryn sodu) na 1 litr wody systemowej lub roztworu E3 (ikra do wysyłki) Pojemniki do rozmnażania ryb. 28

30 Ikrę umieszcza się na szalce Petriego w roztworze E3 (max 50 szt. na szalce). Ilość E3 ma wypełniać 2/3 wysokości szalki. Szalki wkładane są do inkubatora (temp. 28,5 stopnia). Dobrą praktyką jest sortowanie ikry (usunięcie niezapłodnionych ziaren i nieprawidłowo rozwijających się embrionów) po kilku godzinach inkubacji. Po godzin po zapłodnieniu (przed pojawieniem się pigmentu) szalki z ikrą wyjmuje się z inkubatora, usuwa się zanieczyszczenia i odkaża roztworem podchlorynu sodu - na drobnym sitku umieszcza ikrę i moczy 5 minut w roztworze podchlorynu sodu, następnie 5 minut w jałowym roztworze E3, kolejne 5 minut w roztworze podchlorynu sodu oraz 5 minut w jałowym roztworze roztworze E3. Po odkażeniu ikrę z powrotem umieszcza się na szalkach Petriego w roztworze E3 i dalej inkubuje w temp 28,5 stopnia. Należy pamiętać, że wyniku odkażania związkami chloru, osłona jajowa znacznie twardnieje co w większości przypadków wymaga mechanicznego lub enzymatycznego wspomagania przy wylęgu. Łączny czas inkubacji ikry wynosi 4-5 dni od momentu zapłodnienia. Przed przeniesieniem ryb do systemu hodowlanego, po wyjęciu z inkubatora, do szalki Petriego z larwami danio dodaje się niewielką ilość wody systemowej adaptacja do nowych warunków środowiskowych. Cała zawartość szalki Petriego przenoszona jest do pojemnika z niewielką ilością wody systemowej (2-3 cm głębokości) bez włączonego przepływu. W takich warunkach narybek utrzymywany jest do 7 dnia po zapłodnieniu. W tym czasie hodowla karmiona jest wyłącznie wrotkami a po 7 dniu włączany jest minimalny przepływ wody systemowej i wprowadza się karmienie karmę suchą o granulacji 75. Żywienie ryb danio Najczęściej ryby karmi się 2 5 razy dziennie, w zależności od wieku i wielkości ryb, takimi porcjami pokarmu, które są szybko zjadane i nie zalegają w zbiornikach, gdyż rozkładający się pokarm nadmiernie obciąża system i prowadzi do wzrostu stężenia toksycznych związków azotowych oraz wzrostu zapotrzebowania na tlen. W trakcie karmienia ważna jest obserwacja ryb i dopasowanie porcji w zależności od potrzeb, które mogą się zmieniać się pod wpływem wielu czynników, np. - pory dnia, - spontanicznego tarła, 29

31 - aktywności ruchowej personelu. - zmian parametrów wody lub pojawienia się w niej substancji niepożądanych Karmienie stanowi też dobry moment do oceny stanu zdrowia hodowanych ryb - wszelkie nieprawidłowości w zachowaniu lub wyglądzie są sygnałem do rozpoczęcia postępowania mającego na celu wykrycie i eliminację potencjalnych zagrożeń. Gotowe pokarmy zapewniają: - zbilansowaną dietę właściwą dla potrzeb żywieniowych danego gatunku, - skład i średnicę granulek dostosowane do danej grupy wiekowej hodowanych ryb, (granulaty o trzech gramaturach, Gemma 75, Gemma 150, Gemma 300) - czystość mikrobiologiczną eliminującą ryzyko transmisji zakażeń przez karmę. W karmieniu wykorzystujemy też spirulinę i żywy pokarm (wrotki i wylęg artemii) Hodowlę żywego pokarmu prowadzimy zgodnie z poniższą procedurą Procedura nr 3 Hodowla wrotków Prowadzi się 2 hodowle wrotek w dwóch pojemnikach 6 L. Pierwsza hodowla odnawiana jest w poniedziałek a druga w czwartek. Przy odnawianiu hodowli zbiera się również wrotki do karmienia narybku. Przygotowanie roztworu dla wrotków: 5g soli na litr wody systemowej Odnawianie hodowli: Raz w tygodniu przed odnawianiem hodowli przelewa się część wrotków do butelki, przechowywanej w lodówce. Wyłączenie napowietrzania, oczyszczanie kamienia i przewodu. 1/3 hodowli należy przecedzić na filtrze (np. do kawy) umieszczonym w lejku, co pewien czas płukać filtr we wcześniej przygotowanym, czystym roztworze soli w 6l pojemniku. 30

32 Następnie karmimy wrotki 1,5 2,0 ml glonów i uruchamiamy napowietrzanie. Przygotowanie wrotków do skarmienia: Należy przygotować niewielkie naczynie z małą ilością wody systemowej. Część przeznaczoną do skarmiania (2/3 z hodowli) cedzi się na filtrze, który co pewien czas powinien być przepłukiwany w przygotowanym naczyniu z wodą systemową. Po zakończeniu tej procedury wrotki dokarmia się małą porcją glonów (napowietrzanie nie jest konieczne) Wrotki z hodowli karmione są 2 razy dziennie w dni powszednie o 7:30 i 15:30 porcją 1,5-2,0 ml (cała pipeta) a w weekendy 1 raz dziennie. Wrotki do skarmiania karmione są 2 razy dziennie 30 min przed karmieniem narybku (7.30 i 13.30). Procedura nr 4 Hodowla artemii Hodowle artemii prowadzi się w specjalnym zbiorniku z wodą demii, wzbogaconą solą morską w proporcji: na 5 litrów wody 7 łyżeczek soli (.gr). Wodę podgrzewa się do 28 0 C i włącza napowietrzenie. Zbiornik z przygotowaną wodą zasypuje się jajami artemii w ilości zależnej od potrzeb hodowli. Po 24 godzinach wylęgu artemia jest gotowa do skarmiania ryb. Hodowlę artemii za każdym razem odtwarza się od początku. 31

33 Hodowla żywego pokarmu: artemia (po lewej) i wrotki (po prawej). 32

34 Znieczulenie i uśmiercanie Wszystkie działania laboratoryjne, których obiektem są organizmy żywe muszą być wykonywane z uwzględnieniem minimalizacji stresu i bólu. Obecnie najczęściej stosowanym preparatem w anestezji i eutanazji ryb jest MS-222 (TMS) (Tricaine Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98% ) Metylosulfonian trikainy W celu znieczulenia lub uśmiercenia wybranych ryb odławiamy je i umieszczamy w pojemniku wypełnionym wodą systemową o ustalonej objętości co ułatwia dawkowani roztworu roboczego używanego do anestezji lub eutanazji. Najczęściej stosowanym jest roztwór roboczy przygotowywany wg. następującej receptury: 400 mg trikainy (forma proszku) 97,9 ml wody RO (demineralizowanej) około 2,1 ml 1 M TRIS do uzyskania ph około 7 (wg. ZFIN- TRICAINE PROTOCOL) Dawka praktyczna przy znieczulaniu to 4,2 ml roztworu roboczego na 100 ml wody. Należy jednak uwzględniać zmienność reakcji osobniczych.duży wpływ na przebieg znieczulenia ma wiek ryb jak również linia z jakiej ryby pochodzą. Paradoksalnie ryby młodsze i narybek są bardziej oporne na działanie tego środka. Właściwa obserwacja znieczulanych ryb i doświadczenie w ocenie stopnia znieczulenia są gwarantami poprawnego przebiegu tego procesu i minimalizuje upadki w wyniku przedawkowania. Bezwzględnie należy pamiętać o wysokiej toksyczności produktów rozkładu trikainy. Dlatego roztwory najlepiej jest przyrządzać tuż przed użyciem. Jeśli roztwór roboczy ma być przechowywany to tylko w ciemnym opakowaniu i w niskiej temperaturze. Kontrola anestezji to również ocena skutków zastosowania trikainy (np. obrzęk skrzeli i możliwość krwawień z tego narządu). Nadal prowadzone są prace mające na celu udoskonalenie znieczulania dorosłych danio pręgowanych np. z użyciem propofolu z lidokainą, izofluranu, butarfanolu i medetomidyny czy innych substancji stosowanych w weterynarii i medycynie. Istotą powodzenia jest zwiększeni wchłaniania stosowanych preparatów przez skrzela i skórę. Pierwszymi objawami działania znieczulenia jest spowolnienie ruchów, zwolnienie oddychania, spowolnienie akcji serca. Następnie ryby przestają pływać ale nadal reagują na 33

35 próbę dotykową. Kolejny etap to bezruch ze spowolnionym jeszcze bardziej oddychaniem i zanik reakcji na próbę dotykową. Uśmiercanie Jest to zabieg, który musi być przeprowadzony szybko i przy użyciu wysokich dawek trikainy. Stosuje się od mg /litr wody w celu szybkiego efektu wywołania śmierci ryb. W ten sposób zmniejsza się czas trwania pobudzenia, często towarzyszący zastosowaniu tego związku. W wielu ośrodkach w Europie i USA stosuje się również eutanazję przez schłodzenie ryb w kąpieli lodowej (trzy części lodu i jedna część wody) a następnie w celu potwierdzenia śmierci umieszczenie w zamrażarce. Metoda ta zmniejsza również ilość stosowanej trikainy, która jest stosunkowo droga. Martwe ryby należy umieścić np. w woreczkach strunowych, które składujemy w zamrażalce (oznakowanej KAT.1) znajdującej się w pomieszczeniu na odpady medyczne. Import i eksport Najczęściej sprowadzana i wysyłana jest zapłodniona ikra poszczególnych linii, dedykowanych określonym rodzajom badań. Rzadziej sprowadza się dorosłe ryby. Materiał hodowlany jest wymieniany między placówkami naukowo-badawczymi, rzadziej pozyskiwany z licencjonowanych hodowli komercyjnych. W przypadku importu z krajów trzecich (pozaunijnych) wymagane jest urzędowe unijne świadectwo zdrowia (w języku angielskim i w języku kraju odbiorcy) a przesyłka musi być zgłoszona na przejściu granicznym, którym materiał zostanie wpuszczony na teren UE. Wcześniej musimy uzyskać zgodę Głównego Lekarza Weterynarii na import zapłodnionej ikry lub dorosłych ryb. O fakcie sprowadzenia (wysłania) jednostka informuje Powiatowego Lekarza Weterynarii sprawującego nadzór nad terenem, na którym znajduje się placówka. W przypadku przemieszczania ikry i ryb w obrębie UE, przesyłka jest zaopatrzona w dokumenty potwierdzające pochodzenie materiału oraz aktualne wyniki badań w kierunku chorób typowych dla danio utrzymywanych w laboratoriach. W tym przypadku również informujemy Powiatowego Lekarza Weterynarii o sprowadzeniu lub wysłaniu ikry lub ryb. W przypadku ryb dorosłych wymagane jest zgłoszenie do systemu TRACES. 34

36 W przypadku przemieszczania zwierząt GMO bezwzględnie wymagana jest zgoda Ministerstwa Środowiska. Wszelkie niedopatrzenia w przestrzeganiu przytoczonego postępowania mogą narazić ośrodek na konsekwencje prawne i udaremnić wykonanie sprowadzenia lub wysyłki. Nowo przyjęte ryby muszą trafić do kwarantanny i być stopniowo przyzwyczajane do nowych warunków środowiskowych, także optymalnie żywione (unikanie obfitego karmienia w pierwszych 12 godzinach po przesyłce w przypadku ryb dorosłych). Ikra, która była odkażana może wymagać pomocy w wykluwaniu. Dalsze postępowanie z wyklutymi larwami i narybkiem jest takie samo jak w przypadku własnej hodowli, z ta różnicą, że odbywa się w obrębie kwarantanny. Przy wysyłaniu ryb do innego ośrodka, pakuje się ryby w akwarystyczne torebki plastikowe lub butelki: - dla ryb dorosłych - torebki plastikowe bez rogów ( 5 ryby / 1 litr) - dla ikry - butelki plastikowe Musimy zapewnić proporcje wody do powietrza w stosunku 1:3, opakowanie termiczne np. wkłady grzewcze w zimie, odpowiednie oznaczenie. Na 12 godzin przed i po transporcie nie karmimy ryb. Transport może być realizowany przez firmę z uprawnieniami do przewozu zwierząt. 35

37 Choroby danio w warunkach hodowli laboratoryjnej. Utrzymanie zdrowej populacji w akwakulturze laboratoryjnej jest jednym z podstawowych warunków uzyskania poprawnych wyników badań prowadzonych przy wykorzystaniu tego modelu. Danio jest wrażliwe na większość patogenów występujących w praktyce akwarystycznej. Jednak w warunkach laboratoryjnych,wymagania dotyczące zdrowia ryb są znacznie wyższe niż w hodowli amatorskiej. Choroby wirusowe obecnie nie stanowią kluczowego zagrożenia dla utrzymywanej populacji w laboratoriach na całym świecie. Pamiętać jednak należy, że ryba ta jest wrażliwa na większość wirusów występujących u ryb karpiowatych (Cyprinidae). Przedostanie się tych wirusów do hodowli laboratoryjne, może przynieść nieprzewidywalne skutki. W badaniach okresowych uwzględnia się wirus ISKNV (Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus) należący do rodziny Iridoviridae (Megalocytivirus). Choroby bakteryjne, podobnie jak w przypadku innych ryb stanowią dużą część zachorowań.z najważniejszych patogenów należy wymienić: Mycobacterium spp., Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Edwardsiella ictaluri, Proteus spp., Vibrio spp. Flexibacter spp. i inne. Szczególne znaczenie mają mykobakteriozy. W hodowlach laboratoryjnych danio pręgowanego w materiałe pochodzącym z ryb jak również osadów najczęściej wykrywa się: M.marinum, M.chelonae, M.fortuitum, M.abscessus, M.pillulare, M.haemophilum. Objawy w chorobach bakteryjnych nie zawsze muszą być typowe. Najczęściej stwierdzane są : przekrwienia i wybroczyny na skórze i płetwach, owrzodzenia, rozdęcie powłok brzusznych z nastroszeniem łusek, martwica płetw i wiele innych. Mykobakteriozy występujące u danio mogą doprowadzić do zachorowań u ludzi (zoonoza). Objawy kliniczne to zmiany dermatologiczne, wymagające długiego i specjalistycznego leczenia. Również bytujące w akwakulturze Pseudomonas spp. i Vibrio spp. mogą być przyczyną zachorowań personelu i użytkowników. Wśród licznych chorób stwierdzanych u tego gatunku (oodinoza, ichthyoftiriaza, kostioza, inwazje przywr Gyrodactlus spp. i Dactylogyrus spp.,choroby grzybicze wywołane przez Saprolegnia spp., Achlya spp., Branchiomyces spp.) szczególne zagrożenie niesie Pseudoloma neurophilia, przedstawiciel Microsporidia, atakująca centralny układ nerwowy, dając całą gamę objawów neurologicznych. Innym patogenem, często stwierdzanym w akwakulturach jest nicień jelitowy Pseudocapillaria tomentosa, wywołujący przewlekłe 36

38 stany zapalne błony śluzowej jelit ze wszystkimi te skutkami (osłabienie,upadki a nawet promocja nowotworów). W hodowli laboratoryjnej stwierdza się dużą ilość różnorakich wad rozwojowych, nowotwory (seminoma, melanoma, carcinoma i inne), nefrokalcinoze, megalocytoze wątroby, kardiomiopatie, EAI (Egg Associated Inflamation). Stworzony w OMD program ochrony zdrowia Danio pręgowanego, pozwala na kontrolowanie stanu zdrowia tych ciekawych zwierząt laboratoryjnych.. 37

39 Piśmiennictwo