Angiogeneza jako nowy czynnik rokowniczy u chorych. ych na raka krtani

Transkrypt

1 Gryczyñski M., Pietruszewska W.: Angiogeneza jako nowy czynnik rokowniczy u chorych na raka krtaniotorynolaryngologia, 2002, 1(1), CHOROBY Y JAMY USTNEJ, GARD A A I KRTANI ANI Otorynolaryngologia, 2002, 1(1), Angiogeneza jako nowy czynnik rokowniczy u chorych ych na raka krtani Angiogenesis as a prognostic factor in patients with laryngeal cancer MACIEJ GRYCZYÑSKI, WIOLETTA PIETRUSZEWSKA Katedra Otolaryngologii i Klinika Laryngologii Akademii Medycznej w odzi, ul. Kopciñskiego 22, ódÿ Mimo ci¹g³ego udoskonalania metod leczniczych w postêpowaniu u chorych na raka krtani, wskaÿniki wyleczalnoœci poprawiaj¹ siê nieznacznie. Uznane kliniczne i histologiczne czynniki prognostyczne nie s¹ wystarczaj¹ce w ustaleniu rokowania u indywidualnego chorego. Koniecznym staje siê wiêc poszukiwanie kolejnych, niezale nych wskaÿników rokowniczych. Badania ostatnich lat wskazuj¹ na prognostyczne znaczenie oceny angiogenezy. Jest to wieloetapowy proces prowadz¹cy do powstania nowego naczynia, obecny zarówno w warunkach fizjologicznych (gojenie siê ran), jak i patologicznych (zapalenia, nowotwory). Wzrost i powstawanie przerzutów litych nowotworów z³oœliwych s¹ zale ne od wytworzenia nowej sieci naczyñ krwionoœnych, a wzmo on¹ intensywnoœæ angiogenezy obserwowano w wielu nowotworach. Ocenê nasilenia angiogenezy uznaje siê za niezale ny czynnik rokowniczy w niektórych guzach litych (rak sutka, prostaty, p³uca oraz nowotwory g³owy i szyi). W pracy przedstawiono metody oceny angiogenezy ze zwróceniem szczególnej uwagi na przeciwcia³a wykorzystywane w technikach immunohistochemicznych. W oparciu o w³asne doœwiadczenie omówiono zastosowanie oceny neowaskularyzacji jako nowego czynnika prognostycznego w raku krtani oraz potencjalne mo liwoœci wykorzystania terapii antyangiogennej u chorych na lite nowotwory z³oœliwe. Otorynolaryngologia, 2002, 1(1), S³owa kluczowe: rak krtani, angiogeneza, czynnik rokowniczy, FVM, CD34 Despite continuous progress in surgical techniques used in the treatment of the patients with laryngeal cancer, survival rate hardly improves. The recognised clinical and pathological prognostic factors are not satisfactory in prognosis in individual patient. There is a need for searching of new, independent prognostic factors. The researches of recent years are focussed on prognostic value of angiogenesis. It is a multistage process which leads to the formation of new vessels and is present in physiological (wound healing), as well as in pathological processes (inflammation and neoplasms). The growth of solid tumours and the process of metastasis are dependent on the formation of new blood vessels and the intensity of angiogenesis has been shown to be increased in various human tumours. The evaluation of angiogenesis has been proposed to be an independent prognostic marker of some solid tumours (breast cancer, prostate cancer, lung cancer, head and neck neoplasms). The authors present methods of angiogenesis assessment with special focus on antibodies used for immunohistochemical techniques. Based on the literature review and own research the authors assess the possibility of using neovascularisation as a new prognostic factor in laryngeal cancer patients and the perspectives of antiangiogenic therapy in solid tumours. Otorynolaryngologia, 2002, 1(1), Key words: laryngeal cancer, angiogenesis, prognostic factor, FVM, CD34 Wybrane dane epidemiologiczne i etiologiczne w raku krtani W ostatnich latach stwierdzono istotne zwiêkszenie wspó³czynników chorobowoœci i umieralnoœci z powodu nowotworów z³oœliwych dróg oddechowych u mê czyzn. Polska, obok Hiszpanii, W³och i Francji, nale y do krajów najwiêkszego ryzyka raka krtani w Europie. Rak krtani stanowi ok. 4,8% wszystkich zarejestrowanych zachorowañ na nowotwory wœród mê czyzn (12,6/ ) i odpowiedzialny jest za ok. 3,6% zgonów (standaryzowany wspó³czynnik umieralnoœci 7,48/ ). Natomiast u kobiet wynosi on odpowiednio 0,4% nowotworów (0,42/ ) i 0,5 zgonów (0,53/ ) [1,2]. Zarówno zapadalnoœæ, jak i umieralnoœæ na raka krtani jest wiêc oko³o krotnie wiêksza w populacji mê czyzn ni kobiet [3,4]. Najwiêksz¹ zachorowalnoœæ na ten nowotwór stwierdza siê w przedziale wieku od 50 do 60 lat u mê czyzn i powy ej 70 roku ycia u kobiet. W Polsce umieralnoœæ z powodu raka krtani u mê czyzn zwiêkszy³a siê w znaczny sposób od po³owy lat 60. (3,3/ ) do po³owy lat 80. (6,4/ ). W ostatnim dziesiêcioleciu wzrost ten jest wolniejszy, lecz wspó- ³czynniki chorobowoœci i umieralnoœci nadal utrzymuj¹ siê na wysokim poziomie. W populacji kobiet od po³owy lat 60. wspó³czynniki umieralnoœci stale s¹ na niskim poziomie [1,2]. We wszystkich grupach wiekowych wystêpuj¹ tendencje do wzrostu wspó³czynników umieralnoœci [2,3,5]. Najczêstszym, pierwotnym umiejscowieniem nowotworu krtani jest nadg³oœnia [4,5]. Czynniki ryzyka Notowane w Polsce zwiêkszenie liczby zgonów z powodu nowotworów mo e wynikaæ m.in. ze wzrostu czynników rakotwórczych w œrodowisku oraz zachowañ sprzyjaj¹cych rozwojowi tych chorób [2]. W znacznym stopniu

2 14 Otorynolaryngologia, 2002, 1(1), spowodowane jest to zwiêkszonym zagro eniem nowotworami tytoniozale nymi (guzy z³oœliwe wargi, jamy ustnej i gard³a, krtani, prze³yku, p³uca, pêcherza moczowego, trzustki oraz nerki). Badania epidemiologiczne jednoznacznie wskazuj¹, e palenie tytoniu i spo ywanie alkoholu s¹ podstawowymi czynnikami ryzyka wystêpowania raka krtani [4,6]. Wi¹ e siê to z ekspozycj¹ na substancje chemiczne o w³aœciwoœciach mutagennych i karcynogennych, do których nale ¹ przede wszystkim policykliczne wêglowodory aromatyczne (benzo[a]piren), aminy aromatyczne i N-nitrozaminy. Ryzyko zachorowania na nowotwór z³oœliwy krtani wzrasta wraz z liczb¹ wypalanych dziennie papierosów i jest wiêksze u wczeœnie rozpoczynaj¹cych palenie [4]. Dane epidemiologiczne wskazuj¹ na zwi¹zek miêdzy wystêpowaniem raka krtani a nadmiernym spo ywaniem alkoholu, jednak e mechanizmy jego dzia³ania nie s¹ do koñca poznane. Etanol mo e dzia³aæ jako kokarcynogen i promotor procesu nowotworowego. Przewlekle spo ywany m.in. zmniejsza wch³anianie sk³adników od ywczych, doprowadza do upoœledzenia czynnoœci w¹troby, wp³ywa na obni enie wydolnoœci uk³adu immunologicznego, przez co hamuje procesy unieczynniania zwi¹zków karcynogennych [6]. Podkreœla siê wspó³dzia³anie tytoniu i alkoholu w inicjowaniu raka krtani w okolicy nadg³oœniowej, tj. regionu bezpoœrednio granicz¹cego z gard³em i najbardziej nara- onego na dzia³anie powy szych czynników [7]. Palenie ponad 20 papierosów dziennie i picie wysokoprocentowego alkoholu przez ponad 15 lat zwiêksza ryzyko zachorowania na nowotwór krtani oko³o 330 razy [4]. Udzia³ w patogenezie raka krtani przypisuje siê równie takim czynnikom, jak: zaka enie wirusowe HSV, HPV i HIV, immunosupresja, przewlek³e choroby zakaÿne, stany niedoboru elaza, witamin A i C, ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe i ryzyko zwi¹zane z wykonywaniem niektórych zawodów (m.in. nara enie na kontakt z azbestem, niklem, kauczukiem i gum¹). Jednak ich rola w inicjowaniu procesu chorobowego w krtani pozostaje nadal niejasna [3,4,7]. Z drugiej strony wskazuje siê na ochronny efekt dzia³ania witaminy A i C w nowotworach z³oœliwych. Czynniki rokownicze Poznanie czynników rokowniczych choroby nowotworowej u³atwia wybór metody leczenia i prowadzi do wyd³u enia czasu prze ycia dziêki mo liwoœci zastosowania odpowiedniego postêpowania uzupe³niaj¹cego. Dotychczas wykazano, e najbardziej wiarygodna w prognozowaniu wyst¹pienia przerzutów, wznowy i czasu prze ycia jest ocena stopnia zaawansowania nowotworu wg klasyfikacji TNM i oparty na niej jednolity podzia³ zaawansowania klinicznego raka krtani [8]. Pierwszym etapem oceny stopnia zaawansowania choroby jest okreœlenie stanu klinicznego (clinical staging ctnm), który jest najlepszym przedoperacyjnym wskaÿnikiem rozleg³oœci procesu nowotworowego i na tej podstawie, przy uwzglêdnieniu typu histologicznego, podejmowane s¹ decyzje lecznicze. W przypadkach operacyjnych, usuniêty nowotwór z wêz³ami ch³onnymi s³u y do patomorfologicznej diagnostyki makroskopowej i mikroskopowej (pathomorphological staging ptnm), która, bêd¹c bezpoœredni¹ ocen¹ rozleg³oœci raka, przewy sza czu³oœci¹ ocenê kliniczn¹ i z tego wzglêdu jej wartoœæ prognostyczna jest du o wiêksza. Kolejnym wskaÿnikiem rokowniczym jest stopieñ zró nicowania histologicznego raka krtani, czyli tzw. grading. Czynnik ten zosta³ uznany za wskaÿnik o du- ym znaczeniu rokowniczym [9,10]. Stosowana obecnie klasyfikacja Œwiatowej Organizacji Zdrowia, w zale noœci od nasilenia cech guza, wyró nia 3 stopnie histopatolo- 2 Ryc. 1. Obraz mikroskopowy wysokodojrza³ego raka p³askonab³onkowego krtani o ³awicowym typie wzrostu z du ymi obszarami rogowacenia (1) i umiarkowanym naciekiem zapalnym (2) (HE, powiêkszenie 40x) 1 Ryc.2. Obraz mikroskopowy raka p³askonab³onkowego o niskim stopniu zró - nicowania histologicznego (polimorfizm komórek i j¹der, nieprawid³owe figury podzia³u) (HE, powiêkszenie 200x)

3 Gryczyñski M., Pietruszewska W.: Angiogeneza jako nowy czynnik rokowniczy u chorych na raka krtani 15 gicznego zaawansowania nowotworu (G1, G2, G3) uwzglêdniaj¹ce stopieñ rogowacenia, pleomorfizm komórek i j¹der, liczbê figur podzia³u w polu widzenia oraz obecnoœæ komórek wieloj¹drowych (ryc. 1, 2) [9,11]. Podzia³ jedynie na 3 stopnie sprawia, e wiêkszoœæ rozpoznañ histopatologicznych w raku krtani to stopieñ drugi (G2). Dlatego znaczenie gradingu w ocenie rokowania u poszczególnych chorych na raka krtani pozostaje nadal dyskusyjne. Na podstawie badañ w³asnych dotycz¹cych prognozowania u chorych na raka krtani wydaje siê, e ocena morfologicznych i biologicznych cech nowotworu na podstawie tylko stopnia zró nicowania histologicznego nowotworu jest niewystarczaj¹ca. W ocenie prze ywalnoœci w grupie 151 chorych nie stwierdzono bowiem adnych istotnych zale noœci miêdzy kolejnymi stopniami zró nicowania histologicznego nowotworu a ca³kowitym i wolnym od wznowy czasem prze- ycia tych chorych (p>0,05) (praca w druku). Pewien postêp wnios³a zaproponowana w 1987 r. przez Annerotha, Batsakisa i Luny i oparta na danych Jacobssona nowa klasyfikacja uwzglêdniaj¹ca zarówno wybrane cechy histologiczne guza (architektonika, stopieñ zró nicowania, polimorfizm j¹der, figury podzia³u), jak i rodzaj reakcji guz tkanki otaczaj¹ce (sposób i stadium naciekania, obecnoœæ nacieku limfatycznego, komórek wrzecionowatych lub inwazji naczyñ) [12-15]. Ka d¹ z cech oceniano w skali od 1 do 4 punktów, a chorych podzielono na grupy o wartoœciach punktacji mniejszych i wiêkszych od 10. W badaniach w³asnych stwierdzono statystycznie istotn¹ zale noœæ miêdzy sum¹ punktów powy ej 10 wg tej klasyfikacji a du ym zaawansowaniem nowotworu w krtani (T3 i T4), obecnoœci¹ przerzutów w wêz³ach ch³onnych szyi i krótszym czasem prze ycia chorych (p<0,05). Nie zaobserwowano natomiast zale noœci miêdzy liczb¹ punktów uzyskanych wg ocenianej klasyfikacji a wystêpowaniem wznów procesu nowotworowego (p>0,05) (praca w druku). Umiejscowienie zmian w poszczególnych okolicach anatomicznych krtani, zgodnie z zaleceniami Œwiatowej Organizacji Zdrowia z 1990 roku (ICD-O International Classification of Diseases for Oncology), to kolejny czynnik u³atwiaj¹cy rokowanie, zw³aszcza w aspekcie przerzutów do wêz³ów ch³onnych i wznów procesu nowotworowego. Najczêœciej stwierdza siê przerzuty do wêz³ów ch³onnych szyi u chorych z nag³oœniow¹ lokalizacj¹ guza pierwotnego. Nowotwory umiejscowione w obrêbie g³oœni, z uwagi na bardzo ubog¹ sieæ naczyñ ch³onnych w tej okolicy, stosunkowo póÿno powoduj¹ powstawanie przerzutów. D³ugi okres bezobjawowego wzrostu guza w okolicy podg³oœniowej powoduje, e zazwyczaj stwierdza siê istnienie procesu nowotworowego póÿno, tj. na etapie powsta³ych przerzutów do wêz³ów ch³onnych szyi. Ocena molekularna Mimo ci¹g³ego udoskonalania metod leczniczych w postêpowaniu u chorych na raka krtani, wskaÿniki wyleczalnoœci poprawiaj¹ siê nieznacznie. Uznane kliniczne i histologiczne czynniki prognostyczne nie s¹ bowiem wystarczaj¹ce w ustaleniu rokowania u indywidualnego chorego. Niejednokrotnie bowiem stwierdza siê ró ny przebieg kliniczny choroby nowotworowej u chorych z tym samym stopniem klinicznego zaawansowania guza, stopniem zró nicowania histologicznego i o tym samym umiejscowieniu. Zmusi³o to badaczy do poszukiwania kolejnych czynników prognostycznych. Badania ostatnich lat podnosz¹ rokownicze znaczenie oceny biologii nowotworów. Niepohamowany wzrost zwi¹zany z du ¹ niestabilnoœci¹ genetyczn¹, utrata zdolnoœci do ró nicowania i nabycie zdolnoœci do naciekania (inwazji) oraz zajmowania obszarów zasiedlonych w warunkach prawid³owych przez inne komórki (przerzut) to cechy komórek, które naby³y fenotyp nowotworowy. Szereg zmian koniecznych, aby powsta³ nowotwór spowodowanych jest uaktywnieniem lub unieczynnieniem wielu genów. Podstawowe zmiany to brak reakcji na czynniki wyzwalaj¹ce apoptozê, brak zapotrzebowania oraz niewra liwoœæ na czynniki wzrostowe pochodz¹ce z otaczaj¹cego œrodowiska, a tak e nieograniczona zdolnoœæ do replikacji. Dwie pozosta³e cechy, szczególnie istotne w z³oœliwych nowotworach litych, to zdolnoœæ do inicjowania angiogenezy oraz inwazji tkanek i powstawania przerzutów. Maj¹c na uwadze powy sze przes³anki, w ostatnim dziesiêcioleciu w ocenie wartoœci poznawczych i praktycznych zyska³y znaczenie badania biologii nowotworów krtani. Obejmuj¹ one zarówno metody molekularne (ocena sekwencji nukleotydów cz¹steczki DNA i RNA), cytogenetyczne (ocena morfologii chromosomów) jak i immunohistochemiczne (rozpoznawanie determinant antygenowych zwi¹zanych z komórk¹ nowotworow¹ za pomoc¹ przeciwcia³ monoklonalnych [16-19]. Powy sze badania dotycz¹ g³ównie pierwotnych uszkodzeñ DNA (przerwy nici, addukty, uszkodzenia oksydacyjne), oceny anomalii struktury i funkcji chromosomów, analizy bia³ek kontroli cyklu komórkowego, mutacji w protoonkogenach i genach supresorowych transformacji nowotworowej i ekspresji ich bia³ek, ploidii DNA, utraty heterozygotycznoœci niektórych genów, oceny czynników wzrostu, receptorów hormonalnych i innych [17-20]. Badania immunohistochemiczne i analiza genetyczna w za³o eniu maj¹ wesprzeæ wysi³ki klinicystów w profilaktyce, diagnozowaniu, leczeniu i prognozowaniu u chorych na raka krtani. Obecnie bada siê ponad 100 czynników prognostycznych odzwierciedlaj¹cych w³aœciwoœci biologiczne, morfologiczne, immunologiczne i biochemiczne raka krtani. Wœród wielu badanych procesów podkreœla siê znaczenie angiogenezy, proliferacji i apoptozy w rokowaniu u chorych na ró ne nowotwory z³oœliwe.

4 16 Otorynolaryngologia, 2002, 1(1), Angiogeneza Ju w 1971 roku Folkman wysun¹³ hipotezê, e wzrost i progresja nowotworów litych s¹ uzale nione od powstawania nowych naczyñ [21]. Dopiero jednak od lat 90. badania dotycz¹ce angiogenezy nowotworowej prowadzone s¹ na du ¹ skalê w wielu oœrodkach. Angiogeneza (neowaskularyzacja, naczyniotworzenie) jest wieloetapowym procesem, który prowadzi do powstania nowych naczyñ krwionoœnych z istniej¹cych naczyñ gospodarza. Towarzyszy ona zarówno zjawiskom fizjologicznym, jak i patologicznym. W warunkach fizjologicznych wystêpuje waskulogeneza, czyli powstawanie naczyñ z angioblastów w czasie embriogenezy, a nastêpnie formowanie nowego ³o a naczyniowego w zwi¹zku z owulacj¹ lub powstawaniem cia³ka ó³tego. W stanach patologicznych neowaskularyzacja wystêpuje w czasie gojenia siê ran, w zapaleniach (m.in. retinopatia cukrzycowa, choroby dzi¹se³, ³uszczyca, egzema, choroby autoimmunologiczne, powstawanie kr¹ enia obocznego po zawale miêœnia sercowego) i w nowotworach. W badaniach doœwiadczalnych udowodniono, e angiogeneza jest procesem niezbêdnym dla wzrostu i powstawania przerzutów litych nowotworów z³oœliwych [22,23]. Rozwój guzów powy ej wielkoœci 2-3 mm 2 (graniczna wielkoœæ, dla której mo liwe jest od ywianie komórek na drodze prostej dyfuzji) jest zale ny od wytworzenia nowej sieci naczyñ i dostarczenia przez nie sk³adników od ywczych, czynników wzrostu i tlenu [21,24,25]. Rozpoczêcie angiogenezy mo e byæ wywo³ane zarówno niedotlenieniem komórek, jak i mutacjami genów supresorowych i onkogenów, prowadz¹cymi do powstania tzw. fenotypu angiogennego, tj. stanu, w którym komórki nowotworowe stale wydzielaj¹ czynniki pobudzaj¹ce angiogenezê [25,26]. W wyniku tych nak³adaj¹cych siê procesów komórki nowotworowe aktywuj¹ swoiste czynniki stymuluj¹ce migracje i podzia³y komórek œródb³onka naczyñ krwionoœnych w najbli szym s¹siedztwie guza, powoduj¹c powstanie sieci naczyñ oplataj¹cych i penetruj¹cych jego masê. W pierwszym etapie dochodzi do degradacji b³ony podstawnej naczynia gospodarza. Stymulacja œródb³onka prowadzi do zwiêkszenia aktywnoœci biochemicznej i proliferacji oraz przemieszczania siê komórek œródb³onkowych poza naczynie przez powsta³e liczne przerwy w po³¹czeniach miêdzykomórkowych œródb³onka. Nowe pasma komórek œródb³onkowych ³¹cz¹ siê z pêtl¹ istniej¹cego naczynia, a nastêpnie dochodzi do wytworzenia œwiat³a nowego naczynia, nowej b³ony podstawnej i rekrutacji perycytów (komórek zlokalizowanych na zewnêtrznej stronie naczynia, odpowiedzialnych m.in. za hamowanie proliferacji œródb³onka). W tym z³o onym procesie wzajemnie oddzia³ywaj¹ komórki nowotworowe, komórki œródb³onka i podœcieliska, co prowadzi do powstania nowego mikroœrodowiska, bardziej korzystnego dla nowotworu, które u³atwia migracjê komórek nowotworowych do naczyñ, umo liwiaj¹c tym samym powstawanie przerzutów. Jednak e, aby uzyskaæ pe³ny fenotyp angiogenny, niezbêdne jest dodatkowe zahamowanie przez komórki nowotworowe czynników blokuj¹cych angiogenezê. W przypadku neowaskularyzacji nowotworowej równowaga pomiêdzy stymulacj¹ a hamowaniem jest przesuniêta w kierunku pobudzenia angiogenezy. Czynnikami aktywuj¹cymi s¹ cytokiny, enzymy i czynniki wzrostu wydzielane zarówno przez komórki nowotworowe, jak i komórki bêd¹ce w bezpoœrednim s¹siedztwie pobudzonego naczynia (fibroblasty, komórki tuczne, granulocyty, makrofagi i limfocyty). W otoczeniu komórek nowotworowych istnieje przewaga czynników pobudzaj¹cych angiogenezê, takich jak: afgf i bfgf (acidic and basic fibroblast growth factor kwaœny i zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów), VEGF (vascular endothelial growth factor naczyniowo-œródb³onkowy czynnik wzrostu), TGF (transforming growth factor transformuj¹cy czynnik wzrostu), PDGF (platelet derived growth factor p³ytkopochodny czynnik wzrostu), angiogenina, interleukina 8, pleotropina, prostaglandyna E1 i E2, proliferyna i inne [27,28]. Ma³e stê enia endogennych inhibitorów angiogenezy (m.in. czynnika p³ytkowego 4, trombospondyny, tkankowych inhibitorów metaloproteinaz, angiostatyny, prolaktyny, interferonu α, β, γ i innych) równie sprzyjaj¹ pobudzeniu procesu angiogenezy. Skutkiem przewagi stymulatorów neowaskularyzacji i ci¹g³ej aktywacji tego procesu jest wytworzenie mniej dojrza³ych naczyñ krwionoœnych, co powoduje, e komórki nowotworu ³atwiej dostaj¹ siê do kr¹ enia, u³atwiaj¹c powstawanie przerzutów [29]. Naczynia te cechuje brak perycytów, odmienny sk³ad macierzy zewn¹trzkomórkowej wiêksza zawartoœæ kwasu hialuronowego a mniejsza usiarczanowanych proteoglikanów, wiêksza przepuszczalnoœæ b³ony podstawnej, brak unerwienia oraz inny kszta³t naczynia nowopowsta³e s¹ poszerzone, krête, rozga³êzione i maj¹ liczne po³¹czenia têtniczo- ylne. Metody oceny angiogenezy Intensywnoœæ neowaskularyzacji guzów ocenia siê stosuj¹c ró ne metody: radiologiczne, ultrasonograficzne, dopplerowskie oraz rezonansu magnetycznego [30,31]. Unaczynienie nowotworów bada siê równie pod mikroskopem, oznaczaj¹c gêstoœæ mikronaczyñ (naczyñ o œrednicy mniejszej ni 100 m) po zastosowaniu ró - nych metod (srebrzenie, pas, barwienie w³ókien sprê ystych metod¹ van Giesona). Celem wybiórczego uwidocznienia naczyñ w badaniach immunohistochemicznych znakuje siê komórki œródb³onka lub elementy b³ony podstawnej naczynia w³osowatego. Na powierzchni œródb³onka naczyniowego istnieje szereg antygenów, które w wyniku reakcji ze swoistymi przeciwcia³ami monoklonalnymi i chromogenem tworz¹ kompleksy uk³adaj¹ce siê wzd³u naczynia. W badaniach na skrawkach parafino-

5 Gryczyñski M., Pietruszewska W.: Angiogeneza jako nowy czynnik rokowniczy u chorych na raka krtani 17 wych przydatne s¹ przeciwcia³a skierowane przeciwko antygenom œródb³onka: FVIII (czynnik von Willebranda), CD31, CD34, Ulex I. Do barwieñ wy³¹cznie w skrawkach mro onych s³u ¹ przeciwcia³a: CD38, PAL-E, EN4, BMA 120 [32]. Dla oceny angiogenezy istotne jest uwidocznienie nowopowsta³ych naczyñ. Dotychczasowe doniesienia wskazuj¹, e aden ze stosowanych obecnie markerów œródb³onka nie spe³nia tego kryterium. Nie stwierdza siê bowiem ró nic antygenowych (immunofenotypowych) miêdzy komórkami œródb³onka naczyñ w nowotworach a tymi, które powsta³y na drodze angiogenezy nie zwi¹zanej z karcynogenez¹. We wstêpnej fazie badañ s¹ przeciwcia³a (E9, EN, 7/44, TEC11, H4/ 18, 4A11), które maj¹ byæ swoiste jedynie w stosunku do aktywowanych komórek œródb³onka, jednak e mog¹ byæ one stosowane tylko dla skrawków mro onych [32,33]. Wobec braku mo liwoœci u ycia swoistych przeciwcia³ dla naczyñ powsta³ych w procesie angiogenezy nowotworowej, do jej oceny stosuje siê markery, które nie wyró - niaj¹ nowopowsta³ych naczyñ w obrêbie guza. Do ich uwidocznienia wykorzystywane s¹ wiêc metody immunohistochemiczne, których czu³oœæ i swoistoœæ zale y od przeciwcia³a skierowanego przeciwko poszukiwanemu antygenowi œródb³onka. Stosuje siê jedno z trzech przeciwcia³: anty-cd31, anty-cd34 i anty-fviii. Bada siê równie ekspresjê genu i bia³ka naczyniowo-œródb³onkowego czynnika wzrostu œródb³onka (VEGF) i czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) bezpoœrednio w tkance guza lub w surowicy krwi. VEGF jest czynnikiem wydzielanym przez komórki nowotworowe ró nych typów i pobudza proces angiogenezy: bezpoœrednio bêd¹c specyficznym mitogenem dla komórek œródb³onka oraz poœrednio zwiêkszaj¹c przepuszczalnoœæ naczyñ dla czynników bia³kowych pobudzaj¹cych jego wydzielanie (m.in. fibrynogen). FGF wykazuje dzia³anie mitogenne i chemotaktyczne dla komórek œródb³onka [27,28,34-38]. Czynnik von Willebranda Czynnik VIII (F VIII) jest najlepiej poznanym i rozpowszechnionym markerem komórek œródb³onka, a jako polimer glikoprotein odgrywa istotn¹ rolê w adhezji p³ytek. Wystêpuje on w cia³kach Weibel-Palade a i w aparacie Golgiego komórek œródb³onka oraz w ziarnistoœciach alfa megakariocytów [39]. Antygen FVIII umiejscowiony jest na powierzchni komórek œródb³onka naczyñ (w³osowatych i wiêkszych), poza naczyniami w przegrodach pêcherzyków p³ucnych, k³êbkach nerkowych i sinusoidach w¹troby (ryc. 3) [40]. Ryc. 3. Liczne naczynia uwidocznione ekspresj¹ antygenu FVIII w obrêbie raka krtani (odczyn immunoperoksydazowy, powiêkszenie 200x) Antygen CD34 Antygen CD34 jest bia³kiem o masie cz¹steczkowej 115 kd, obecnym na komórkach prekursorowych mieloidalnych oraz na komórkach œródb³onka. Bia³ko to reguluje migracje komórek œródb³onka podczas dojrzewania nowych naczyñ, pojawia siê we wczesnych etapach ich tworzenia i jest obecne w trakcie ró nicowania naczyñ [40,41]. Jest ono wskaÿnikiem o du ej czu³oœci, porównywalnej z FVIII i CD31. Jednak e w odró nieniu od FVIII i CD31, antygen CD34 nie daje reakcji krzy owej z komórkami krwi, mo e jednak dawaæ reakcje z komórkami nab³onka oraz z komórkami wrzecionowatymi miêsaka Kaposiego [40]. W badaniach w³asnych (praca w druku) stwierdzono znamiennie wiêksz¹ liczbê naczyñ wybarwionych po zastosowaniu przeciwcia³a anty-cd34 w porównaniu do liczby naczyñ uwidocznionych reakcj¹ z antygenem FVIII w grupie 151 chorych na raka krtani (ryc. 4). Antygen CD34 wydaje siê byæ bardziej swoistym ni czynnik FVIII w ocenie neowaskularyzacji w raku krtani. Antygen CD31 CD31 jest glikoprotein¹ o masie cz¹steczkowej 130 kd, która nale y do nadrodziny immunoglobulin zwanej PECAM (Platelet Endothelial Cell Adhesion Ryc. 4. Obraz mikroskopowy licznych naczyñ zabarwionych po zastosowaniu przeciwcia³a anty-cd34 w raku krtani (odczyn immunoperoksydazowy, powiêkszenie 200x)

6 18 Otorynolaryngologia, 2002, 1(1), Molecule p³ytkowo-œródb³onkowa cz¹steczka adhezji komórkowej). Antygen ten wystêpuje na powierzchni p³ytek, monocytów, granulocytów, limfocytów B i na komórkach œródb³onka. W porównaniu z czynnikiem von Willebranda i CD34 wystêpuje znacznie czêœciej, równie na powierzchni komórek œródb³onka sinusoidów w¹troby, œledziony, uwidaczniaj¹c tak e prawid³owe naczynia przegród pêcherzyków p³ucnych [40]. Intensywnoœæ angiogenezy jako czynnik prognostyczny i wskaÿnik rozwoju choroby nowotworowej W pracach klinicznych badanie wartoœci prognostycznej intensywnoœci angiogenezy (IA) by³o odnoszone do wielkoœci guza, obecnoœci przerzutów w wêz³ach ch³onnych i do czasu prze ycia. Wykazano, i intensywniejsza angiogeneza zwiêksza ryzyko wyst¹pienia przerzutów w rakach sutka, prostaty, pêcherza moczowego, g³owy i szyi oraz jelita grubego [42-44]. W niektórych pracach dotycz¹cych raka sutka angiogenezê uwa a siê za niezale ny czynnik prognostyczny [45]. W raku krtani wp³yw angiogenezy na wielkoœæ guza i powstawanie przerzutów nowotworowych do wêz³ów ch³onnych nie zosta³ dostatecznie poznany, a wyniki nielicznych badañ nie s¹ jednoznaczne [46,34,47]. Wp³yw intensywnoœci angiogenezy na wzrost guza i powstawanie przerzutów zosta³ potwierdzony w licznych badaniach we wczesnym i inwazyjnym raku sutka [42,45], w raku endometrium [49], w raku p³uca [50], w raku prostaty [51] i w raku prze³yku [52]. W nowotworach g³owy i szyi badania angiogenezy zapocz¹tkowali m.in. Gasparini i wsp. (1993), którzy w grupie 70 chorych z zaawansowanymi guzami wykazali istnienie znamiennej zale noœci (p<0,001) miêdzy liczb¹ naczyñ ( 25 w polu widzenia pod powiêkszeniem 200x) a obecnoœci¹ wêz³owych i odleg³ych przerzutów. Naczynia uwidoczniono stosuj¹c przeciwcia³o anty- -CD31. Jednak nie wszystkie kolejne prace dawa³y tak jednoznaczne wyniki i znaczenie rokownicze angiogenezy w nowotworach g³owy i szyi (w tym w raku krtani) pozostaje nie w pe³ni wyjaœnione. Rozbie noœci te t³umaczone s¹ brakiem wystandaryzowanych metod identyfikacji naczyñ i oceny intensywnoœci angiogenezy w guzie. W badaniach w³asnych (praca w druku) obejmuj¹cych grupê 151 chorych na raka krtani stwierdzono istotne zale noœci miêdzy intensywnoœci¹ angiogenezy ocenion¹ liczb¹ naczyñ uwidocznionych ekspresj¹ antygenu CD34 i wielkoœci¹ guza a wzmo ona IA wystêpowa³a znamiennie czêœciej w guzach krtani o stopniu zaawansowania T3 (p=0,04) i T4 (p=0,001) i by³a istotnie wiêksza w grupie chorych ze wznow¹ wêz³ow¹ (p=0,02. Pole powierzchni naczyñ, badane z zastosowaniem metody morfometrycznej, by³o znamiennie najwiêksze u chorych z IV stopniem klinicznego zaawansowania choroby (p=0,04) oraz ocenianymi niezale nie: guzem pierwotnym T4 (p=0,02), obecnoœci¹ przerzutów w regionalnych wêz³ach ch³onnych (N1-3) (p<0,001) i obecnoœci¹ wznowy wêz³owej (p=0,001). Intensywnoœæ angiogenezy, oceniana liczb¹ naczyñ uwidocznionych ekspresj¹ antygenu FVIII, zale a³a dodatnio od wielkoœci guza pierwotnego (p=0,01) i by³a znamiennie wiêksza w grupie chorych z przerzutami do wêz³ów ch³onnych, okreœlonymi jako N2 i N3 (p<0,05). Pole powierzchni tych naczyñ by³o istotnie wiêksze w grupie chorych z IV stopniem zaawansowania klinicznego nowotworu (p=0,03) i u pacjentów ze wznow¹ wêz³ow¹ (p<0,001). Reasumuj¹c, badania intensywnoœci angiogenezy w raku krtani pozwalaj¹ na ocenê agresywnoœci raka krtani, zw³aszcza w aspekcie wielkoœci guza pierwotnego i przerzutów do wêz³ów ch³onnych, zarówno tych stwierdzonych podczas pierwotnej oceny zaawansowania nowotworu (cecha N), jak i odleg³ych w czasie (wznowa wêz³owa). Badania immunohistochemiczne neowaskularyzacji pozwalaj¹ na ocenê biologii nowotworu i jego cech z³oœliwoœci ju na podstawie badania guza pierwotnego i na tej podstawie wybór postêpowania leczniczego. W ocenie angiogenezy przeprowadzonej przez wielu autorów w nowotworach z³oœliwych o innej lokalizacji ni g³owa i szyja [42,45,49-52], a w badaniach w³asnych w raku krtani (praca w druku) wykazano, e wzmo ona intensywnoœæ angiogenezy w guzie pierwotnym wskazuje na tendencje nowotworu do intensywnego wzrostu i do powstawania przerzutów w wêz³ach ch³onnych, wznów wêz³owych oraz krótszego czasu prze ycia. Ocena tego procesu w raku krtani mog³aby byæ przydatna w wyodrêbnieniu chorych, u których korzystne by³oby rozszerzenie leczenia. Tak wiêc, w ka dym przypadku stwierdzenia wzmo onej IA w guzie pierwotnym, nale y rozwa yæ, czy istnieje koniecznoœæ zastosowania dodatkowej terapii (napromienianie, chemioterapia) lub wykonania selektywnej operacji wêz³owej, mimo klinicznego braku przerzutów do wêz³ów ch³onnych szyi (N0) w celu prewencji wznów raka. Wyniki tych badañ mog³yby staæ siê przyczynkiem do rozwi¹zania szeroko omawianego w piœmiennictwie laryngologicznym od kilku lat problemu dotycz¹cego przeprowadzania tzw. profilaktycznych selektywnych operacji wêz³owych w przypadku cechy N0, które to postêpowanie budzi liczne kontrowersje i ma swoich przeciwników i zwolenników [53,54]. Ocena angiogenezy mog³aby wiêc pomóc w kwalifikowaniu chorych do takich zabiegów. Nowe perspektywy leczenia Ocena procesu neowaskularyzacji w nowotworach z³oœliwych staje siê bardzo istotna w œwietle intensywnych badañ maj¹cych na celu wprowadzenie leczenia antyangiogennego. Znajomoœæ angiogenezy mog³aby pozwoliæ na zastosowanie egzogennych substancji hamuj¹cych tworzenie nowych naczyñ i tym samym opóÿniæ rozwój guza. W badaniach doœwiadczalnych wykazano, e

7 Gryczyñski M., Pietruszewska W.: Angiogeneza jako nowy czynnik rokowniczy u chorych na raka krtani 19 substancje, które dzia³aj¹ antagonistycznie w stosunku do czynników stymuluj¹cych angiogenezê, mog¹ jednoczeœnie hamowaæ wzrost guza [55]. Próby w tym kierunku rozpoczêto dopiero w ostatnich latach. Obecnie w trzeciej fazie badañ klinicznych s¹ m.in. leki hamuj¹ce rozk³ad b³ony podstawnej bêd¹ce inhibitorami metaloproteaz (enzymów u³atwiaj¹cych penetracjê macierzy zewn¹trzkomórkowej), marimastat i batimastat. Podobne dzia³anie wykazuj¹ równie pochodne distamycyny A i TIMP-1 i 2. Kolejn¹ grup¹ s¹ leki blokuj¹ce dzia³anie czynników pobudzaj¹cych angiogenezê, np. VEGF (poprzez neutralizacjê VEGF lub zablokowanie odpowiedzi komórki œródb³onka na VEGF). Nale ¹ do niej m.in. Talidomid, Linomid, CM101 toksyna streptokokowa, CAI, TNP-470, AGM1470. Badane s¹ równie leki hamuj¹ce migracjê komórkow¹ (winblastyna, taksol, interferon alfa, bleomycyna) i leki hamuj¹ce proliferacjê komórek œródb³onka (rapamycyna, PF4 czynnik p³ytkowy 4 [56,57]. Du e nadzieje pok³ada siê w terapii genowej zwi¹zanej z zastosowaniem genów samobójczych z promotorami swoistymi dla komórek œródb³onka lub genu koduj¹cego TNF-α (czynnik martwicy nowotworów), który wprowadzony do nowotworów litych za poœrednictwem wektora adenowirusowego swoiœcie niszczy naczynia krwionoœne, ulega ekspresji pod wp³ywem promieniowania jonizuj¹cego, w wyniku czego powstaj¹cy TNF-α powoduje powstawanie zakrzepów i niszczenie naczyñ. Poza doskonaleniem technik diagnostycznych i leczniczych, pok³ada siê nadziejê w tym, e postêp badañ biologii nowotworów, w tym procesu angiogenezy, ostatecznie przyniesie korzyœci aplikacyjne. Stwierdzono bowiem, e inwazyjnoœæ procesu w wielu nowotworach, w tym w raku krtani, jest zale na od angiogenezy. Neowaskularyzacja jest niezbêdna do powstania przerzutów nowotworowych tych guzów, chocia nie jest jedynym czynnikiem warunkuj¹cym ich wyst¹pienie. Ocena nasilenia angiogenezy wydaje siê byæ obiecuj¹cym wskaÿnikiem w diagnozowaniu rozleg³oœci procesu nowotworowego oraz w monitorowaniu i prognozowaniu u chorych na z³oœliwe nowotwory lite o ró nym umiejscowieniu. Praca czêœciowo finansowana z funduszu prac w³asnych Akademii Medycznej w odzi nr projektu (62) Piœmiennictwo 1. Tyczyñski JE, Wojciechowska U, Didkowska J i wsp. Atlas umieralnoœci na nowotwory z³oœliwe w Polsce w latach Centrum Onkologii Instytut im. Marii Sk³odowskiej- Curie. Warszawa Zatoñski WA, Tyczyñski JE (red.). Epidemiologia nowotworów z³oœliwych w Polsce w piêtnastoleciu Centrum Onkologii Instytut im. M. Sk³odowskiej-Curie. Warszawa Becker W, Naumann HH, Pfaltz CR. Choroby uszu, nosa i gard³a. Bel Corp. Warszawa Zatoñski WA. Nowotwory z³oœliwe w Polsce. Centrum Onkologii. Warszawa Semczuk B, Szmeja Z, Janczewski G i wsp. Wyniki operacyjnego leczenia chorych na raka krtani w latach w czterech oœrodkach klinicznych. Otolaryng Pol 1998; 70 (3): Wojtukiewicz MZ, Sierko E. Alkohol a nowotwory. Nowotwory 2000; 50 (1): Muscat JE, Wyndre EL. Tobacco, alcohol, asbestos, and occupational risk factors for laryngeal cancer. Cancer 1992; 69, 9: Rosai J. Ackerman s Surgical Pathology. Mosby 1996: Bocca E, Calearo C, DeVincentiis I i wsp. Occult metastases in cancer of the larynx and their relationship to clinical and histological aspects of the primary tumor: a four-year multicentric research. Laryngoscope 1984; 94, 8: Hirvkoski P, Kumpulainen E, Virtaniemi J i wsp. Enhanced apoptosis correlates with poor survival in patients with laryngeal cancer but not with cell proliferation, bci-2 or p53 expression. Eur J Cancer 1999; 35 (2): Shanmugaratnam K, Sobin LH. Histological typing of tumours of the upper respiratory tract and ear. Springer - Verlag Anneroth G, Batsakis J, Luna M. Reviev of the literature and recommended system of malignancy grading in oral squamous cell carcinomas. Scand J Dent Rs 1987; 95: Goldsmith MM, Belchis DA, Cresso DH. The importance of the eosinophil in head and neck cancer. Otolaryngol Head Neck Surg 1992; 106: Jacobsson PA, Eneroth CM, Killander D i wsp. Histological classification and grading of malignancy in cancer of the larynx (a pilot study). Acta Radiol Ther Phys Biol 1973; 12: Weidner N. Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer. Am J Pathol 1995; 147: Gerdes J, Li L, Schlueter C, Duchrow M. i wsp. Immunohistochemical and molecular biology characterisation of the cell proliferration-associated nuclear antigen that is defined by monoclonal antibody Ki-67. Am J Patholog 1991; 138: Limon J, Siedlecki JA. Choroby nowotworowe. w: Bala J. (red.) Badania molekularne i cytogenetyczne w medycynie. Elementy genetyki klinicznej. Springer PWN, Warszawa Kujawski M, Szyfter K. Cytogenetyczne badania nowotworów cz³owieka p³askonab³onkowy rak krtani. Post Biol Komórki 2000; 27, supl. 14: Szyfter K, Ja³oszyñski P, Kujawski M. i wsp. Zagadnienia metodyczne w analizie molekularnej raka krtani. Otolaryng. Pol. 2000; 27( supl. 14): Golusiñski W, Szmeja Z, Olofsson J i wsp. Wartoœæ diagnostyczna i prognostyczna onkogenu p.-53, wybranych markerów nowotworowych (Ki67, PCNA, DNA-ploidii) ultrastruktury u chorych na raka krtani. Otolaryng Pol 1996; 50, 6: Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 1971; 285: Folkman J, Watson K, Ingber D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 1989; 235: Folkman J. What is evidence that tumors are angiogenesis dependent? J. Natl. Canc. Inst. 1990; 82: 4-6.

8 20 Otorynolaryngologia, 2002, 1(1), Folkman J. The role of angiogenesis in tumor growth. Semin Cancer Biol 1992; 3: Szala S, Radzikowski Cz. Pod³o e molekularne angiogenezy nowotworów. Nowotwory 1997; 47: Petruzelli G. The biology of tumor invasion, angiogenesis and lymph node metastasis. ORL 2000; 62: Eisma RJ, Spiro JD, Kreuzer DL. Role of angiogenic factors: coexpression of interleukin-8 and vascular endothelium growth factor in patients with head and neck squamous carcinoma. Laryngoscope 1999; 109: Toi M., Taniguchi T, Yamamoto Y i wsp. Clinical significance of the determination of angiogenic factors. Eur J Cancer 1996; 32A, 14: Nagy JA, Morgan ES, Herzberg KT i wsp. Pathogenesis of ascites tumor growth: angiogenesis, vascular remodeling and stroma formation in the peritoneal lining. Canc Res 1995; 55: Frouge C, Guinebretiere JM, Contesso G i wsp. Correlation between contrast enhancement in dynamic resonance imaging of yhe breast and tumor angiogenesis. Invest Radiol 1994; 29: Yuan A, Chang DB, Yu CJ. Color Doppler sonography of benign and malignant pulmonary masses. AJR 1994; 163: Vermeulen PB, Gasparini G, Fox SB i wsp. Quantification of angiogenesis in solid human tumours: an international consensus on the methodology and criteria of evaluation. Eur J Cancer 1996; 32A(14): Wang JM, Kumar S, Pye D i wsp. A monoclonal antibody detects heterogeneity in vascular endothelium of tumours and normal tissues. Int J Cancer 1993; 54: Burian M, Quint Ch, Neuchrist C. Angiogenic factor in laryngeal carcinomas: Do they have prognostic relevance? Acta Otolaryngol (Stockh) 1999; 119: Dellacono FR, Spiro J, Eisma R i wsp. Expression of basic fibroblast growth factor and its receptors by head and neck squamous cell carcinoma tumor and vascular endothelial cells. Am J Surg 1997; 174: Neuchrist C, Quint C, Pammer A i wsp. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and micovessel density in squamous cell carcinoma of the larynx: an immunohistochemical study. Acta Otolaryngol (Stockh.) 1999; 119: Riedel F, Götte K, Schwalb J i wsp. Vasculat endothelial growth factor expression correlates with p53 mutation and angiogenesis in squamous cell carcinoma of the head and neck. Acta Otolaryngol 2000; 120: Smith BD, Smith GL, Carter D i wsp. Prognostic significence of vascular endothelial growth factor protein levels in oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma. J Clin Oncol 2000; 18(10): Calapso P, Vitarelli E, Crisafulli C i wsp. Immunocytochemical detection of megacariocytes by endothelial markers: a comparative study. Pathologica 1992; 84: Kuzu I, Bicknell R, Harris AL. Heterogeneity of vascular endothelial cells with relevance to diagnosis of vascular tumours. J Clin Pathol 1992; 45: Rijn M., Rouse RV. CD-34 a rview. Appl Immunohist 1994; 2: Bosari S, Lee AKC, Delellis RA i wsp. Microvessel quantification and prognosis in invasise breast carcinoma. Hum Pathol 1992; 23: Brawer MK, Deering RE, Brown M i wsp. Predictors of pathological stage in prostatic carcinoma. Cancer 1994; 73: Gasparini G, Weidner N, Matula S. Intratumoral microvessel density and p53 protein correlation with metastasis in headand-neck carcinoma. Int J Cancer 1993; 55: Weidner N, Folkman J, Pozza F i wsp. Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognosyic indicator in earlystage breast carcinoma. J Natl Cancer Inst 1992; 84: Beatrice F, Cammarota R, Giordano C i wsp. Angiogenesis: prognostic significance in laryngeal cancer. Anticancer Res 1998; 18 (6B): Murray JD, Carlson GW, McLaughlin K i wsp. Tumor angiogenesis as a prognostic factor in laryngeal cancer. Am J Surg 1997; 174(5): Weidner N, Semple JP, Welch WR i wsp. Tumor angiogenesis and metastasis correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med 1991; 324: Schoell WM, Pieber D, Reich O i wsp. Tumor angiogenesis as a prognostic factor in ovarian carcinoma: quantification of endothelial immunoreactivity by image analysis. Cancer 1997; 80 (12): Macchiarini D, Fantanini G, Hardin MJ i wsp. Relation of neovascularisation to metastasis of non-small-celllung cancer. Lancet 1992; 340 (8812): Wakui S, Furusato M, Itoh T i wsp. Tumor angiogenesis in prostatic carcinoma with and without bone marrow metastasis: a morphometric study. J Pathol 1992; 168(3): Tanigawa N, Matsumura M, Amaya H i wsp. Tumor vascularity correlates with the prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma. Cancer 1997; 79: Buckley JG, MacLennan K. Cervical node metastases in laryngeal and hypopharyngeal cancer: a prospective analysis of prevalence and distribution. Head-Neck 2000; 22: Varela AS, Gonzales CF, Valerias RM i wsp. Efficency of funcional elective neck dissection for treatment of cancer of larynx. Rev Laryngol Otol Rhinol 1996; 117, 1: Kim KJ, Li B, Winer J, Armani M i wsp. Inhibition of vascular endothelial growth factor induced angiogenesis suppresses tumour growth in vivo. Nature 1993; 362: Kohn EC, Liotta LA. Molecular insight into cancer invasion: strategies for prevention and intervention. Cancer Res 1995; 55: Rak JW, St.Croix BD, Kerbel RS. Consequences of angiogenesis for tumor progression, metastasis and cancer therapy. Anticancer Drugs 1995; 6(1): 3-18.