Przegląd piśmiennictwa Journal Club

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2014; 50(1): Przegląd piśmiennictwa Journal Club Ocena rzeczywistej liczby płytek krwi w pseudotrombocytopenii alternatywny antykoagulant na bazie soli magnezu Antykoagulanty (inhibitory krzepnięcia) stanowią istotny element współczesnej diagnostyki laboratoryjnej, ich zastosowanie w codziennej praktyce laboratoryjnej gwarantuje stabilizację materiału diagnostycznego poprzez zahamowanie procesów krzepnięcia od chwili pobrania materiału aż do momentu przeprowadzenia stosownego badania. Do antykoagulantów wykorzystywanych w hematologii laboratoryjnej należą przede wszystkim sole dwusodowe (Na 2 EDTA), dwupotasowe (K 2 EDTA) oraz trójpotasowe (K 3 EDTA) kwasu etylenodiaminotetraoctowego (wersenian, EDTA), które hamują procesy krzepnięcia w mechanizmie wiązania jonów dwuwartościowych (Ca 2+ ) oraz warunkują stabilizację komórkowych i pozakomórkowych składników krwi przez określony czas. Sole kwasu wersenowego uważane są za antykoagulanty z wyboru, są szeroko stosowane w badaniach ilościowych i jakościowych składników morfotycznych krwi, uzyskały rekomendacje Międzynarodowego Komitetu ds. Standaryzacji w Hematologii (International Council for Standarization in Haematology). W ocenie parametrów hematologicznych krwi, uzyskanie wiarygodnych wyników uzależnione jest głównie od temperatury i czasu, jaki upłynął od pobrania materiału do momentu wykonania oznaczenia. Jak wiadomo przy wydłużonym czasie przechowywania próbki w temperaturze pokojowej, EDTA może wpływać na zmianę morfologii oraz liczbę składników upostaciowionych krwi, m.in. pseudotrombocytopenia EDTA-zależna (małopłytkowość rzekoma, PTCP). PTCP jest stosunkowo rzadkim zjawiskiem polegającym na uzyskaniu fałszywie obniżonej liczby płytek krwi (PLT) w obecności EDTA, w efekcie zwiększonej skłonności płytek do zlepiania się i tworzenia agregatów, które w układach pomiarowych analizatorów hematologicznych mogą być błędnie zaliczane są do leukocytów. Zdaniem Schuff-Werner i wsp. alternatywą dla EDTA w przypadku podejrzenia PTCP, mogą być sole magnezu - stosowane na początku XX wieku do mikroskopowej ilościowej oceny płytek krwi. Magnez określany jest mianem naturalnego antagonisty wapnia ze względu na swoją zdolność do hamowania wewnątrzkomórkowego stężenia Ca 2+ w płytkach krwi - jednego z pierwszych etapów inicjujących tworzenie agregatów płytkowych. Aktywność przeciwagregacyjną soli magnezu względem płytek krwi wykazano w badaniu opierającym się na analizie krwi obwodowej zdrowych pacjentów pobranej na Thromboexact TM przy wykorzystaniu analizatora Multiplate TM. Uzyskane wyniki potwierdziły, że sole magnezu skutecznie przeciwdziałają agregacji płytek indukowanej ADP oraz kwasem arachidonowym. Z tego powodu celem wieloośrodkowego badania niemieckich naukowców było porównanie u pacjentów z potwierdzoną PTCP, wartości liczbowych PLT uzyskanych dla próbek krwi pobranych na EDTA oraz MgSO 4. Grupę badawczą stanowiło 44 pacjentów (26 kobiet, 18 mężczyzn) w wieku od 18 do 72 lat. Za kryterium włączenia pacjenta do grupy badawczej uznano potwierdzoną PTCP, na którą wskazywała niska liczba PLT (niespójna z obrazem klinicznym pacjenta), alarm lub oflagowanie analizatora sygnalizujące agregaty płytkowe oraz ocena mikroskopowa rozmazu krwi obwodowej. W celu dokonania analizy porównawczej liczby PLT dla obu antykoagulantów, od pacjentów z potwierdzoną PTCP pobrano dwie dodatkowe próbki krwi obwodowej - na EDTA i MgSO 4 (w pierwszym etapie badania 33,8 μmol MgSO 4, w późniejszym etapie komercyjnie dostępny Thromboexact TM ). Liczbę PLT mierzono na analizatorze Coulter LH 750 system oraz Sysmex XE 5000 system. Średnia liczba PLT uzyskana dla próbek pobranych na ETDA i MgSO 4 wynosiła odpowiednio: 66 x 10 9 /l oraz 223 x 10 9 /l. Bezwzględny przyrost liczby PLT w próbkach pobranych na MgSO 4 względem odpowiednich próbek pobranych na EDTA mieścił się w zakresie od 69 x 10 9 /l (+162%) do 285 x 10 9 /l (+475%). W analizowanych próbkach krwi pobranych na MgSO 4 nie stwierdzono ponadto istotnych różnic w liczbie WBC i RBC względem próbek pobranych na EDTA. Ocena mikroskopowa rozmazu krwi obwodowej w przypadku obu antykoagulantów również nie wykazała istotnych różnic w jakości preparatów oraz w morfologii poszczególnych komórek krwi. Uzyskanie dokładnej liczby PLT w przypadku potwierdzonej pseudotrombocytopenii EDTA- zależnej wymaga zastosowania innych antykoagulantów. Niemniej jednak dotychczas zalecane (w przypadku PTCP) środki przeciwkrzepliwe (mieszanina chlorku sodu i heparyny sodowej, cytrynian sodu) cechują się niejednokrotnie niską stabilnością, niedostateczną skutecznością działania lub wyższą ceną. Zasadne wydaje się zatem poszukiwanie nowych alternatywnych antykoagulantów, umożliwiających otrzymanie wiarygodnych wyników dla PLT. Przedstawione badania potwierdzają, że MgSO 4 efektywnie hamuje agregację płytek krwi u pacjentów z rozpoznaną PTCP, nie wpływając tym samym negatywnie na wyniki innych parametrów hematologicznych. Dlatego, zdaniem niemieckich naukowców MgSO 4 jest bezpiecznym antykoagulantem, który może być rekomendowany do oznaczenia liczby PLT, w przypadku uzyskania niepokojąco niskiej liczby PLT w próbkach pobranych na EDTA, niekorespondującej z obrazem klinicznym pacjenta lub w przypadku oflagowania analizatora, sugerującego wystąpienie agregatów komórkowych. Według: Schuff-Werner P, Steiner M, Fenger S i wsp. Effective estimation of correct platelet counts in pseudothrombocy- 79

2 topenia using an alternative anticoagulant based on magnesium salt. Br J Haematol 2013; 162(5): Magdalena Twardoch Laboratorium Centralne, SP Szpital Kliniczny nr 1 Śląski Uniwersytet Medyczny, Zabrze Naczyniowe białko adhezyjne 1 w chorobach oczu Naczyniowe białko adhezyjne-1 (vascular adhesion protein 1) - VAP-1 zostało odkryte, w objętych stanem zapalnym naczyniach maziówki, przez Salmi i Jalkanen w 1992r. Cząsteczka VAP-1 zbudowana jest z krótkiej, N-terminalnej domeny wewnątrzkomórkowej, domeny przezbłonowej oraz pozakomórkowej, w której zlokalizowane jest centrum katalityczne. Oprócz formy związanej z błoną komórkową, VAP-1 występuje również w osoczu w formie rozpuszczalnej (svap- 1). W stanach fizjologicznych VAP-1 jest magazynowane w ziarnistościach wewnątrzkomórkowych, skąd w warunkach stanu zapalnego ulega translokacji na powierzchnię komórek śródbłonka. VAP-1 nie tylko pośredniczy w wiązaniu limfocytów do śródbłonka naczyniowego oraz ich migracji do miejsca objętego zapaleniem, ale wykazuje również aktywność enzymatyczną aminooksydazy wrażliwej na działanie semikarbazydu - SSAO (semicarbazide-sensitive amine oxidase). Ekspresję VAP-1 obserwowano w skórze, mózgu, płucach i wątrobie. W przypadku oczu ekspresję VAP-1 stwierdzano w śródbłonku naczyń siatkówki oraz naczyniówki. Badania z użyciem rekombinowanego VAP-1 pozwoliły zidentyfikować receptory dla tej cząsteczki. Jest to należący do rodziny receptorów Siglec (sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin), obecny na wszystkich granulocytach Siglec-9 i stwierdzany głównie na limfocytach B Siglec-10. Ze względu na fakt, że VAP-1 pośredniczy w rekrutacji leukocytów i ich translokacji do miejsca objętego zapaleniem, w przypadku niektórych chorób zapalnych oczu tj. np. zapalenie błony naczyniowej oka (uveitis), związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej (age-related macular degeneration-amd) oraz retinopatia cukrzycowa (diabetic retinopathy -DR), VAP-1 może stanowić cel terapeutyczny. Jak wykazano, VAP-1 odgrywa istotną rolę nie tylko w patogenezie ziarniniaka ropotwórczego, ale także w rozwoju i progresji chorób nowotworowych spojówki tj. m.in. chłoniak. W tych przypadkach również rozważa się możliwość wykorzystania cząsteczki VAP-1 jako celu terapeutycznego. Specyficzna struktura oka pozwala na zastosowanie nieinwazyjnych, optycznych metod obrazowania w celu wczesnego wykrycia zmian w naczyniach dna oka. Ze względu na fakt, że w stanach fizjologicznych, na powierzchni komórek śródbłonka naczyń nie stwierdza się obecności VAP-1, ale dopiero w warunkach stanu zapalnego, cząsteczka ta może być wykorzystana do tych celów. Według autorów, metody obrazowania molekularnego mogą zastąpić, zwłaszcza w diagnostyce wczesnych stadiów choroby, stosowane in vitro badania immunohistochemiczne i PCR (polymerase chain reaction). W molekularnych badaniach obrazowych in vivo proponuje się wykorzystanie znakowanych jodem przeciwciał monoklonalnych przeciwko VAP-1. Obecnie, w diagnostyce chorób o podłożu zapalnym, naczyniowe białko adhezyjne 1 jest rozważane jako potencjalny cel badań obrazowych przeprowadzanych techniką pozytonowej tomografii emisyjnej - PET (positron emission tomography). Autorzy prezentowanego artykułu mając na uwadze właściwości VAP-1 oraz wyniki badań doświadczalnych i klinicznych uważają, że cząsteczka ta może stanowić nowy kierunek strategiczny w diagnostyce i leczeniu chorób oczu o etiologii zapalnej, a także nowotworów tego regionu. Według: Luo W, Xie F, Zhang Z, Sun D. Vascular adhesion protein 1 in the eye. Journal of Ophthalmology. 2013; doi. org/ /2013/ Zofia Stasik Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej Centrum Onkologii, Oddział w Krakowie Podwyższony poziom galaniny u kobiet z cukrzycą ciężarnych Galanina (Gal) jest szeroko rozpowszechnionym neuropeptydem występującym w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym oraz w tkankach obwodowych. Galanina wykazuje bardzo szeroki zakres aktywności biologicznej, wpływa m.in. na układ sercowo-naczyniowy, sekrecje insuliny, motorykę przewodu pokarmowego i łaknienie. W ostatnich latach coraz więcej badań poświęconych jest zależności pomiędzy galaniną a homeostazą glukozy. Okazuje się, że peptyd ten hamuje glukozę stymulując wydzielanie insuliny a także reguluje ilość krążącej glukozy poprzez obniżanie insulinooporności. Dotychczasowe doniesienia wskazują na podwyższone stężenie galaniny u osób z cukrzycą, zarówno typu 1 jak i 2. Ze względu na brak jest informacji na temat poziomu galaniny u kobiet z cukrzycą ciężarnych autorzy pracy postanowili wykonać takie oznaczenie w tej grupie chorych. W badaniu udział wzięło 40 kobiet (20 ze zdiagnozowaną cukrzycą ciężarnych i 20 bez cukrzycy). Z badania wyłączone zostały kobiety ze stanem przedrzucawkowym bądź innymi powikłaniami, za wyjątkiem cukrzycy. Badania obejmowały: doustny test obciążenia glukozą, pozwalający na potwierdzenie obecności cukrzycy, stężenie glukozy, insuliny, HbA1c oraz stężenie galaniny. Dodatkowo u każdej z uczestniczek badania wyliczone zostało BMI. Przeprowadzone badanie wykazało statystycznie wyższe stężenie galaniny w grupie kobiet w ciąży powikłanej cu- 80

3 krzycą w porównaniu do kobiet ciężarnych bez cukrzycy (p<0,001). Dodatkowo w grupie kobiet z cukrzycą zaobserwowano znamienne zależności pomiędzy poziomem galaniny a stężeniem glukozy (p<0,001) oraz pomiędzy poziomem galaniny a BMI (p=0,008). W grupie tej nie odnotowano jednak zależności pomiędzy galaniną a insuliną oraz galaniną a HbA1c. Wśród kobiet bez cukrzycy ciężarnych żadne zależności pomiędzy galaniną a pozostałymi parametrami nie zostały odnotowane. Na podstawie wyników badań autorzy pracy wysnuli wniosek, że stężenie galaniny jest związane z poziomem glukozy w grupie kobiet z cukrzycą ciężarnych. Szczegółowe badania, przeprowadzone na większej liczbie pacjentek są jednak niezbędne do wyjaśnienia roli galaniny w patomechanizmie cukrzycy ciężarnych. Według: Fang P, Bo P, Shi M, Yu M, Zhang Z. Circulating galanin levels are increased in patients with gestational diabetes mellitus. Clin Biochem. 2013; 46(9): Katarzyna Gawlik Zakład Diagnostyki Katedry Biochemii Klinicznej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie Cytokeratyna 19-2G2, nowy fragment cytokeratyny 19 w surowicy, sygnalizujący bardziej agresywny przebieg choroby i gorsze rokowanie pacjentek z rakiem piersi Obecnie szereg biologicznych markerów nowotworowych jest badanych pod kątem przydatności w rozpoznawaniu chorób we wczesnych stadiach zaawansowania, wykrywania wznowy miejscowej lub odległych przerzutów u leczonych pacjentów, oraz przewidywania odpowiedzi lub oporności na leczenie. Antygen karcinoembrionalny (CEA) i CA 15.3 są powszechnie dostępnymi w praktyce klinicznej markerami nowotworowymi raka piersi. CEA, glikoproteina błon komórkowych, występuje w prawidłowych komórkach błony śluzowej i ulega nadekspresji w licznych gruczolakorakach, m. in. okrężnicy, odbytu, piersi, trzustki i płuca, jest uznawany za jeden z najbardziej klinicznie użytecznych markerów nowotworowych. CA 15.3, mucynopodobna glikoproteina błonowa należąca do dużej rodziny glikoprotein kodowanych przez gen MUC 1, jest uważana za reprezentatywny marker nowotworowy dla raka piersi. Jednakże aktualne wytyczne ASCO i NCCN nie zalecają stosowania CA 15.3 ani CEA w badaniach przesiewowych, rozpoznawaniu i określaniu stopnia zaawansowania choroby oraz prowadzenia obserwacji w celu wykrywania wznowy po leczeniu pierwotnym lub do oceny odpowiedzi na leczenie z powodu braku wystarczających dowodów potwierdzających przydatność omawianych markerów. Cytokeratyna 19 (CK-19), składnik cytoszkieletu, wykazująca ekspresję w prawidłowych i zmienionych nowotworowo komórkach nabłonkowych, jest wykrywana zarówno we wczesnym jak i rozsianym raku piersi. CK19-2G2, nowy, jeden z uwalnianych do krążenia fragmentów cytokeratyny 19, który został zidentyfikowany zarówno przez przeciwciała CK19-2G2 jak i CK19-5H2, jest uważany za jeden z najbardziej czułych markerów nowotworowych dla raka płuca, nawet lepszy od CYFRA 21.1, innego fragmentu CK-19 uwalnianego do krwi u pacjentów z rakiem płuca. Autorzy pracy zbadali związek między poziomem CK19-2G2 w surowicy a CEA, CA 15.3 i kliniczno patologicznymi cechami nowotworu oraz ocenili prognostyczne znaczenie badanego markera w raku piersi. Badaniem objęto 417 pacjentek z rakiem piersi, w tym 54 pacjentki z rakiem przewodowym in situ (DCIS), 249 z rakiem piersi w I III stadium zaawansowania (primary breast cancer, PBC), 114 z rakiem piersi z przerzutami (metastatic breast cancer, MBC). Jako grupę kontrolną włączono do badania 81 zdrowych i 21 kobiet z łagodnymi chorobami piersi. Pomiar CK19-2G2 przeprowadzono metodą chemiluminescencyjną (CLIA) z użyciem dwóch przeciwciał monoklonalnych: CK19-2G2 (CK19 aa ) i CK19-5H2 (CK19 aa ). CEA i CA 15.3 oznaczono metodą CLIA. Jako wartość odcinającą dla CK19-2G2 przyjęto 2 mu/ml, zaś dla CEA i CA 15.3 odpowiednio: 5 ng/ml i 30 U/ml. Poziomy CK19-2G2 w surowicy pacjentek z rakiem piersi były istotnie wyższe aniżeli w grupie zdrowych kobiet (p < 0,001) i osób z łagodnymi chorobami piersi (p<0,001). Ponadto, stężenia badanego markera były istotnie wyższe także w surowicy pacjentek z przerzutowym rakiem piersi (MBC) niż w grupach osób w stadium I III (PBC) (p = 0,007) i in situ (DCIS) (p = 0,002). Odsetek podwyższonych wyników CK19-2G2 w stopniu zaawansowania klinicznego I, II, III oraz w raku piersi z przerzutami wynosił odpowiednio 5,4%, 11,9%, 29,5% i 71%. W pierwotnym raku piersi, czułość diagnostyczna wyników oznaczeń CK19-2G2 (12,2%) była równie wysoka jak CEA (11,9%) i CA 15.3 (12,6%), zaś w rozsianym raku piersi prawie tak wysoka jak czułość diagnostyczna CA Podwyższone poziomy CK19-2G2 w surowicy ( 2 mu/ml) częściej obserwowano u pacjentek w III stadium zaawansowania klinicznego (p < 0,001), z guzami 2 cm (p = 0,020), z zajętymi pachowymi węzłami chłonnymi (p = 0,019) i dodatnim statusem HER2 (p = 0,006). Analiza jednoczynnikowa wykazała, że pacjentki postmenopauzalne, z guzami 2 cm, zajętymi pachowymi węzłami chłonnymi, ujemnym statusem receptorów estrogenowych, dodatnim statusem HER2 i wysokimi poziomami CK19-2G2 w surowicy miały istotnie krótsze czasy przeżycia bezobjawowego i całkowitego. Analiza wieloczynnikowa dowiodła, że jedynie wysokie poziomy CK19-2G2 w surowicy ( 2 mu/ ml), jak i stan pachowych węzłów chłonnych są niezależnymi czynnikami prognostycznymi u pacjentek z rakiem piersi. Podsumowując, CK19-2G2 może być niezależnym czynni- 81

4 kiem prognostycznym i markerem przydatnym w wykrywaniu przerzutów u pacjentek z rakiem piersi. Według: Kong Y, Wang J, Liu W, Chen Q, Yang J, et al. Cytokeratin19-2g2, a novel fragment of cytokeratin19 in serum, indicating a more invasive behavior and worse prognosis in breast cancer patients. PLOS ONE 2013; 8(2): e doi: /journal.pone Jadwiga Tarapacz Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej Centrum Onkologii, Oddział w Krakowie Endoglina, VEGF i jego receptor jako wskaźniki obecności przerzutów u chorych na raka trzonu macicy W krajach rozwiniętych, do najczęstszych nowotworów złośliwych narządu rodnego należy rak trzonu macicy. U większości chorych wykrywany jest we wczesnych stopniach zaawansowania choroby, jednak w niewielkiej grupie chorych już w momencie diagnostyki, występują przerzuty, które należą do złych czynników prognostycznych. Stosowane obecnie wskaźniki sugerujące obecność przerzutów charakteryzują się niską czułością diagnostyczną, czego efektem jest duża liczba operacji. Pomocne w ocenie zaawansowania nowotworu wydają się być wskaźniki angiogenezy czyli procesu powstawania nowych naczyń warunkujących wzrost guza i możliwość powstawania przerzutów. Kluczową rolę w tym względzie odgrywa cytokina VEGF - naczyniowo śródbłonkowy czynnik wzrostu, której wartość prognostyczną potwierdzono w licznych badaniach u chorych na raka piersi, jajnika i szyjki macic. Niekorzystnym czynnikiem rokowniczym w przebiegu nowotworów o różnej lokalizacji jest również endoglina (ENG lub CD105) - glikoproteina, występującą m.in. na powierzchni komórek śródbłonkowych. Autorzy pracy badali związki pomiędzy przedoperacyjnymi stężeniami VEGF, sflt1 (receptora R1 VEGF) i CD105 oraz ekspresją VEGF, FLT1, KDR (receptora R2 VEGF) i CD105 a obecnością przerzutów u chorych na raka trzonu macicy. Badaniami objęto 80 chorych z potwierdzonym rakiem trzonu macicy. Krew na badań pobierano przed operacją, a surowicę do dnia wykonania oznaczenia przechowywano zamrożoną w temp. 70 C. Do oznaczeń stężenia VEGF, sflt1 i CD105 w surowicy krwi wykorzystano zestawy firmy R&D Systems, Minneapolis, MN. Analizując badaną grupę chorych, autorzy wykazali istotnie wyższe stężenia VEGF u chorych z potwierdzonymi przerzutami, natomiast pomiędzy grupami chorych wydzielonymi ze względu na obecność przerzutów nie stwierdzano istotnych różnic w stężeniach sflt1 i CD105. W analizach statystycznych, w których uwzględniono stopień złośliwości histologicznej (G), u chorych ze stopniem złośliwości G1, wykazano istotnie wyższe stężenia VEGF i sflt1 w grupie chorych z potwierdzonymi przerzutami w porównaniu do chorych z tym samym stopniem złośliwości, ale bez przerzutów. Podobne zależności obserwowano dla stężeń VEGF u chorych ze stopniem złośliwości histologicznej G2. Autorzy wykazali również zależność pomiędzy wielkością stosunku VEGF do jego receptora sflt1 a obecnością przerzutów, u chorych bez przerzutów wartość VEGF/sFLT1 była istotnie niższa w porównaniu do wartości u chorych z przerzutami. Mediana stężeń VEGF/sFLT1 nie korelowała ze stopniem złośliwości histologicznej jak również ze stopniem nacieku myometrium. Podobnie, stężenia pozostałych badanych parametrów nie korelowały ze stopniem naciekania myometrium. Stężenia receptora VEGF - sflt1, korelowały z wiekiem chorych. W pracy wykazano również korelacje pomiędzy stężeniami sflt1 i CD105. W badanej grupie chorych, autorzy nie wykazali żadnej zależności pomiędzy ekspresją VEGF, FLT1, KDR i CD105 a analizowanymi parametrami kliniczno-patologicznymi. Z badanych parametrów tylko stężenia VEGF były niezależnym czynnikiem predykcyjnym, wskazującym na obecność przerzutów u chorych na raka trzonu macicy. Reasumując: w pracy wykazano zależność pomiędzy przedoperacyjnymi stężeniami VEGF a obecnością przerzutów u chorych na raka trzonu macicy. Autorzy pracy wskazują na konieczność dalszych badań dotyczących klinicznej użyteczności oznaczeń stężeń VEGF. Według: Saarelainen SK, Staff S, Peltonen N, Lehtimäki T, Isola J, Kujala PM, Vuento MH, Mäenpää JU. Endoglin, VEGF, and its receptors in predicting metastases in endometrial carcinoma. Tumour Biol 2014 Jan 14. [Epub ahead of print] Maria Kowalska Zakład Markerów Nowotworowych Centrum Onkologii-Instytut, Warszawa Ekspresja receptora peptydu uwalniającego gastrynę w raku płuca GRP /gastrin realeasing peptide/ to bombezyno-podobny peptyd uwalniający gastrynę pełniący funkcje czynnika wzrostu, którego ekspresję stwierdzono w neuroendokrynnych komórkach płuc. Jak wykazano jest potencjalnym mitogenem prawidłowych i neoplastycznych komórek, uczestniczy zarówno w procesach deregulacji wzrostu jak i karcinogenezie. Funkcje wykonawcze GRP pełni za pośrednictwem receptora należącego do rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G. W glejakach, nowotworach stercza, jelita grubego, głowy i szyi oraz w raku płuc potwierdzono występowanie zaburzeń w regulacji połączeń GRP/GRPR. Uważa się, że stymulacja GRP prowadzi do zwiększonego 82

5 uwalniania proligandów receptora dla naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) w procesie zależnym od metaloproteinaz oraz uczestniczy w aktywacji EGFR jak i szlaków sygnałowych zależnych od kinaz białkowych aktywowanych mitogenami. W opinii badaczy zablokowanie EGFR przez inhibitory kinazy tyrozynowej specyficznej dla EGFR również blokuje aktywacje kinaz białkowych aktywowanych przez mitogen GRP, co wskazuje, że GRP aktywuje kinazy białkowe aktywowane mitogenami pierwotnie poprzez EGFR. Ostatnie badania potwierdziły udział zarówno EGF jak i GRP w stymulowaniu proliferacji komórek niedrobnokomórkowego raka płuc, oraz fakt, że zablokowanie ich receptorów (EGFR i GRPR) prowadzi do śmierci komórek. Co więcej, podawanie antagonistów GRPR łącznie z inhibitorami kinaz tyrozynowych EGFR wykazuje addytywny efekt cytotoksyczny. W pracy badano ekspresję GRPR w drobnokomórkowym i niedrobnokomorkowym raku płuca, aby sprawdzić ewentualną możliwość wykorzystania GRPR jako punktu uchwytu dla leków ukierunkowanych molekularnie. Ekspresję GRPR oceniano metodą immunohistochemiczną w materiale pobranym od 200 chorych na niedrobnokomórkowego raka płuc oraz u 38 chorych na raka drobnokomórkowego wykorzystując królicze poliklonalne przeciwciało OPA Badania wykazały, że procent komórek wykazujących ekspresję GRPR w obu grupach był zbliżony: w niedrobnokomorkowym raku płuca wynosił 62,5%, a w drobnokomórkowym 52,6%. W niedrobnokomórkowym raku płuca (NDRP) obserwowano słabą zależność nasilenia ekspresji receptora z klinicznym stadium zaawansowania nowotworu. W I i II zaawansowania u 62,2% stwierdzano brak ekspresji GRPR, u 24,3% -słabą ekspresję, u 13,5% - umiarkowaną ekspresje GRPR, w III stopniu zaawansowania brak ekspresji potwierdzono u 34%, słabą ekspresję u 52,8%, umiarkowaną u 3,8% a silną u 9,4%, a w IV stopniu zaawansowania NDRP: brak ekspresji wykazano u 32,4%, słabą u 42,2%, umiarkowaną u 18,6% a silną u 6,9%. W raku drobnokomórkowym ze względu na małą liczebność chorych z ograniczoną postacią nowotworu, ekspresję GRPR oceniano głównie w grupie chorych z uogólnioną postacią nowotworu. U 43% stwierdzono brak ekspresji, u 35% -słabą, u 16,2% - umiarkowaną, a u 5,4% silną ekspresję GRPR. W pracy udokumentowano ponadto brak zależności pomiędzy nasileniem ekspresji GRPR a typem histologicznym nowotworu. Słabą, umiarkowaną i silną ekspresję GRPR wykazano odpowiednio u 42%, 16% i 10% chorych na gruczolakoraka, 40,8%, 11,3%, i 4,2% chorych na raka płaskonabłonkowego, 41,4%, 10,3% i 6,9% chorych na raka wielkokomórkowego oraz 34,2%, 15,8% i 2,6% chorych na raka drobnokomórkowego. Z przeprowadzonych badań wynika, że oprócz chorych w zaawansowanym stadium nowotworu, także w gruczolakorakach najczęściej obserwuje się nadekspresję GRPR. W opinii autorów te grupy chorych mogą być potencjalnymi kandydatami do terapii celowanych. W kaskadzie przekazywania sygnałów, w komórkach raka płuca, GRPR wchodzi w interakcje ze szlakiem sygnałowym EGFR zwiększając uwalnianie proligandów EGFR, które mogłyby promować rozwój nowotworu u chorych u których występują mutacje EGFR. Ustalenie profilu molekularnego u chorych z rakiem płuca ze wzmożoną ekspresją GRPR wymaga jednak dalszych badań. Według: Mattei J, Achcar RD, Cano CH, Macedo BR, Meurer L, Batle BS, Groshong SD, Kulczynski JM, Roesler R, Dal Lago L, Brunetto AT, Schwartsmann G: Gastrin-Releasing Peptide Receptor expression in lung cancer. Arch Pathol Lab Med 2014;138: ; doi: /arpa OA. Ewa Wójcik Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej Centrum Onkologii, Oddział w Krakowie Ocena statusu HER2 w raku piersi: całkowity wskaźnik pozytywności i trafność oceny metodą FISH i IHC w badaniach jednego ośrodka na przestrzeni 12 lat: badanie kontroli jakości. Ocena statusu receptora HER2 należy do standardowych badań u chorych na raka sutka od momentu wprowadzenia do leczenia zatwierdzonego przez FDA blokera tego receptora (Herceptin). Badanie receptora jest wykonywane na wycinkach tkankowych pobranych z materiałów operacyjnych lub w wycinkach z biopsji gruboigłowych zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi. Autorzy niniejszego doniesienia dokonali retrospektywnej analizy wyników oceny statusu receptora HER2 i amplifikacji jego genu w grupie 7714 chorych na raka piersi diagnozowanych w jednym ośrodku (Szpital Uniwersytecki w Zurychu) w okresie 12 lat, z uwzględnieniem zmieniających się metod badania i kryteriów oceny ich wyników zalecanych przez FDA (lata ) oraz ASCO/CAP ( ). W okresie od roku 2001 do 2004 badanie statusu receptora HER2 przeprowadzano metodą immunohistochemiczną (IHC) przy użyciu przeciwciała anty HER2 (klon CB11), a przypadki z ekspresją białka ocenioną na 2/3(+) weryfikowano techniką FISH, zgodnie z zaleceniami FDA. Badanie FISH wykonano również w wybranych przypadkach guzów z ekspresją białka ocenioną na 0/1(+). Ekspresję białka o nasileniu 3(+) (silną, ciągłą błonową reakcję w ponad 10% komórek raka) odnotowano w 22% przypadków; spośród nich jedynie w 69% guzów stwierdzono równocześnie amplifikację genu HER2. Badanie FISH w grupie guzów nie wykazujących ekspresji białka HER2 (odczyn IHC 0/1+) ujawniło amplifikację genu w 6% (19 z 328) przypadków. 83

6 W latach , gdy zgodnie ze standardami wyznaczonymi przez ASCO/CAP zastosowano odmienny klon przeciwciała (4B4) i wprowadzono zmodyfikowane kryteria oceny, odsetek przypadków wykazujących silną (3+) reakcję w badaniu IHC uległ obniżeniu do 12%; spośród nich amplifikację genu HER2 w badaniu FISH potwierdzono w 84% przypadków. Z badań ocenionych immunohistochemcznie na 0/1+ tylko w niespełna 1% przypadków stwierdzano amplifikację genu HER2. Zgodność pomiędzy badaniami IHC i FISH (wyłączając badania ocenione w IHC na 2+) wzrosła do 97%, w porównaniu z 84% w latach Różnice w zgodności wyników badania immunohistochemicznego ocenionego na stopień 3+ i oceny amplifikacji genu techniką FISH w latach i były znamienne statystycznie (p=0,004), podobnie jak różnica niezgodności pomiędzy reakcją 0/1+ i obecnością amplifikacji (p<0,001). Obniżenie odsetka przypadków z dodatnim wynikiem IHC na obecność białka HER2 z 21-26% do 11-14%, odpowiednio w latach 2003 i 2012, odnotowano również w dwóch innych doniesieniach (Bilous M, et al. Breast Cancer Res Treat 2012, Vergara-Lluri ME, et al. Mod Pathol 2012). Spadek ten może być także wynikiem wprowadzonych przesiewowych badań mammograficznych, umożliwiających wykrywanie wczesnych raków sutka, które rzadziej cechują się ekspresją receptora HER2. Przeprowadzone własne badania autorów artykułu i przegląd danych z piśmiennictwa dowodzą, że modyfikacja wytycznych dotyczących oceny statusu receptora HER2 odegrała istotną rolę w poprawie zgodności oceny statusu HER2 metodą IHC i FISH. Co ciekawe, wskaźnik pozytywności w metodzie FISH był stały przed i po wprowadzeniu zmodyfikowanych kryteriów ASCO. Na ocenę zgodności wyników omawianych badań wpłynęły również zalecenia mówiące, że zarówno analiza mikroskopowa wyników badań IHC, jak i badań FISH winna być dokonywana jedynie przez wyselekcjonowaną grupę patologów o dużym doświadczeniu w ocenie omawianych badań, co zmniejsza odsetek różnic wynikających z tzw. inter-observer variability. W artykule zwrócono również uwagę, że na uzyskanie niewłaściwych wyników duży wpływ mają czynniki tzw. przedanalityczne i analityczne, takie jak czas utrwalania materiału tkankowego, rodzaj zastosowanych środków utrwalających oraz czas odsłaniania antygenów. Niewłaściwe warunki utrwalania mogą skutkować zarówno fałszywie ujemnym wynikiem badania IHC, jak i wynikiem niejednoznacznym w przypadku, gdy ma miejsce nadmierne nasilenie odczynu wynikające z obecności prawidłowego białka HER2 (native protein). Wspomniane błędy w utrwalaniu materiału w mniejszym stopniu wpływają na wyniki badań FISH, dlatego w większym stopniu są one powtarzalne. Podsumowując, uzyskanie zgodności pomiędzy badaniami IHC i FISH jest możliwe jedynie w przypadku stosowania zautomatyzowanych procedur laboratoryjnych, dokładnego przestrzegania zaleceń ASCO/CAP i ograniczenia diagnozujących specjalistów do grupy osób o dużym doświadczeniu w ocenie omawianych badań. Ponadto konieczne jest stosowanie komercjalnie dostępnych, walidowanych przeciwciał, zachowanie odpowiednich warunków utrwalania oraz stałe szkolenie patologów biorących udział w badaniach, a także udział w krajowych i międzynarodowych programach kontroli jakości. Według: Varga Z, Noske A, Ramach C, Padberg B, Moch H: Assessment of HER2 status in breast cancer: overall positivity rate and accuracy by fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry in a single institution over 12 years: a quality control study. BioMed Central Cancer 2013, 13: 615. Anna Kruczak Zakład Patologii Nowotworów Centrum, Onkologii, Oddział w Krakowie Poziom bilirubiny całkowitej wśród młodych kobiet i mężczyzn: związek z czynnikami ryzyka chorób sercowo-naczyniowych Bilirubina to pomarańczowo-żółty barwnik będący końcowym produktem rozkładu hemu - podstawowego składnika krwinek czerwonych. Oznaczenie bilirubiny jest przydatne do oceny funkcji wątroby a także w diagnostyce niedokrwistości spowodowanej zwiększonym niszczeniem erytrocytów (niedokrwistości hemolitycznej). Bilirubina jest także jednym z podstawowych antyoksydantów, który poprzez unieczynnianie wolnych rodników tlenowych może zapobiec rozwojowi wielu schorzeń w tym miażdżycy i stanom zapalnym. W oparciu o wspomniane wyżej właściwości antyoksydacyjne bilirubiny sformuowany został cel badania polegający na ocenie ochronnego wpływu wysokich stężeń bilirubiny na rozwój chorób sercowo - naczyniowych. Dodatkowo autorzy pracy postanowili dokonać oceny zależności pomiędzy stężeniem bilirubiny a poziomem parametrów stresu oksydacyjnego. W badaniu udział wzięło 628 osób obu płci w przedziale wiekowym lat. Ocenie poddano stężenie bilirubiny całkowitej, parametry ryzyka sercowo-naczyniowego (m.in. hscrp, lipidogram, fibrynogen) oraz parametry stresu oksydacyjnego (TBARS, oxldl). Z badania wyłączone zostały osoby ze zdiagnozowanymi chorobami przewlekłymi (cukrzyca, schorzenia wątroby), a także osoby nadużywające alkoholu. W oparciu o wyniki bilirubiny całkowitej uczestnicy badania podzieleni zostali na dwie grupy. Do grupy pierwszej włączone zostały osoby z niskim stężeniem bilirubiny (mężczyźni 24 µmol/l; kobiety: 16,3 µmol/l). W drugiej grupie z kolei, znajdowały się osoby z wysokim stężeniem bilirubiny (mężczyźni >24 µmol/l; kobiety >16,3 µmol/l). W przeprowadzonym badaniu, z uwzględnieniem podziału 84

7 na osoby z niskim i wysokim stężeniem bilirubiny całkowitej, nie zaobserwowano różnic pomiędzy płciami w zakresie wagi ciała, wartością ciśnienia tętniczego ani profilu lipidowego. Mężczyźni z wysoką bilirubiną posiadali wyższe stężenia albuminy i kwasu moczowego (p<0,001) oraz niższe stężenie oxldl (p<0,05) podczas gdy kobiety z tej grupy wykazywały wyższe stężenia albuminy (p<0,05) i niższe TBARS (p<0,05). Wysokie stężenie bilirubiny u mężczyzn było niezależnie powiązane z wysokim stężeniem kwasu moczowego (p<0,05) i oxldl (p<0,001), natomiast u kobiet z TBARS (p<0,05). Po wystandaryzowaniu na lipidy wysoka bilirubina u mężczyzn pozostała w zależności z kwasem moczowym (p<0,001) i TBARS u kobiet (p<0,05). Dodatnia korelacja pomiędzy wysokim stężeniem kwasu moczowego a bilirubiną pozostaje w zgodzie z dotychczasowymi wynikami badań in vitro i in vivo, w których wykazano antyoksydacyjne właściwości kwasu moczowego, wywierające korzystny wpływ na układ sercowo-naczyniowy. Dodatkowo znane są również antyoksydacyjne właściwości albuminy, która wiążąc wolne rodniki tlenowe chroni przed zniszczeniem inne ważne molekuły biologiczne. Niniejsze badanie potwierdza tezę, że bilirubina poprzez swój antyoksydacyjny potencjał wykazuje działanie ochronne w stosunku do chorób sercowo-naczyniowych w grupie młodych kobiet oraz mężczyzn. Pozostaje tylko pytanie czy uzyskany efekt jest wynikiem działania samej bilirubiny czy tez sumarycznego wpływu bilirubiny oraz pozostałych dwóch antyoksydantów: albuminy i kwasu moczowego. Według: Stojanov M, Stefanovic A, Dzingalasevic G, Ivanisevic J, Miljkovic M, Mandic-Radic S, Prostran M. Total bilirubin in young men and women: association with risk markers for cardiovascular diseases. Clin Biochem 2013, 46(15): Katarzyna Gawlik Zakład Diagnostyki Katedry Biochemii Klinicznej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie 85