Bia³ka z rodziny Bcl-2 a przekaÿnictwo sygna³u wapniowego w zarodkach ssaków uzyskiwanych technik¹ klonowania somatycznego

Transkrypt

1 PRACE PRZEGL DOWE Bia³ka z rodziny Bcl-2 a przekaÿnictwo sygna³u wapniowego w zarodkach ssaków uzyskiwanych technik¹ klonowania somatycznego Marcin Samiec Dzia³ Biotechnologii Rozrodu Zwierz¹t, Instytut Zootechniki Pañstwowy Instytut Badawczy, Balice k. Krakowa The Bcl-2 family proteins and calcium signaling in mammalian embryos generated by somatic cell cloning Summary Adres do korespondencji Marcin Samiec, Dzia³ Biotechnologii Rozrodu Zwierz¹t, Instytut Zootechniki Pañstwowy Instytut Badawczy, Balice k. Krakowa; msamiec@izoo.krakow.pl 1 (88) The efficiency of somatic cell nuclear transfer (SCNT) technology in mammalian species remains unsatisfactory. One of the main causes of low developmental capability of pre- and peri-implanted somatic cell cloned embryos is the high occurrence of apoptotic cell death, which is prompted by incorrect calcium signaling. The latter is accompanied by upregulation of the members from the Bcl-2 protein family in the blastomeres of SCNT embryos derived from the reconstructed oocytes exposed to artificial activating factors that induce the phenomenon of Ca 2+ ion excitotoxicity. Overexpression of antiapoptotic proteins from the Bcl-2 family plays a fundamental role in suppression of different pathways involving intracellular transduction of programmed cell death signal in the somatic cell cloned embryos. Enhancement of Bcl-2 synthesis in the cytoplasm as well as on the outer/cytoplasmic surface of cisterns and tubules of granular endoplasmic reticulum (ER g ) and thereby increase in its concentration and activity in the membranes of ER and mitochondria prevents the redistribution of free calcium cations from ER to mitochondria. The purpose of this article is to provide an overview of the current knowledge on molecular aspects of controlling calcium intracellular homeostasis in mammalian SCNT embryos, in which apoptotic cell death was stimulated by an improper activation of reconstituted oocytes. Key words: SCNT embryo, artificial activation, programmed cell death, Bcl-2, endoplasmic reticulum, Ca 2+ ion, calcium-dependent ATPase, phospholamban, ion channel, mitochondrial Ca 2+ uniporter.

2 Bia³ka z rodziny Bcl-2 a przekaÿnictwo sygna³u wapniowego w zarodkach ssaków 1. Wstêp Mechanizm przekazywania sygna³u wapniowego w cytozolu oocytów zrekonstruowanych technik¹ klonowania somatycznego, który zosta³ nieprawid³owo zainicjowany przez fizyczne lub chemiczne czynniki aktywuj¹ce, mo e prowadziæ nie tylko do stymulacji programu rozwojowego zarodków, lecz tak e mo e powodowaæ stopniowe uruchomienie genetycznie zaprogramowanego systemu przekazywania sygna³u apoptotycznego, odpowiedzialnego za czynn¹ autodestrukcjê komórek w przedimplantacyjnych zarodkach klonalnych. Z kolei, uruchomienie molekularnego scenariusza apoptozy w zarodkach ssaków jest podstawowym elementem mechanizmu regulatorowego przedimplantacyjnej fazy embriogenezy oraz œmiertelnoœci zarodków w stadium blastocysty. W b³onach retikulum endoplazmatycznego oraz w zewnêtrznej b³onie mitochondrialnej komórek dziel¹cych siê zarodków, zapocz¹tkowany zostaje wówczas program nadekspresji bia³ek Bad i Bax, które s¹ przedstawicielami klasy agonistów (promotorów) apoptozy z rodziny bia³ek Bcl-2 (ang. B-Cell Leukemia/Lymphoma-2), reguluj¹cych proces samobójczej œmierci fizjologicznej (1,2). Nazwa tej rodziny, obejmuj¹cej zarówno bia³ka inhibitorowe, jak i stymulatorowe procesu programowanej œmierci komórek, pochodzi od produktu ekspresji protoonkogenu bcl-2, pierwotnie wykrytego w bia³aczkach i ch³oniakach wywodz¹cych siê z limfocytów B. Wzrost stê enia i poziomu aktywnoœci proapoptotycznych bia³ek Bad (ang. Bcl-2 Agonist of Cell Death) i Bax w b³onach ró nych kompartmentów wewn¹trzkomórkowych przyczynia siê do przyœpieszenia zwrotnej akumulacji jonów Ca 2+ w cysternach i kanalikach siateczki œródplazmatycznej. Do zwiêkszenia szybkoœci i pojemnoœci magazynowania de novo kationów wapnia w œwietle ER prowadzi proces stymulacji czynnoœciowej specyficznych pomp wapniowych nale ¹cych do rodziny retikularnych ATPaz zale nych od jonów Ca 2+ img 2+ (ERCA/ERCMA, ang. Endoplasmic Reticulum Ca 2+ and Mg 2+ Dependent ATPase). Z kolei reakumulacja jonów wapniowych w depozytach ER zwiêksza natê enie wewn¹trzkomórkowego przep³ywu wolnych kationów wapnia z siateczki œródplazmatycznej do mitochondriów (3,4). Ponadto, nasilenie aktywnoœci translacyjnej cz¹steczek mrna, bêd¹cych produktami transkrypcji protoonkogenów bad oraz bax indukuje wzrost czêstotliwoœci oraz amplitudy falowych wyrzutów jonów Ca 2+ zmagazynowanych w retikulum endoplazmatycznym. Jest to nastêpstwem podwy szenia poziomu gêstoœci oraz aktywnoœci InsP 3 -zale nych kana³ów wapniowych (5,6). Kolejnym efektem oddzia³ywania bia³ek Bad oraz Bax, które jednoczeœnie pe³ni¹ funkcjê inhibitorów aktywnoœci antyapoptotycznych bia³ek z podrodziny Bcl-2, jest intensyfikacja transportu aktywnego kationów wapniowych do otoczki j¹drowej i nukleoplazmy j¹der komórkowych. Ten ostatni proces katalizowany jest przez j¹drowe ATPazy zale ne od jonów Ca 2+ img 2+, bêd¹ce przedstawicielami pomp wapniowych z rodziny NCA/NCMA (ang. Nuclear Ca 2+ - and Mg 2+ Dependent ATPase), podobnej do tej wystêpuj¹cej w ER (7-9). Udowodniono, e u byd³a i œwini domowej nasilenie ekspresji proapoptotycznych bia³ek z rodziny Bcl-2, takich jak Bax oraz obni enie ekspresji antyapoptotycz- BIOTECHNOLOGIA 1 (88)

3 Marcin Samiec nych bia³ek z rodziny Bcl-2, takich jak Bcl-2 i/lub Bcl- X L nie s¹ zjawiskami specyficznymi tylko dla hodowanych in vitro zarodków klonalnych. S¹ one powszechne tak e w odniesieniu do hodowanych w warunkach pozaustrojowych zarodków, które wyprodukowane zosta³y metod¹ zap³odnienia in vitro (IVF, ang. In Vitro Fertilization). Na podstawie wyników badañ przeprowadzonych u tych gatunków zwierz¹t gospodarskich wykazano równie, e czêstoœæ wystêpowania obu tych zjawisk by³a znacznie wy sza wœród blastocyst rozwijaj¹cych siê w warunkach ex vivo z zarodków uzyskanych w nastêpstwie klonowania somatycznego lub zap³odnienia in vitro ni wœród blastocyst rozwijaj¹cych siê w warunkach wewn¹trzustrojowych (w macicy ciê arnych samic-dawczyñ) z zarodków uzyskanych w nastêpstwie zap³odnienia in vivo (10-13). Ponadto zdiagnozowano, e w warunkach hodowli in vitro ekspresja protoonkogenów bax i bcl-2, oceniana na podstawie ich aktywnoœci transkrypcyjnej i/lub na bazie aktywnoœci translacyjnej produktów ich transkrypcji, by³a znacznie wy sza w odniesieniu do blastocyst byd³a rozwijaj¹cych siê z zygot zrekonstruowanych z j¹der fibroblastów tkanki skórnej doros³ych osobników ni w odniesieniu do blastocyst rozwijaj¹cych siê z zygot zrekonstruowanych z j¹der fibroblastów p³odowych lub z j¹der komórek wzgórka jajonoœnego pêcherzyków jajnikowych dojrza- ³ych p³ciowo ja³ówek i krów. W komórkach blastocyst klonalnych wszystkich trzech typów zachowana by³a taka sama zale noœæ nadekspresji cz¹steczek mrna i/lub bia³ek Bax w stosunku do transkryptów i/lub bia³ek Bcl-2. Z kolei, jedynie w przypadku blastocyst klonalnych uzyskanych z zarodków zrekonstruowanych z j¹der fibroblastów tkanki skórnej doros³ych osobników aktywnoœæ transkrypcyjna protoonkogenu koduj¹cego antyapoptotyczne bia³ko Bcl-2 utrzymywa³a siê na poziomie zbli onym do profilu ekspresji tego genu w komórkach hodowanych ex vivo zarodków w stadium blastocysty uzyskanych w wyniku procedury IVF (11,14). Na podstawie analizy porównawczej wyników badañ nad klonowaniem somatycznym byd³a i œwiñ mo na wnioskowaæ, e stymulacja nie tylko aktywnoœci transkrypcyjnej protoonkogenu koduj¹cego proapoptotyczne bia³ko Bax, lecz tak e aktywnoœci translacyjnej produktów transkrypcji genu bax mo e byæ jedn¹ z g³ównych przyczyn znacznego obni enia przed- i oko³oimplantacyjnych kompetencji rozwojowych zarodków klonalnych w stosunku do potencja³u rozwojowego in vitro oraz in vivo zarodków wyprodukowanych w nastêpstwie zap³odnienia pozaustrojowego (10,15-17). 2. Rola bia³ek rodziny Bcl-2 w regulacji gospodarki wapniowej w apoptotycznych komórkach zarodków klonalnych Wzrost stê enia, a tak e wzrost aktywnoœci g³ównych bia³ek regulatorowych z rodziny Bcl-2, nale ¹cych do klasy antagonistów apoptozy bia³ka Bcl-2 oraz w mniejszym stopniu Bcl-X L, jest prawdopodobnie mechanizmem obronnym komórek zarodków klonalnych przed przekroczeniem punktu nieodwracalnoœci procesu apoptozy. Mechanizm ten jest obserwowany w b³onach organelli stanowi¹cych 68 PRACE PRZEGL DOWE

4 Bia³ka z rodziny Bcl-2 a przekaÿnictwo sygna³u wapniowego w zarodkach ssaków wewn¹trzkomórkowe magazyny jonów Ca 2+ takich jak siateczka œródplazmatyczna i mitochondria (18,19). Przypuszcza siê, e te bia³ka s¹ bezpoœrednio odpowiedzialne za spadek tzw. spoczynkowego poziomu koncentracji wapnia w retikulum endoplazmatycznym [Ca 2+ ] ER, spowodowany obni eniem stê enia zarówno jego formy zjonizowanej, nale ¹cej do tzw. mobilnej puli kationów wapniowych, jak i odwracalnie schelatowanej przez specyficzne bia³ka sensorowe jonów Ca 2+ (g³ównie kalretikulinê). Zmniejszenie poziomu kationów wapniowych zgromadzonych w œwietle cystern i kanalików ER ma wp³yw na kinetykê opró niania tych wewn¹trzkomórkowych rezerwuarów Ca 2+. Dokonuje siê to poprzez redukcjê szybkoœci i pojemnoœci uwalniania jonów wapnia za poœrednictwem kana³ów b³onowych zale nych od myo- -inozytolo-1,4,5-trisfosforanu (InsP 3, ang. Myo-Inositol-1,4,5-Trisphosphate) (rys., 20,21). Efektem spowolnienia tempa redystrybucji jonów Ca 2+ z siateczki œródplazmatycznej g³adkiej i szorstkiej do cytozolu blastomerów zarodka klonalnego jest spadek czêstotliwoœci, a tak e amplitudy kolejno generowanych oscylacyjnych wyrzutów kationów wapnia (22,23). To z kolei prowadzi stopniowo do skrócenia ca³kowitego czasu trwania, a ponadto do obni enia poziomu przejœciowego przyrostu cytoplazmatycznej koncentracji wolnych jonów wapniowych [Ca 2+ ] c w stanie spoczynkowym blastomerów zarodka. Ten specyficzny stan niewra liwoœci komórek zarodka klonalnego na zewnêtrzne bodÿce stymuluj¹ce przypada na okres rozwoju przedimplantacyjnego nastêpuj¹cy bezpoœrednio po sztucznej aktywacji zrekonstruowanych hybryd j¹drowo-cytoplazmatycznych (24-26) Molekularne mechanizmy interakcji antyapoptotycznych bia³ek rodziny Bcl-2 z ATPazami wapniowymi w b³onach siateczki œrodplazmatycznej komórek zarodkowych Wynikiem spadku spoczynkowego poziomu przyrostu [Ca 2+ ] c, indukowanego przez nadekspresjê antyapoptotycznych bia³ek Bcl-2 oraz Bcl-X L w dwuwarstwie fosfolipidowej b³on ER, jest zmniejszenie stê enia g³ównego bia³ka sensorowego kationów wapnia kalmoduliny w cytozolu komórek zarodków klonalnych. Przyczynia siê to na zasadzie ujemnego sprzê enia zwrotnego do obni enia gêstoœci oraz zahamowania aktywnoœci retikularnych ATPaz zale nych od jonów Ca 2+ img 2+ (ERCA/ERCMA) wskutek ich progresywnego odwra liwiania (desensytyzacji) (rys.). Enzymy te spe³niaj¹ funkcjê pomp wapniowych, które odpowiedzialne s¹ za czynny transport kationów wapnia z cytoplazmy do œwiat³a retikulum endoplazmatycznego. Efektem zmian w kinetyce akumulacji jonów Ca 2+ w œwietle siateczki œródplazmatycznej, które spowodowane s¹ os³abieniem zdolnoœci transportuj¹cej ATPaz wapniowych, jest zatem zmniejszenie szybkoœci i pojemnoœci magazynowania de novo kationów wapniowych w ER, tj. ich resekwestracji od cytozolowej puli Ca 2+ (27,28). Przypuszcza siê, e spowolnienie i obni enie stopnia reakumulacji kationów wapnia w œwietle retikulum endoplazmatycznego komórek zarodków klonalnych jest wywo³ane wzrostem koncentracji BIOTECHNOLOGIA 1 (88)

5 Marcin Samiec Rys. Ogniwa anty- i proapoptotycznej regulacji wewn¹trzkomórkowego stê enia wolnych jonów wapnia [Ca 2+ ] i w komórkach zarodków klonalnych. W b³onach retikulum endoplazmatycznego (ER) obejmuj¹ one: 1) kana³y wapniowe zale ne od myo-inozytolo-1,4,5-trisfosforanu, 2) specyficzne ATPazy zale ne od jonów Ca 2+ img 2+ (ERCA/ERCMA) i ich inhibitory (fosfolamban), 3) kana³y kationowe lub chimerowe (kationowo-anionowe), które s¹ formowane przez bia³ka Bcl-2 i/lub anionowe kana³y zale ne od transmembranowego potencja³u elektrochemicznego (VDAC), 4) elektroneutralne wymienniki K + /Ca 2+ lub H + /Ca 2+ oraz 5) bia³ka wi¹ ¹ce wapñ (CaBPs) m.in. kalretikulina, bia³ka GRP78 (BiP) i GRP94, enzym PDI; w zewnêtrznej b³onie mitochondrialnej 6) wysoce selektywne dla jonów Ca 2+ transmembranowe noœniki (uniportery wapniowe) i ich inhibitory; w zewnêtrznej b³onie otoczki j¹dra komórkowego 7) specyficzne ATPazy zale ne od jonów Ca 2+ img 2+ (NCA/NCMA), a w plazmolemmie 8) wymieniacze sodowo-wapniowe (antyportery Na + /Ca 2+ ) oraz 9) kana³y jonowe typu CRAC, które s¹ odpowiedzialne za pojemnoœciowy nap³yw zewn¹trzkomórkowych jonów Ca 2+ do cytoplazmy, bêd¹cy rezultatem opró - nienia magazynów wapnia zlokalizowanych g³ównie w ER (szczegó³owe objaœnienia w tekœcie) 70 PRACE PRZEGL DOWE

6 Bia³ka z rodziny Bcl-2 a przekaÿnictwo sygna³u wapniowego w zarodkach ssaków i aktywnoœci zlokalizowanych na zewnêtrznej powierzchni dwuwarstwy bia³kowo- -fosfolipidowej b³on ER cz¹steczek fosfolambanu, który nale y do podrodziny/klasy specyficznych endogennych inhibitorów kompetycyjnych ATPaz typu ERCA/ERCMA (29,30) (rys.). Istnienie takiego mechanizmu odwracalnego zahamowania funkcji aktywnego transportu jonów Ca 2+ przez pompy wapniowe ER zosta³o potwierdzone przez model supresji in vitro procesu aktywacji œcie ki przekazywania sygna³u apoptotycznego w p³odowych komórkach fibroblastycznych za poœrednictwem wysoce selektywnych inhibitorów pomp wapniowych z grupy nieodwracalnych blokerów ATPaz siateczki œródplazmatycznej (31,32). Trwa³a inhibicja kompetycyjna pomp wapniowych indukowana oddzia³ywaniem na komórki takich mediatorów chemicznych jak np. tapsigargina (TG, lakton seskwiterpenowy wyizolowany z roœliny Thapsia galganica, bêd¹cy równie promotorem transformacji nowotworowej komórek) lub 2,5-ditertybutyrylo-1,4-benzohydrokwinon (tbubhq) prowadzi³a do progresywnego opró niania wewn¹trzkomórkowych magazynów wapnia w ER oraz w mitochondriach (33,34). Wyniki tych badañ mog¹ œwiadczyæ raczej nie tyle o bezpoœrednim wp³ywie antyapoptotycznych bia³ek Bcl-2 na aktywnoœæ ATPaz z rodziny ERCA/ERCMA, lecz o poœrednim efekcie ich oddzia³ywania na enzymatyczne pompy wapniowe poprzez stymulacjê (modulowanie funkcji) specyficznych inhibitorów ATPaz zale nych od jonów Ca 2+ img 2+ z grupy integralnych bia³ek b³onowych retikulum endoplazmatycznego (35,36). Klasycznym przyk³adem regulatorowej roli bia³ek Bcl-2 w stosunku do odwracalnych blokerów pomp wapniowych ER jest inicjacja aktywnoœci najlepiej poznanego przedstawiciela tej klasy bia³ek fosfolambanu, który stanowi niskocz¹steczkowe, integralne bia³ko b³onowe siateczki œródplazmatycznej. Dopiero jego fosforylacja przez zale n¹ od cyklicznego 3,5 -adenozynomonofosforanu (camp, ang. Adenosine 3,5 -Cyclic Monophosphate) kinazê bia³kow¹ A (PKA, ang. Protein Kinase A) lub zale n¹ od Ca 2+ -kalmoduliny kinazê bia³kow¹ typu II (CaM-PK-II, ang. Ca 2+ /Calmodulin-Dependent Protein Kinase II) znosi jego hamuj¹ce dzia³anie i sprawia, e aktywnoœæ ATPazy wapniowej ponownie wzrasta (27,37,38). Jednak e, w wyniku braku uzupe³niania przez unieczynnion¹ za poœrednictwem fosfolambanu Ca 2+ -ATPazê malej¹cego poziomu mobilnej puli wapnia, tj. jego formy zjonizowanej w cysternach i kanalikach siateczki œródplazmatycznej g³adkiej i szorstkiej, dochodzi w nich do gwa³townej aktywacji bia³ek wi¹ ¹cych wapñ (CaBPs, ang. Calcium-Binding Proteins) i zwiêkszenia ich funkcji chelatorowej w stosunku do wolnych jonów Ca 2+ (39) (rys.) Biochemiczne przyczyny nabywania przez bia³ka Bcl-2 molekularnej kompetencji do formowania kana³ów jonowych w b³onach siateczki œródplazmatycznej komórek zarodkowych Straty w obrêbie mobilnej puli kationów wapniowych wewn¹trz cystern i kanalików ER wzrastaj¹ w nastêpstwie indukowanej g³ównie przez antyapoptotyczne bia³ka Bcl-2 zwiêkszonej przepuszczalnoœci b³on ER dla protonów (H + ), jonów me- BIOTECHNOLOGIA 1 (88)

7 Marcin Samiec tali jednowartoœciowych (K + ) i dwuwartoœciowych (Ca 2+ ) oraz w mniejszym zakresie dla anionów chlorkowych (Cl - ) (24,28). Nie mog¹ byæ one zrekompensowane w wyniku uwarunkowanej przez aktywacjê Ca 2+ -ATPaz akumulacji wapnia w œwietle ER. Zwiêkszenie przecieku jonów wapnia ze œwiat³a retikulum endoplazmatycznego do cytozolu komórek zarodka jest w znacznym stopniu uzale nione od: 1) formowania przez bia³ka Bcl-2 w dwuwarstwie lipidowej b³on ER kana³ów jonowych o niskim stopniu selektywnoœci w stosunku do kationów i/lub 2) tworzenia przez nie chimerowych (kationowo-anionowych) kana³ów napiêciowo-zale nych o szczególnie wysokim stopniu przewodnictwa w stosunku do dodatnio na³adowanych jonów o niskiej energii hydratacji, a zatem jonów Ca 2+ (rys.). Ten ostatni rodzaj kana³ów stanowi¹ tzw. kana³y wapniowo- i wodorowo (oksoniowo)-chlorkowe (Ca 2+ /H + (H 3 O + )/Cl - ). Charakterystyczna dla nich jest jednokierunkowa (symportowa) przepuszczalnoœæ jonotropowa, tzn. albo docytozolowa, albo do wnêtrza cystern i kanalików ER, a to oznacza, e ich noœnikowe funkcje wspó³transportowe uwarunkowane s¹ dynamicznymi zmianami transmembranowego potencja³u elektrochemicznego na powierzchni zewnêtrznej (cytoplazmatycznej) oraz na powierzchni wewnêtrznej (luminalnej) b³on siateczki œródplazmatycznej (5,40). Generowany przejœciowo za poœrednictwem obu typów kana³ów b³onowych ER nadprogowy przyrost koncentracji wolnych kationów wapniowych w cytoplazmie komórek powy ej punktu krytycznego, wyznaczanego przez ekstremum 10-5 M/L, wykracza poza fizjologiczne mo liwoœci adaptacyjne przedimplantacyjnych zarodków klonalnych, tj. granicê ich wewn¹trzkomórkowej tolerancji na podwy szone stê enie jonów Ca 2+ wahaj¹ce siê w przedziale od 10-7 do 10-6 M/L. Dlatego te ulega on nastêpnie zmniejszeniu poni ej górnej wartoœci progowej tzw. spoczynkowego poziomu zmian koncentracji wapnia (rzêdu 10-5 M/L) poprzez wzrost frekwencji usuwania jonów Ca 2+ do œrodowiska pozakomórkowego (po ywki hodowlanej) (23,31). Eliminacja kationów wapnia z cytoplazmy komórek zarodka odbywa siê wbrew gradientowi stê eñ za poœrednictwem zlokalizowanych w plazmolemmie jonowymiennych uk³adów, które wykazuj¹ wysok¹ zdolnoœæ do jednoczesnego transportu w przeciwstawnych kierunkach kationów o ró nym ³adunku elektrostatycznym. Uk³ady te okreœlane s¹ mianem wymieniaczy sodowo-wapniowych lub antyporterów Na + /Ca 2+, a ich przeciwpr¹dowe funkcje noœnikowe s¹ zale ne od hydrolizy adenozyno-5 -trifosforanu (ATP, ang. Adenosine 5 -Trisphosphate) (rys.,18,41). Z kolei znaczny spadek parametrów biofizycznych (amplitudy, czêstotliwoœci oraz jednostkowego i ca³kowitego czasu trwania) oscylacji wapniowych w cytozolu komórek zarodków klonalnych, hodowanych in vitro, prowadzi do obni enia szybkoœci i wielkoœci pojemnoœciowego dokomórkowego nap³ywu egzogennych jonów Ca 2+ na zasadzie transportu noœnikowego biernego, tj. uniportu przez kana³y wapniowe typu CRAC (ang. Ca 2+ Release-Activated Ca 2+ Channels), które s¹ okresowo formowane w b³onie cytoplazmatycznej (rys.). Stymulacja czynnoœciowa kana³ów CRAC jest bezpoœrednio skorelowana ze wzrostem stopnia opró - nienia retikulum endoplazmatycznego z puli wolnych (nieschelatowanych) kationów wapnia, a zatem ze wzrostem kinetyki docytozolowego uwalniania jonów Ca 2+ za 72 PRACE PRZEGL DOWE

8 Bia³ka z rodziny Bcl-2 a przekaÿnictwo sygna³u wapniowego w zarodkach ssaków poœrednictwem InsP 3 -zale nych kana³ów wapniowych. Konsekwencj¹ spadku przepuszczalnoœci jonotropowej kana³ów CRAC w plazmolemmie jest gwa³towna redukcja trwa³ego (resztkowego) poziomu cytozolowej koncentracji kationów wapnia (28,42,43) Molekularne mechanizmy interakcji bia³ek Bcl-2 z mitochondrialnymi uniporterami wapniowymi w komórkach zarodka Przypuszcza siê, e odbywaj¹ca siê za poœrednictwem bia³ek Bcl-2, o ekspresji specyficznej dla b³on ER, redukcja dolnej granicy sta³ego stê enia jonów Ca 2+ w stanie spoczynkowym komórki do tzw. wartoœci podprogowej jest sygna³em do gwa³townego os³abienia kinetyki dyfuzji u³atwionej kationów wapniowych do zlokalizowanych w s¹siedztwie cystern i kanalików siateczki œródplazmatycznej mitochondriów. Za proces wspomaganej domitochondrialnej translokacji kationów wapnia odpowiedzialny jest system wysoce selektywnych dla Ca 2+ przezb³onowych noœników, nazywanych uniporterami wapniowymi. Umiejscowione s¹ one w obrêbie zewnêtrznej b³ony mitochondrialnej (44,45) (rys.). Mitochondria stanowi¹ bowiem rodzaj specyficznych zbiorników o du ej i relatywnie trwa³ej pojemnoœci buforowej w stosunku do Ca 2+, przyczyniaj¹c siê tym samym do przejœciowej immobilizacji tych jonów w obiegu wewn¹trzkomórkowym. Wzrost aktywnoœci antyapoptotycznych bia³ek Bcl-2 pochodz¹cych z b³on ER inicjuje zatem przyœpieszenie spadku amplitudy przyrostu koncentracji wolnych kationów wapnia w przestrzeni miêdzyb³onowej i matriks mitochondrialnej. Z kolei akceleracja tego ostatniego procesu indukuje stopniowo na zasadzie dodatniego sprzê enia zwrotnego zwiêkszenie aktywnoœci równie frakcji integralnych bia³ek Bcl-2 w zewnêtrznej b³onie mitochondrialnej (7,46). Bezpoœrednim tego efektem jest podwy szenie wartoœci elektrochemicznego potencja³u transmembranowego DY m w mitochondriach i towarzysz¹ce temu procesowi zmniejszenie przepuszczalnoœci b³on mitochondrialnych (47,48). Prowadzi to do zahamowania uwalniania do cytozolu komórek zarodka kilku czynników apoptogennych. Zalicza siê do nich np. 1) proapoptotyczne bia³ko/flawoproteinê AIF (ang. Apoptosis Inducing Factor) o masie molekularnej 57 kda, wykazuj¹ce znaczn¹ homologiê do oksydoreduktaz oraz zdolnoœæ aktywacji prokaspazy-3; 2) cytochrom c, okreœlany równie mianem drugiego czynnika aktywuj¹cego kaskadê proteaz apoptotycznych (Apaf-2, ang. Apoptosis Protease Activating Factor-2); 3) bia³ko Smac/DIABLO (ang. Second Mitochondrial Activator of Caspases/Direct IAP [Inhibitor of Apoptosis Protein] Binding Protein with Low pi), okreœlane jako drugorzêdowy/wtórny aktywator kaspaz pochodzenia mitochondrialnego lub bia³ko o niskiej wartoœci punktu izoelektrycznego, inaktywuj¹ce bia³kowe czynniki inhibitorowe procesu apoptozy, m.in. inhibitory wielu kaspaz inicjuj¹cych (-8, -10) i wykonawczych (-3, -6, -7), poprzez ich bezpoœrednie wi¹zanie, a tak e 4) prokaspazy-2, -3 i -9, czyli zymogeny kaspaz nale ¹cych do inicjatorów fazy wykonawczej (-2, -9) oraz efektorów fazy wykonawczej apoptozy (-3) (49-51). BIOTECHNOLOGIA 1 (88)

9 Marcin Samiec Mechanizm dodatniego sprzê enia zwrotnego, który sprowokowany jest przyrostem stê enia nale ¹cych do grupy antagonistów procesu apoptozy integralnych bia³ek Bcl-2 w zewnêtrznej b³onie mitochondrialnej, przyczynia siê równie do odwracalnego zablokowania funkcji translokacyjnych uniporterów wapniowych poprzez stymulacjê aktywnoœci ich bia³ek supresorowych w mitochondriach (52,53) (rys.). Dowodem wskazuj¹cym poœrednio na brak istnienia bezpoœrednich interakcji miêdzy bia³kami represorowymi apoptozy z podrodziny Bcl-2 a transmembranowymi domenami bia³ek spe³niaj¹cych rolê noœników specyficznych dla jonów Ca 2+ w zewnêtrznej b³onie mitochondrialnej jest model supresji in vitro procesu aktywacji wewn¹trzkomórkowego szlaku przekazywania sygna³u apoptotycznego w fibroblastach p³odowych. W modelu tym, pozaustrojowa represja systemu transdukcji hiperkalcemicznej informacji proapoptotycznej odbywa³a siê za poœrednictwem wysoce selektywnych inhibitorów uniporterów wapniowych w mitochondriach np. m-chlorofenylohydroksycyjanku karbonylowego lub czerwieni rutenowej (40,54). Jednak e obni ony poziom kationów wapnia w przestrzeni miêdzyb³onowej oraz w macierzy mitochondrialnej nie jest spowodowany jedynie zahamowaniem funkcji transportuj¹cych przezb³onowych noœników jonów Ca 2+ w tych organellach poprzez specyficzne endogenne inhibitory o niepoznanej dot¹d strukturze biochemicznej, lecz przede wszystkim spadkiem poziomu przejœciowego przyrostu kationów wapniowych w cytoplazmie (55,56) (rys.). 3. Molekularne aspekty oddzia³ywañ bia³ek wi¹ ¹cych kationy wapnia z Bcl-2-zale nymi kana³ami jonowymi w b³onach siateczki œródplazmatycznej komórek zarodków klonalnych Za ca³kowit¹ koncentracjê kationów wapniowych zmagazynowanych w formie schelatowanej i niezwi¹zanej stechiometrycznie w retikulum endoplazmatycznym odpowiada stan wzglêdnej równowagi miêdzy aktywn¹ akumulacj¹ jonów Ca 2+ w œwietle kanalików i cystern ER, a ich biernym wyciekiem przez kana³y jonowe uformowane w b³onach siateczki œródplazmatycznej przez integralne bia³ka Bcl-2 z grupy inhibitorów apoptozy (57,58) (rys.). Naruszenie tego stanu homeostazy wapniowej przez uruchomienie œcie ki przekaÿnictwa ekscytotoksycznego sygna³u wapniowego i gwa³towny przyrost cytozolowego stê enia jonów Ca 2+ powoduje zwiêkszenie natê enia aktywacji transkrypcyjnej protoonkogenu bcl-2 i stymulacjê translacji cz¹steczek mrna koduj¹cych bia³ko Bcl-2, co prowadzi do nadekspresji bia³ek Bcl-2 w komórkach przedimplantacyjnych zarodków klonalnych (59,60). Innymi mechanizmami stymuluj¹cymi przyœpieszenie formowania kana³ów jonowych przez bia³ka Bcl-2 s¹ nasilenie modyfikacji potranslacyjnych, tj. glikozylacji i/lub proteolitycznego przetwarzania/dojrzewania natywnego prekursora tego bia³ka tzw. pro- lub prebia³ka Bcl-2 oraz zmiany konformacji bia³ka Bcl-2 i inicjacja jego oligomeryzacji (61,62). Te procesy biochemiczne s¹ zapocz¹tkowywane albo w wyniku przy³¹czania siê do bia³ek Bcl-2 aktywnych ko- 74 PRACE PRZEGL DOWE

10 Bia³ka z rodziny Bcl-2 a przekaÿnictwo sygna³u wapniowego w zarodkach ssaków faktorów, jakimi mog¹ byæ bia³ka wi¹ ¹ce jony wapnia w œwietle ER (CaBPs), albo w wyniku wychwytywania jonów Ca 2+ przez domeny asocjacyjne labilnych produktów ekspresji protoonkogenów bcl-2 o masie molekularnej 26 kda (63,64) (rys.). Przypuszcza siê nawet, e integralne bia³ka b³onowe Bcl-2 oraz Bcl-X L, zlokalizowane w dwuwarstwie lipidowej œcian kanalików i cystern ER, pe³ni¹ funkcjê bia³ek zakotwiczaj¹cych aktywne bia³ka CaBPs, które zaliczane s¹ do grupy wewn¹trzkomórkowych bia³ek protekcyjnych w warunkach ekscytotoksycznoœci sygna³u wapniowego. Z kolei, bia³ka chelatuj¹ce kationy wapniowe indukuj¹ prawdopodobnie zmiany konfiguracji przestrzennej i/lub przemiany tautomeryczne w strukturze chemicznej bia³ek Bcl-2 oraz Bcl-X L, prowadz¹ce do zwiêkszenia podatnoœci ich form monomerycznych lub homodimerycznych na oligomeryzacjê cz¹steczek. Oligomeryzacja antyapoptotycznych bia³ek Bcl-2 odgrywa z kolei istotn¹ rolê w formowaniu przez te bia³ka w b³onach ER kana³ów jonowych o niskiej selektywnoœci w stosunku do kationów jedno- i dwuwartoœciowych, ale o wysokim stopniu przewodnictwa dielektrycznego dla jonów Ca 2+ (65,66). Katalizowane przez kinazy PKA lub CaM-PK-II zmiany w stopniu fosforylacji poszczególnych reszt aminoacylowych w obrêbie specyficznych segmentów w hydrofilowych domenach cytoplazmatycznych bia³ek Bcl-2 maj¹ tak e istotny wp³yw na zwiêkszenie przepuszczalnoœci kana³ów kationowych lub chimerowych (kationowo- -anionowych) kana³ów formowanych zarówno przez bia³ka Bcl-2, jak i/lub anionowe kana³y zale ne od napiêcia pola elektrostatycznego utworzonego na powierzchni b³on ER, tj. kana³y VDAC (ang. Voltage-Dependent Aanion Channel) (rys., 67, 68). Zmiany biochemiczne i biofizyczne, obejmuj¹ce wzrost poziomu ph wewn¹trz cystern i kanalików retikulum endoplazmatycznego oraz obni enie elektrochemicznego potencja³u transb³onowego, które wynikaj¹ ze zmniejszenia zawartoœci kationów wapniowych i wodorowych/oksoniowych (Ca 2+ ih + /H 3 O + ) oraz anionów chlorkowych (Cl - ), mog¹ powodowaæ zwiêkszenie œrednicy œwiat³a, a tak e wyd³u enie czasu otwarcia zale nych od Bcl-2 i/lub Bcl-X L kana³ów jonowych. To z kolei wp³ywa na wzrost czêstotliwoœci oraz pojemnoœci przep³ywu kationów wapnia z ER do cytoplazmy. Natomiast zmiany fizykobiochemiczne o odmiennym charakterze, czyli zmiany, które dotycz¹ obni enia ph wywo³anego zwiêkszeniem stê enia i energii jonizacji kationów oksoniowych i anionów chlorkowych w œwietle ER oraz wzrostu potencja³u transb³onowego, indukuj¹ odwrócenie kierunku pasywnego przecieku kationów wapniowych tzn. z cytozolu do cystern i kanalików siateczki œródplazmatycznej (6,69). Wyp³yw lub nap³yw jonów Ca 2+ z/do ER przez kana³y uformowane za poœrednictwem hydrofobowych domen œródb³onowych bia³ek Bcl-2 mo e sugerowaæ istnienie w ich obrêbie elektroneutralnych wymienników, które zaanga owane s¹ tak e we wspomagan¹ translokacjê (transport bierny noœnikowy) jonów K + lub protonów (rys.). Wymienniki takie mog¹ potencjalnie pracowaæ w obu kierunkach na zasadzie jednoczesnej wymiany przeciwpr¹dowej, czyli antyportu jonów o zmiennej wartoœciowoœci dodatniego ³adunku elektrostatycznego (kationów metali jedno- lub dwuwartoœciowych). Ze wzglêdu na skierowany albo do œwiat³a cystern i kanalików ER, albo do cytozolu gradient stê eñ jonów K + lub H + odgrywaj¹ one podwójn¹ rolê, BIOTECHNOLOGIA 1 (88)

11 Marcin Samiec tzn. s³u ¹ albo do gwa³townej eliminacji kationów wapnia z ER (na zasadzie transportu pasywnego, tj. zgodnego z gradientem stê enia Ca 2+ ), albo do doretikularnej dyfuzji u³atwionej kationów wapnia (70) (rys.). Gwa³towne obni enie tzw. spoczynkowego poziomu koncentracji jonów Ca 2+ wewn¹trz siateczki œródplazmatycznej indukowane wzrostem czêstotliwoœci opró nienia wysoce mobilnych miejsc deponowania wapnia w ER oraz zahamowaniem jego transportu aktywnego do œwiat³a cystern i kanalików ER powoduje zwiêkszon¹ mobilizacjê miejsc chelatowania kationów wapnia w obrêbie jego bia³ek adaptorowych lub akceptorowych. Natomiast podwy szenie wartoœci tzw. potencja³u retencyjnego retikulum endoplazmatycznego dla sygnalizatora wapniowego poprzez zwiêkszenie aktywnoœci bia³ek wi¹ ¹cych jony Ca 2+ (CaBPs) jest niezbêdne do wychwytywania tych kationów z ju znacznie ograniczonej puli wapnia w rezerwuarach ER. Zdolnoœæ odwracalnego wi¹zania wapnia w formie zjonizowanej przez domeny asocjacyjne bia³ek z grupy CaBPs wynika bezpoœrednio z ich niskiego stopnia powinowactwa do jonów Ca 2+, a tak e z ich wysokiej jonowymiennej pojemnoœci magazynowania kationów (71,72) (rys.). Jednak e te w³aœciwoœci fizykochemiczne bia³ek chelatorowych wapnia s¹ konieczne nie tylko do zwiêkszania pojemnoœci buforowej w œwietle kanalików i cystern ER, lecz przede wszystkim do pe³nienia przez nie specyficznych funkcji regulatorowych i protekcyjnych w stosunku do procesów biochemicznych zachodz¹cych w obrêbie siateczki œródplazmatycznej. Retikulum endoplazmatyczne stanowi bowiem organellum wielofunkcyjne, które poza pe³nieniem roli modulatora i transduktora sygna³ów wapniowych jest równie miejscem biosyntezy oraz modyfikacji potranslacyjnych bia³ek sekrecyjnych i integralnych bia³ek b³onowych (61,62). Proces translacji odbywa siê na rybosomach lub polisomach zwi¹zanych na powierzchni cytoplazmatycznej b³on siateczki, a nowo syntetyzowane ³añcuchy polipeptydowe tzw. prekursorów bia³kowych (probia³ek, prebia³ek oraz preprobia³ek) ulegaj¹ translokacji do wewnêtrznej warstwy cysternowej b³on ER. W celu uzyskania pe³nej aktywnoœci, natywne bia³ka prekursorowe musz¹ zostaæ poddane posttranslacyjnym procesom moduluj¹cym ich w³aœciwoœci strukturalno-funkcjonalne. Centralnym ogniwem skupiaj¹cym wielofunkcyjne uk³ady enzymatyczne i inne kompleksy bia³kowe spe³niaj¹ce rolê regulatorow¹ w stosunku do nowo syntetyzowanych bia³ek s¹ w³aœnie bia³ka wi¹ ¹ce wapñ (CaBPs) w ER (73,74). Zwi¹zanie kationów wapnia przez domeny asocjacyjne bia³ek CaBPs jest warunkiem koniecznym do zmiany ich konfiguracji przestrzennej i uzyskania pe³nej aktywnoœci jako kofaktora dla szeregu bia³ek enzymatycznych. Te ostatnie s¹ odpowiedzialne albo za przy- ³¹czanie reszt cukrowcowych do specyficznych sekwencji aminokwasowych (glikozylacjê) wielu bia³ek, albo za proteolityczne dojrzewanie/przetwarzanie bia³ek oraz kszta³towanie ich odpowiedniej struktury przestrzennej poprzez izomeryzacjê œciœle okreœlonych motywów konformacyjnych lub tworzenie mostków dwusiarczkowych miêdzy ³añcuchami polipeptydowymi bia³ek oligomerycznych (75). Ponadto, bia³ka CaBPs nale ¹ do grupy tzw. bia³ek protekcyjnych lub opiekuñczych (z ang. chaperonów lub chaperonin), spe³niaj¹cych funkcje ochronne w stosunku do pro- 76 PRACE PRZEGL DOWE

12 Bia³ka z rodziny Bcl-2 a przekaÿnictwo sygna³u wapniowego w zarodkach ssaków duktów translacji w warunkach stresogennych (apoptogennych). Warunki te mog¹ byæ zainicjowane np. przez gwa³towne zaburzenie homeostazy wapniowej wewn¹trz siateczki œródplazmatycznej w wyniku hiperkalcemii, b¹dÿ przez akumulacjê bia³ek o nieprawid³owo ukszta³towanej konformacji lub bia³ek poddanych b³êdnym modyfikacjom posttranslacyjnym (76,77). W³aœciwoœci prewencyjne bia³ek CaBPs wobec niekorzystnych skutków oddzia³ywania czynników stresotwórczych w cysternach i kanalikach ER maj¹ istotne znaczenie dla stabilizacji konformacji bia³ek w fazach tzw. przestrzennego fa³dowania ich ³añcuchów polipeptydowych oraz dla proteolitycznego dojrzewania bia³ek prekursorowych albo glikozylacyjnej modyfikacji lub ³¹czenia podjednostek bia³kowych poprzez oligomeryzacjê form monomerycznych bia³ka prekursorowego. Na szczególn¹ uwagê zas³uguje równie udzia³ bia³ek chelatuj¹cych jony Ca 2+ w indukowaniu degradacji bia³ek strukturalnych i enzymatycznych o nieprawid³owo ukszta³towanej konfiguracji przestrzennej (78,79). Wœród bia³ek CaBPs wa n¹ rolê w wymienionych procesach odgrywaj¹ m.in. 1) kalretikulina; 2) bia³ko o masie cz¹steczkowej 78 kda, którego aktywnoœæ regulowana jest przez glukozê (GRP78, ang. 78 kda Glucose-Regulated Protein), okreœlane tak e jako specyficzne bia³ko retikulum endoplazmatycznego wi¹ ¹ce jony Ca 2+ (BiP, ang. Endoplasmic Reticulum Lumenal Ca 2+ Binding Protein); 3) bia³ko GRP o masie molekularnej 94 kda (GRP94), oraz 4) bia³kowa izomeraza disulfidowa (PDI ang. Protein Disulphide Isomerase) (rys., 34,72,80). Cech¹ wspóln¹ wszystkich tych bia³ek jest obecnoœæ w ich hydrofobowym koñcu karboksylowym tetrapeptydowych sekwencji sygna³owych, decyduj¹cych o ich lokalizacji specyficznej dla retikulum endoplazmatycznego, czyli tzw. regionów zachowawczych Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL). Segmenty KDEL, dostarczaj¹ce tzw. sygna³u retencji bia³ka w siateczce œródplazmatycznej, bior¹ udzia³ w zale nym od jonów Ca 2+ wi¹zaniu ( zakotwiczaniu ) do wewnêtrznej powierzchni cysternowej (luminalnej) b³on siateczki bia³ek opiekuñczych, które poœrednicz¹ w odpowiedzi na powsta³e w ER czynniki stresogenne. Przypuszcza siê, e sygna³owe sekwencje retencyjne s¹ zlokalizowane w obrêbie domen asocjacyjnych dla kationów wapnia (81). Taka struktura biochemiczna chaperonin determinuje ich podstawow¹ funkcjê regulatorow¹ w zale nej od ER, czasoprzestrzennej sekwestracji (odizolowaniu) jonów Ca 2+ od cytozolowej puli tych kationów. Obecnoœæ regionu zachowawczego w obrêbie miejsc chelatuj¹cych kationy wapniowe decyduje zatem o szybkiej aktywacji bia³ek protekcyjnych z grupy CaBPs w warunkach niedoboru wapnia (hipokalcemii) w œwietle cystern i kanalików ER, spowodowanej antyapoptotycznym dzia³aniem bia³ek Bcl-2 oraz Bcl-X L (82,83). 4. Podsumowanie Nadekspresja bia³ek podrodziny Bcl-2 o dzia³aniu antyapoptotycznym odgrywa istotn¹ rolê w supresji ró nych œcie ek wewn¹trzkomórkowej transdukcji hiperkalcemicznego sygna³u proapoptotycznego w blastomerach zarodków klonalnych. BIOTECHNOLOGIA 1 (88)

13 Marcin Samiec Zarodki takie rozwijaj¹ siê czêsto ze zrekonstytuowanych oocytów poddanych dzia³aniu sztucznych czynników aktywuj¹cych, które indukuj¹ zjawisko ekscytotoksycznoœci kationów wapnia (12,15,84). Stymulacja syntezy bia³ek z rodziny Bcl-2, nale ¹cych do klasy supresorów (represorów) apoptozy, w cytoplazmie oraz na zewnêtrznej powierzchni cystern i kanalików siateczki œródplazmatycznej szorstkiej prowadzi do wzrostu ich koncentracji i aktywnoœci w b³onach ró nych kompartmentów wewn¹trzkomórkowych, które obejmuj¹ retikulum endoplazmatyczne oraz mitochondria. Stanowi to wa ne ogniwo mechanizmu zapobiegaj¹cego redystrybucji wolnych jonów Ca 2+ z ER do mitochondriów (14,85,86). Nasilenie ekspresji bia³ek bêd¹cych przedstawicielami podrodziny Bcl-2 o funkcjach inhibitorowych wobec procesu apoptozy przyczynia siê tak e do obni enia liczby falowych wyrzutów kationów wapnia z depozytów wewn¹trzkomórkowych zlokalizowanych w ER poprzez spadek gêstoœci oraz aktywnoœci InsP 3 -zale nych kana³ów uwalniania jonów Ca 2+. Ponadto, powoduje ono zahamowanie transportu kationów wapnia do otoczki j¹drowej i nukleoplazmy j¹der komórkowych za poœrednictwem pomp wapniowych typu NCA/NCMA, nale ¹cych do rodziny j¹drowych ATPaz zale nych od jonów Ca 2+ img 2+ o wysokim stopniu homologii z klas¹ ATPaz wapniowych ERCA/ERCMA, które wystêpuj¹ w b³onach siateczki œródplazmatycznej (13,29,87) (rys.). Z kolei, spowolnienie i zmniejszenie pojemnoœciowego nap³ywu kationów wapnia ze œrodowiska pozakomórkowego (po ywki hodowlanej) do cytoplazmy blastomerów jest mechanizmem adaptacyjnym przedimplantacyjnych zarodków klonalnych do specyficznych, wewn¹trzkomórkowych warunków biochemicznych i biofizycznych. Warunki te charakteryzuj¹ siê, odpowiednio, d³ugotrwa³¹ redukcj¹ stê enia jonów Ca 2+ w retikulum endoplazmatycznym oraz spadkiem objêtoœci œwiat³a kanalików i cystern ER w tzw. stanie spoczynkowym cytozolowej koncentracji kationów wapnia, jaki nastêpuje po aktywacji zrekonstruowanych oocytów, indukuj¹cej przekazywanie proapoptotycznego sygna³u wapniowego (17,88,89). Nie ulega w¹tpliwoœci, e bia³ka z rodziny Bcl-2, które nale ¹ do klasy antagonistów i agonistów apoptozy, odgrywaj¹ ogromn¹ rolê w mechanizmach reguluj¹cych wewn¹trzkomórkowy system przekaÿnictwa sygna³u wapniowego w zarodkach ssaków uzyskiwanych w wyniku klonowania somatycznego. Jednak e, dotychczasowa wiedza na temat biochemicznych, molekularnych, biofizycznych, a tak e genetycznych uwarunkowañ interakcji anty- i proapoptotycznych bia³ek z rodziny Bcl-2 z endogennymi czynnikami odpowiedzialnymi za utrzymanie lub drastyczne naruszenie dynamicznej homeostazy w gospodarce kalcemicznej blastomerów przedimplantacyjnych zarodków klonalnych jest wci¹ niespójna i fragmentaryczna. Dlatego te nie bez znaczenia pozostaje pe³niejsze poznanie z³o onych i skomplikowanych oddzia³ywañ pomiêdzy produktami ekspresji protoonkogenów bcl-2 i bax a elementami regulatorowymi wewn¹trzkomórkowych szlaków transdukcji sygna³u hiperkalcemicznego (tj. ekscytotoksycznego) lub hipokalcemicznego (tj. acytotoksycznego) w czasie rozwoju in vitro oraz in vivo zarodków klonalnych. To z kolei przyczyniæ siê mo e do zwiêkszenia efektywnoœci 78 PRACE PRZEGL DOWE

14 Bia³ka z rodziny Bcl-2 a przekaÿnictwo sygna³u wapniowego w zarodkach ssaków klonowania somatycznego ssaków, a w dalszej perspektywie do wzrostu tkwi¹cego w tej technologii i tak ju doœæ szerokiego potencja³u praktycznych mo liwoœci aplikacyjnych w biomedycynie, farmacji i rolnictwie. Praca finansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wy szego ze œrodków na naukê w latach jako projekt badawczy w³asny nr N N Literatura 1. Zong W. X., Li C., Hatzivassiliou G., Lindsten T., Yu Q. C., Yuan J., Thompson C. B., (2003), J. Cell. Biol., 162, Sanges D., Marigo V., (2006), Apoptosis, 11, Nutt L. K., Chandra J., Pataer A., Fang B., Roth J. A. Swisher S. G., O Neil R. G., McConkey D. J., (2002), J. Biol. Chem., 277, de Giorgi F., Lartigue L., Bauer M. K., Schubert A., Grimm S., Hanson G. T., Remington S. J., Youle R. J., Ichas F., (2002), FASEB (The Federation of American Societies for Experimental Biology) J., 16, Nakano T., Watanabe H., Ozeki M., Asai M., Katoh H., Satoh H., Hayashi H., (2006), Cardiovasc. Res., 69, Oakes S. A., Scorrano L., Opferman J. T., Bassik M. C., Nishino M., Pozzan T., Korsmeyer S. J., (2005), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, Goetz J. G., Nabi I. R., (2006), Biochem. Soc. Trans., 34, Leite M. F., Thrower E. C., Echevarria W., Koulen P., Hirata K., Bennett A. M., Ehrlich B. E., Nathanson M. H., (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, Zalk R., Israelson A., Garty E. S., Azoulay-Zohar H., Shoshan-Barmatz V., (2005), Biochem. J., 386, Li X., Amarnath D., Kato Y., Tsunoda Y., (2006), Cloning Stem Cells, 8, Amarnath D., Li X., Kato Y., Tsunoda Y., (2007), J. Reprod. Dev., 53, Kim S., Lee S. H., Kim J. H., Jeong Y. W., Hashem M. A., Koo O. J., Park S. M., Lee E. G., Hossein M. S., Kang S. K., Lee B. C., Hwang W. S., (2006), Mol. Reprod. Dev., 73, Gupta M. K., Uhm S. J., Lee H. T., (2007), Mol. Reprod. Dev., 74, Jang G., Jeon H. Y., Ko K. H., Park H. J., Kang S. K., Lee B. C., Hwang W. S., (2005), Zygote, 13, McElroy S. L., Kim J. H., Kim S., Jeong Y. W., Lee E. G., Park S. M., Hossein M. S., Koo O. J., Abul Hashem M. D., Jang G., Kang S. K., Lee B. C., Hwang W. S., (2008), Theriogenology, 69, Gupta M. K., Uhm S. J., Lee S. H., Lee H. T., (2008), Mol. Reprod. Dev., 75, Hwang I. S., Park M. R., Moon H. J., Shim J. H., Kim D. H., Yang B. C., Ko Y. G., Yang B. S., Cheong H. T., Im G. S., (2008), Mol. Reprod. Dev., 75, He H., Lam M., McCormick T. S., Distelhorst C. W., (1997), J. Cell Biol., 138, Pinton P., Rizzuto R., (2006), Cell Death Differ., 13, Li C., Fox C. J., Master S. R., Bindokas V. P., Chodosh L. A., Thompson C. B., (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, Basset O., Boittin F. X., Cognard C., Constantin B., Ruegg U. T., (2006), Biochem. J., 395, Zhong F., Davis M. C., McColl K. S., Distelhorst C. W., (2006), J. Cell Biol., 172, Szlufcik K., Bultynck G., Callewaert G., Missiaen L., Parys J. B., de Smedt H., (2006), Cell Calcium, 39, Chami M., Prandini A., Campanella M., Pinton P., Szabadkai G., Reed J. C., Rizzuto R., (2004), J. Biol. Chem., 279, Grebinyk D. M., Koval T. V., Matyshevskaia O. P., (2004), Ukr. Biokhim. Zh., 76, BIOTECHNOLOGIA 1 (88)

15 Marcin Samiec 26. Pinton P., Ferrari D., Rapizzi E., di Virgilio F., Pozzan T., Rizzuto R., (2002), Biochimie, 84, Grebinyk D. M., Griniuk I. I., Matyshevskaia O. P., (2005), Ukr. Biokhim. Zh., 77, Pinton P., Ferrari D., Magalhaes P., Schulze-Osthoff K., di Virgilio F., Pozzan T., Rizzuto R., (2000), J. Cell Biol., 148, Dremina E. S., Sharov V. S., Kumar K., Zaidi A., Michaelis E. K., Schoneich C., (2004), Biochem. J., 383, Breckenridge D. G., Germain M., Mathai J. P., Nguyen M., Shore G. C., (2003), Oncogene, 22, Scorrano L., Oakes S. A., Opferman J. T., Cheng E. H., Sorcinelli M. D., Pozzan T., Korsmeyer S. J., (2003), Science, 300, Treiman M., Caspersen C., Christensen S. B., (1998), Trends Pharmacol. Sci., 19, Yoshida I., Monji A., Tashiro K., Nakamura K., Inoue R., Kanba S., (2006), Neurochem. Int., 48, Ying M., Sannerud R., Flatmark T., Saraste J., (2002), Eur. J. Cell Biol., 81, Mahaney J. E., Albers R. W., Waggoner J. R., Kutchai H. C., Froehlich J. P., (2005), Biochemistry, 44, Yao Q., Chen L. T., Li J., Brungardt K., Squier T. C., Bigelow D. J., (2001), Biochemistry, 40, Negash S., Yao Q., Sun H., Li J., Bigelow D. J., Squier T. C., (2000), Biochem. J., 351, Ferrington D. A., Yao Q., Squier T. C., Bigelow D. J., (2002), Biochemistry, 41, Arnaudeau S., Frieden M., Nakamura K., Castelbou C., Michalak M., Demaurex N., (2002), J. Biol. Chem., 277, Shoshan-Barmatz V., Israelson A., Brdiczka D., Sheu S. S., (2006), Curr. Pharm. Des., 12, Machaty Z., Ramsoondar J. J., Bonk A. J., Prather R. S., Bondioli K. R., (2002a), Biol. Reprod., 67, Machaty Z, Ramsoondar J. J., Bonk A. J., Bondioli K. R., Prather R. S., (2002b), Biol. Reprod., 66, Bugaj V., Alexeenko V., Zubov A., Glushankova L., Nikolaev A., Wang Z., Kaznacheyeva E., Bezprozvanny I., Mozhayeva G. N., (2005), J. Biol. Chem., 280, Putney J. W. Jr., Thomas A. P., (2006), Curr. Biol., 16, R812-R Hajnoczky G., Csordas G., Das S., Garcia-Perez C., Saotome M., Sinha Roy S., Yi M., (2006), Cell Calcium, 40, Csordas G., Hajnoczky G., (2001), Cell Calcium, 29, Malli R., Frieden M., Osibow K., Zoratti C., Mayer M., Demaurex N., Graier W. F., (2003), J. Biol. Chem., 278, Manser R. C., Houghton F. D., (2006), J. Cell Sci., 119, Hasenjager A., Gillissen B., Muller A., Normand G., Hemmati P. G., Schuler M., Dorken B., Daniel P. T., (2004), Oncogene, 23, Zheng Y., Shi Y., Tian C., Jiang C., Jin H., Chen J., Almasan A., Tang H., Chen Q., (2004), Oncogene, 23, Sanges D., Comitato A., Tammaro R., Marigo V., (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, Dahlem Y. A., Wolf G., Siemen D., Horn T. F., (2006), Cell Calcium, 39, Malli R., Frieden M., Trenker M., Graier W. F., (2005), J. Biol. Chem., 280, Kessel D., Castelli M., Reiners J. J., (2005), Cell Death Differ., 12, An J., Chen Y., Huang Z., (2004), J. Biol. Chem., 279, Lee W. K., Bork U., Gholamrezaei F., Thevenod F., (2005), Am. J. Physiol. Renal Physiol., 288, F27-F Mattson M. P., LaFerla F. M., Chan S. L., Leissring M. A., Shepel P. N., Geiger, J. D., (2000), Trends Neurosci., 23, Wang N. S., Unkila M. T., Reineks E. Z., Distelhorst C. W., (2001), J. Biol. Chem., 276, Barrero M. J., Montereo M., Alvarez J., (1997), J. Biol. Chem., 272, PRACE PRZEGL DOWE

16 Bia³ka z rodziny Bcl-2 a przekaÿnictwo sygna³u wapniowego w zarodkach ssaków 60. Hofer A., Fasolato C., Pozzan T., (1998), J. Cell Biol., 140, Berridge M. J., (2002), Cell Calcium, 32, Sitia R., Braakman I., (2003), Nature, 426, Yu Z., Luo H., Fu W., Mattson, M. P., (1999), Exp. Neurol., 155, Montero M., Brini M., Marsault R., Alvarez J., Sitia R., Pozzan T., Rizzuto R., (1995), EMBO (The European Molecular Biology Organization) J., 14, Minn A. J., Velez P., Schendel S. L., Liang H., Muchmore S. W., Fesik S. W., Fill M., Thompson C. B., (1997), Nature, 385, Schendel S. L., Montal M., Reed J. C., (1998), Cell Growth Differ., 5, Oakes S. A., Opferman J. T., Pozzan T., Korsmeyer S. J., Scorrano L., (2003), Biochem. Pharmacol., 66, Mathai J. P., Germain M., Shore G. C., (2005), J. Biol. Chem., 280, Brostrom M. A., Brostrom C. O., (2003), Cell Calcium, 34, Garcia-Saez A. J., Mingarro I., Perez-Paya E., Salgado J., (2004), Biochemistry, 43, Coppolino M. G., Dedhar S., (1998), Int. J. Biochem. Cell Biol., 30, Michalak M., Corbett E. F., Mesaeli N., Nakamura K., Opas M., (1999), Biochem. J., 344, Rao R. V., Peel A., Logvinova A., del Rio G., Hermel E., Yokota T., Goldsmith P. C., Ellerby L. M., Ellerby H. M., Bredesen, D. E., (2002), FEBS (The Federation of European Biochemical Societies) Lett., 514, Arap M. A., Lahdenranta J., Mintz P. J., Hajitou A., Saris A. S., Arap W., Pasqualini R., (2004), Cancer Cell, 6, Sun F.-C., Wei S., Li C.-W., Chang Y.-S., Chao C.-C., Lai Y.-K., (2006), Biochem. J., 396, Hetz C., Bernasconi P., Fisher J., Lee A. H., Bassik M. C., Antonsson B., Brandt G. S., Iwakoshi N. N., Schinzel A., Glimcher L. H., Korsmeyer S. J., (2006), Science, 312, Li J., Lee B., Lee A. S., (2006), J. Biol. Chem., 281, Luo S., Mao C., Lee B., Lee A. S., (2006), Mol. Cell Biol., 26, Morishima N., Nakanishi K., Tsuchiya K., Shibata T., Seiwa E., (2004), J. Biol. Chem., 279, Reddy R. K., Mao C., Baumeister P., Austin R. C., Kaufman R. J., Lee A. S., (2003), J. Biol. Chem., 278, Xiao G., Chung T. F., Pyun H. Y., Fine R. E., Johnson R. J., (1999), Brain Res. Mol. Brain Res., 72, Lamb H. K., Mee C., Xu W., Liu L., Blond S., Cooper A., Charles I. G., Hawkins A. R., (2006), J. Biol. Chem., 281, Lam M., Vimmerstedt L. J., Schlatter L. K., Hensold J. O., Distelhorst C. W., (1992), Blood, 79, Tsou M. F., Lu H. F., Chen S. C., Wu L. T., Chen Y. S., Kuo H. M., Lin S. S., Chung J. G., (2006), Anticancer Res., 26, Jouaville L. S., Pinton P., Bastianutto C., Rutter G. A., Rizzuto R., (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, Robb-Gaspers L. D., Burnett P., Rutter G. A., Denton R. M., Rizzuto R., Thomas A. P., (1998), EMBO (The European Molecular Biology Organization) J., 17, Marin M. C., Fernandez A., Bick R. J., Brisbay S., Buja L. M., Snuggs M., McConkey D. J., von Eschenbach A. C., Keating M. J., McDonnell T. J., (1996), Oncogene, 12, Dellis O., Dedos S. G., Tovey S. C., Taufiq-Ur-Rahman, Dubel S. J., Taylor C. W., (2006), Science, 313, Kotturi M. F., Hunt S. V., Jefferies W. A., (2006), Trends Pharmacol. Sci., 27, BIOTECHNOLOGIA 1 (88)