Analiza domowych przetworów s omy makowej (tzw. kompotów ). Cz Êç 2* wyznaczenie dawki LD 50 dla nieoczyszczonych i oczyszczonych próbek

Transkrypt

1 ARTYKU REDAKCYJNY E D I T O R I A L Medycyna Ârodowiskowa - Environmental Medicine 2012, Vol. 15, No. 4, Analiza domowych przetworów s omy makowej (tzw. kompotów ). Cz Êç 2* wyznaczenie dawki LD 50 dla nieoczyszczonych i oczyszczonych próbek The analysis of the home-made poppy straw extracts (so-called compote ). Part 2 estimation of the LD 50 dose for non-purified and purified samples Zofia Olszowy 1 (a, b, d, f), Rafa Celiƒski 2 (a, c, d, e, f), Rafa Skowronek 2 (e, f), ukasz Paprotny 3 (f) 1 Zak ad Diagnostyki Laboratoryjnej, Instytut Medycyny Pracy i Zdrowia Ârodowiskowego w Sosnowcu. Kierownik Zak adu: prof. dr hab. med. Z. Olszowy. Dyrektor IMPiZÂ: dr med. P.Z. Brewczyƒski 2 Katedra i Zak ad Medycyny Sàdowej i Toksykologii Sàdowo-Lekarskiej, Âlàski Uniwersytet Medyczny w Katowicach. Kierownik Katedry: p.o. dr med. Cz. Chowaniec. Rektor Uczelni: prof. dr hab. n. med. P. Ja owiecki 3 Zak ad Zdrowia Ârodowiskowego i Epidemiologii, Instytut Medycyny Pracy i Zdrowia Ârodowiskowego w Sosnowcu. Kierownik Zak adu: p.o. prof. dr hab. n. przyr. Jerzy Kwapuliƒski. Dyrektor IMPiZÂ: dr med. P.Z. Brewczyƒski (a) opracowanie koncepcji i za o eƒ (b) pozyskanie funduszy (c) przygotowanie materia u do badaƒ (d) badania laboratoryjne (e) opracowanie statystyczne (f) opracowanie tekstu i piêmiennictwa * Cz Êç 1 patrz piêmiennictwo [2] STRESZCZENIE Wst p: W poprzedniej pracy potwierdziliêmy obecnoêç zanieczyszczeƒ mikrobiologicznych, nieorganicznych i organicznych w domowych przetworach s omy makowej kompocie. Zanieczyszczenia te mogà wp ywaç na jego toksycznoêç, brak jednak odpowiednich badaƒ eksperymentalnych. Autorzy postanowili opracowaç metod oczyszczania kompotu oraz wyznaczyç i porównaç dawk LD 50 dla jego postaci oczyszczonej, nieoczyszczonej i standardowego roztworu morfiny. Materia i metody: Materia badawczy stanowi y wyciàgi ze s omy makowej dostarczone przez organy Êcigania. St enia opiatów w kompocie nieoczyszczonym oznaczono za pomocà wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprz onej ze spektrometrià mas (HPLC-MS) ml zabezpieczonego kompotu zosta o oczyszczone z balastu roêlinnego i innych zanieczyszczeƒ. LD 50 wyznaczono metodà Litchfielda-Wilcoxona w odniesieniu do morfiny. W doêwiadczeniu wykorzystano 36 samców szczurów Sprague-Dawley, w wieku 3 miesi cy, o masie cia a g. Zwierz tom podano jednorazowo drogà dootrzewnowà odpowiednie wyciàgi w trzech zró nicowanych dawkach. Wyniki: Obliczone dawki LD 50 ostrej toksycznoêci dootrzewnowej wynios y: dla wyciàgu nieoczyszczonego 83,8 mg/kg m.c.; dla wyciàgu oczyszczonego 51,9; dla roztworu chlorowodorku morfiny 61,1. Wnioski: Najni sza wartoêç LD 50 dla kompotu oczyszczonego Êwiadczy o jego wi kszej toksycznoêci ostrej wzgl dem kompotu nieoczyszczonego i roztworu morfiny. Opracowana metoda oczyszczania kompotu pozwala na redukcj zanieczyszczeƒ, dlatego mo e byç stosowana w badaniach doêwiadczalnych obu postaci narkotyku. S owa kluczowe: polska heroina, toksycznoêç ostra, zanieczyszczenia, szczur ABSTRACT Introduction: In the previous paper we confirmed the presence of microbiological, inorganic and organic pollutants in home-made preserves of the poppy straw extracts compote. These pollutants may influence its toxicity, however, are lacking of proper experimental studies. The authors have decided to develop the method of compote treatment and to determine and to compare LD 50 dose for its treated form, raw form and standard morphine solution. Materials and methods: The research material was poppy straw extracts delivered by law enforcement authorities. Concentration of opiates in raw compote was determined using the high-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (HPLC-MS). Secured compote (1000 ml) was cleaned from plant s ballast and other contaminations. LD 50 was determined according to Litchfield- Wilcoxon method with reference to morphine. In the research thirty six 3-months-old, g, male Sprague- Dawley rats were used. The animals were injected intraperitoneally once with appropriate extracts in three diversified doses. Results: Calculated LD 50 doses of acute intraperitoneal toxicity were: for the raw extract 83.8 mg/kg body weight; for treated extract 51.9; for morphine hydrochloride solution Conclusions: The lowest value of LD 50 for treated compote is attesting of its acute toxicity in comparison to the raw compote and morphine solution. The developed method of treating the compote allows for the reduction of pollutants, so it may be applied in the experimental research of both forms of drugs. Key words: Polish heroin, acute toxicity, impurities, rat Nades ano: Zatwierdzono do druku:

2 Medycyna Ârodowiskowa - Environmental Medicine 2012, Vol. 15, No WST P W ka dym przypadku nadu ywania substancji psychoaktywnej powinno dà yç si do ustalenia jej pe nej charakterystyki farmakologiczno-toksykologicznej. Jednym z elementów takiej oceny jest okre- Êlenie podstawowego wskaênika toksycznoêci ostrej, tzw. medialnej dawki Êmiertelnej (ang. median lethal dose, LD 50 ), tzn. obliczonej pojedynczej iloêci substancji, która powoduje Êmierç 50% badanych zwierzàt doêwiadczalnych, wyra onej w postaci masy substancji badanej przypadajàcej na jednostk masy badanego zwierz cia (najcz Êciej w mg/kg). Narkotykiem opiatowym charakterystycznym dla obszaru Europy Ârodkowej i Wschodniej, cieszàcym si mniejszà ni dawniej popularnoêcià, ale nadal obecnym na krajowym rynku narkotykowym, jest kompot nazywany równie polskà heroinà (domowe przetwory s omy makowej) [1]. Co zaskakujàce, pomimo d ugiej obecnoêci na rynku, narkotyk ten do tej pory nie zosta dostatecznie scharakteryzowany. W naszej poprzedniej pracy, w kompocie potwierdziliêmy obecnoêç zanieczyszczeƒ mikrobiologicznych, nieorganicznych i organicznych, tj. dro d aków Candida, zanieczyszczeƒ metalicznych, pestycydów oraz zanieczyszczeƒ lotnych [2]. Zanieczyszczenia te mogà wp ywaç na toksycznoêç ostrà kompotu, dlatego te, wobec braku danych eksperymentalnych na ten temat, postanowiliêmy najpierw opracowaç metod oczyszczania kompotu, a nast pnie wyznaczyç i porównaç ze sobà LD 50 dla kompotu oczyszczonego, nieoczyszczonego i standardowego roztworu morfiny. MATERIA I METODY Analiza kompotu nieoczyszczonego W badaniach wykorzystano domowe wyciàgi ze s omy makowej (81 dowodów rzeczowych), zebrane i po àczone w jednà uêrednionà prób kompotu o obj toêci 2000 ml. Materia ten by dostarczany do Katedry i Zak adu Medycyny Sàdowej i Toksykologii Sàdowo-Lekarskiej w Katowicach przez organy Êcigania, w zwiàzku ze wszcz ciem spraw karnych o naruszenie przepisów obowiàzujàcej ustawy o przeciwdzia aniu narkomanii. St enia opiatów w kompocie nieoczyszczonym oznaczono wysoce czu à i selektywnà metodà wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprz onej z detekcjà mas (HPLC-MS). Parametry kolumny oraz przedkolumny chromatograficznej prezentuje tabela I. Zastosowano system gradientowego przep ywu fazy ciek ej. Fazy ruchome oraz ich udzia procentowy przedstawiono w tabeli II. Detekcj badanego zwiàzku przeprowadzono za pomocà spektrometru masowego z pu apkà jonowà w opcji jonizacji w polu elektrycznym elektrosprej (ESI). Warunki pracy elektrospreju zawiera tabela III. Parametry walidacyjne dla alkaloidów kompotu i klomipraminy, która by- a substancjà wzorcowà, zaprezentowano w tabeli IV. Tab. I. Parametry kolumny oraz przedkolumny chromatograficznej Tab. I. Parameters of the chromatographic column and precolumn Parametry Kolumna Przedkolumna Nazwa Hypersil Hypersil Wype nienie BDS C-18 BDS C-18 D ugoêç 150 mm 20 mm Ârednica wewn trzna 2,1 mm 2 mm Ârednica ziaren wype nienia 5 µm 5 µm Tab. II. Udzia procentowy faz ruchomych w trakcie trwania analizy Tab. II. The percentage of mobile phases during analysis Faza A mrówczan amonu 0,05 mol/l Faza B 90% acetonitrylu + 10% fazy A Pr dkoêç przep ywu 0,3 ml/min Czas [min] Faza A [%] Faza B [%] Tab. III. Warunki pracy elektrospreju Tab. III. Working conditions of the electrospray Przep yw azotu gazu noênego/jonizujàcego Gaz pomocniczy Napi cie ig y rozpylacza 60 p.s.i. 0.0 p.s.i. 4,50 kv Temperatura kapilary 200 C Napi cie kapilary 10,5V Napi cie fragmentatora Zakres analizowanych mas Tryb jonizacji 30V m/z dodatnia

3 92 Medycyna Ârodowiskowa - Environmental Medicine 2012, Vol. 15, No. 4 Tab. IV. Parametry walidacyjne dla alkaloidów kompotu i klomipraminy Tab. IV. Validation parameters for alkaloids of the compote and clomipramine Kryterium Ksenobiotyk Zakres liniowoêci LOQ LOD powtarzalnoêç Precyzja odtwarzalnoêç Bias/ dok adnoêç Odzysk RSD Morfina 6-MAM Kodeina Papaweryna Noskapina Narceina Tebaina Klomipramina 0,5 10 0,5 0,02 0,02 3,36 12,28% 3,78 15% 1,25 5,60% 1,15 2,2 1,13 2,6 0,96 2,1 1,45 4,26% 1,15 4,48% 5,45 10,85% 5,65 12,20% 2,39 7,15% 2,2 3,78 1,34 2,1 0,98 2,5 2,15 5,25% 2,33 6,17% 3,45 9,78% 3,60 12,20% 2,15 7,80% 1,17 4,3 0,6 9,12 2,7 9,18 1,55 11,08% 3,10 10,7% 72,1559,26% 74,46518% 93,3355,45% 86,2552,5 91,7753,1 91,753,46 91,7855,55% 95,065 8,93% 4,34 12% 3,88 9,65% 3,15 18% 3,42 9,9 2,8 9,78 3,5 7,78 2,12 4,48% 6,58 13,63% Procedura oczyszczania kompotu 1000 ml zabezpieczonego kompotu zosta o oczyszczone z balastu roêlinnego oraz zanieczyszczeƒ organicznych i nieorganicznych, w tym poprodukcyjnych. Proces dalszego oczyszczania prowadzono w dwóch etapach: I za pomocà kolumnowej chromatografii cieczowej, wykorzystujàc tlenek glinu i Silica gel jako faz sta à oraz mieszanin metanolu i wody, w proporcjach od 9:1 do 1:9, jako faz ciek à; II z wykorzystaniem metody ekstrakcji na fazie sta ej (ang. solid phase extraction SPE), przy u yciu aparatu pró niowego firmy J.T. Baker (USA) z pompkà wodnà. Zastosowano kolumny Bond Elut Certify (USA), których wype nienie sk ada o si z niepolarnego C-8 oraz silnego wymieniacza kationowego (SCX). Przy zastosowaniu tego rodzaju wype nienia analizaty sà silnie absorbowane poprzez kombinacj dwóch mechanizmów oddzia ywania: kulombowskiego i hydrofobowego, co pozwoli o w wydajniejszy sposób pozbyç si zanieczyszczeƒ. St enia opiatów w czasie procesu oczyszczania wyciàgu ze s omy makowej by y na bie àco monitorowane, w celu sprawdzenia ich iloêci, za pomocà HPLC-MS. Aby umo liwiç porównanie obu postaci narkotyku w kontekêcie wp ywu zanieczyszczeƒ, kompot oczyszczony by zat any a do momentu uzyskania takich st eƒ g ównych substancji psychoaktywnych, jak w kompocie nieoczyszczonym. Zanieczyszczenia kompotu identyfikowano i analizowano iloêciowo wed ug metodyki przedstawionej w naszej poprzedniej pracy [1]. Wyznaczanie dawki LD 50 Do doêwiadczenia wykorzystane zosta y samce szczurów szczepu Sprague-Dawley (SPD), w wieku 3 miesi cy, o masie cia a g. Zwierz ta pochodzi y z Centralnej Zwierz tarni DoÊwiadczalnej Âlàskiej Akademii Medycznej w Katowicach (CZD ÂAM), gdzie przeprowadzono eksperyment. Zwierz ta przebywa y w pomieszczeniach, w których przez ca y czas zachowane by y nast pujàce warunki: temperatura C; wzgl dna wilgotnoêç powietrza 50 60%; wymiana powietrza 12 razy/godz.; Êwiat o sztuczne lux; rytm Êwietlny regulowany 12/12 godz. Zwierz ta karmiono paszà granulowanà Murigram. Szczury mia y wolny dost p do wody pitnej. W czasie doêwiadczenia zwierz ta przebywa y w klatkach hodowlanych po 6 10 sztuk. Badania przeprowadzono po uzyskaniu zgody lokalnej Komisji Etycznej do Spraw DoÊwiadczeƒ na Zwierz tach. LD 50 wyznaczono dla dwóch wersji przygotowanych wyciàgów ze s omy makowej nieoczyszczonego i oczyszczonego oraz dla czystego roztworu chlorowodorku morfiny metodà Litchfielda i Wilcoxona, w modyfikacji Sokala [3, 4]. Przygotowany dla potrzeb eksperymentu roztwór wzorcowy morfiny zawiera 8,56 mg chlorowodorku morfiny w 1 ml soli fizjologicznej. Badania wykonano na 36 szczurach, przy czym 4 zwierz ta stanowi y grup kontrolnà. Odpowiednie wyciàgi, a w grupie kontrolnej sól fizjologicznà, podano jednorazowo drogà dootrzewnowà w3 zró nicowanych dawkach, w odniesieniu do morfiny (tab. V). Droga dootrzewnowa by a stosowana ze wzgl du na bardzo podobne wch anianie, jak przy podaniu do ylnym, które jest najcz stszym sposobem przyjmowania kompotu przez narkomanów. Stosunkowo g sta konsystencja kompotu i ma y kaliber naczyƒ ylnych szczurów sprzyjajà powik aniom zakrzepowym, które mog yby zak óciç przebieg do- Êwiadczenia, dlatego te zdecydowano si na drog

4 Medycyna Ârodowiskowa - Environmental Medicine 2012, Vol. 15, No dootrzewnowà. Mierzono liczb szczurów, które zmar y w ciàgu 48 godzin. Zwierz ta, które prze y y, by y dekapitowane i poddawane sekcji zw ok. Tab. V.Dawki kompotu i roztworu morfiny zastosowane w doêwiadczeniu zwierz cym Tab. V.Doses of the compote and morphine solution used in the animal experiment Substancja Dawka [mg/kg m.c.] Kompot nieoczyszczony 35; 70; 105 Kompot oczyszczony 25; 50; 75 Chlorowodorek morfiny 30; 60; 90 WYNIKI Metoda HPLC-MS umo liwi a oznaczenie narkotycznych zwiàzków organicznych w kompocie nieoczyszczonym, a tak e monitorowanie ich st enia podczas procesu zat ania kompotu oczyszczonego. Wyniki analizy iloêciowej uêrednionej próby kompotu przedstawiono w tabeli VI. Tab. VI. Wyniki analizy iloêciowej g ównych zwiàzków organicznych w kompocie nieoczyszczonym Tab. VI. Results of quantitative analysis of the main organic compounds in the raw compote Substancja St enie [mg/ml] Morfina 8,56 6-monoacetylomorfina 2,73 Kodeina 1,25 Papaweryna 0,23 Noskapina 0,30 Narceina 1,69 Tebaina 0,07 Opracowany schemat oczyszczania wyciàgu ze s omy makowej pozwoli na uzyskanie klarownego, jasno ó tego p ynu o znacznie zredukowanej iloêci zanieczyszczeƒ. W pe ni wyeliminowano pestycydy, WWA (za wyjàtkiem benzo(a)pirenu w iloêciach Êladowych) i rozpuszczalniki organiczne (za wyjàtkiem metanolu w iloêciach Êladowych). Wyniki oznaczeƒ metali przed i po oczyszczeniu przedstawiono w tabeli VII. Wyznaczona dla szczurów szczepu SPD medialna dawka Êmiertelna toksycznoêci ostrej dootrzewnowej (LD 50 ) dla poszczególnych rodzajów wyciàgów wynios a: dla wyciàgu nieoczyszczonego 83,8 mg/kg m.c., przy przedziale ufnoêci <66,9 104,8> z prawdopodobieƒstwem a40,05; dla wyciàgu oczyszczonego 51,9 mg/kg m.c., przy przedziale ufnoêci <47 64,45> z prawdopodobieƒstwem a40,05; dla wzorcowego roztworu chlorowodorku morfiny 61,1 mg/kg m.c., przy przedziale ufnoêci <48,88 76,38> z prawdopodobieƒstwem a40,05. DYSKUSJA Kompot jest mieszaninà substancji psychoaktywnych: morfiny, kodeiny, 6-monoacetylomorfiny (6-MAM), noskapiny, narceiny, papaweryny, tebainy i innych [5]. Sk ad jakoêciowy i iloêciowy narkotyku jest zró nicowany i zale y od jakoêci materia u wyj- Êciowego, schematu i warunków produkcji oraz warunków przechowywania [6]. Sybirska i wsp. w analizowanym przez nich kompocie stwierdzili nast pujàce st enia substancji psychoaktywnych: morfina 1,2 49,7 mg/ml, 6-monoacetylomorfina 0 2,5 mg/ml, heroina 0,2 2,1 mg/ml, kodeina 0,2 3,9 mg/ml, acetylokodeina 0 12,5 mg/ml, papaweryna 0,2 4,7mg/ml, Tab. VII. ZawartoÊç metali zidentyfikowanych w wyciàgach przed i po oczyszczeniu Tab. VII. Concentration of the metals identified in the extracts before and after purification Zn Fe Mn Pb Cd Cr Ni Cu As ppm ppm ppm ppb ppb ppb ppb ppb ppb 1 30,661 0,700 0,221 28,7 14,40 36,0 637,3 195,8 11,4 2 0,252 0, ,5 5,94 19,6 140,3 170,3 9,7 3 0,05 0, ,002 0,0002 0,002 0,002 0,02 0, metale oznaczone w kompocie nieoczyszczonym metals quantified in the raw compote 2 metale oznaczone w kompocie oczyszczonym metals quantified in the treated compote 3 granica oznaczalnoêci (ppm) limit of quantification (ppm)

5 94 Medycyna Ârodowiskowa - Environmental Medicine 2012, Vol. 15, No. 4 noskapina 0 0,2 mg/ml [7]. St enia opiatów i innych substancji psychoaktywnych w materiale analizowanym przez autorów by y podobne (tab. VI), co potwierdza jego reprezentatywnoêç. Opracowana przez nas metoda oczyszczania kompotu pozwoli a na znacznà redukcj zawartych w nim zanieczyszczeƒ, dlatego mo e byç z powodzeniem stosowana w badaniach doêwiadczalnych obu postaci narkotyku. Wyznaczone dawki LD 50 dla kompotów : nieoczyszczonego i oczyszczonego, a tak e wzorcowego roztworu morfiny okaza y si ró ne. Najni sza wartoêç LD 50 dla kompotu oczyszczonego (51,9 mg/kg m.c.) Êwiadczy o wi kszej toksycznoêci ostrej tej substancji wzgl dem kompotu nieoczyszczonego (83,8 mg/kg m.c.) i roztworu morfiny (61,1 mg/kg m.c.). Prawdopodobnie decydujàce znaczenie odgrywajà tu zidentyfikowane wczeêniej zanieczyszczenia przed-, Êród i poprodukcyjne, które mogà wp ywaç na parametry toksykokinetyczne i tym samym modyfikowaç efekty ostrego nara enia na narkotyk. Zmianom mogà ulegaç procesy wch aniania, dystrybucji, biotransformacji i eliminacji ksenobiotyku, co ostatecznie przek ada si na zwi kszenie lub zmniejszenie jego biodost pnoêci, a tym samym toksycznoêci. W innym eksperymencie, przeprowadzonym w Katedrze i Zak adzie Medycyny Sàdowej i Toksykologii Sàdowo-Lekarskiej w Katowicach na tej samej uêrednionej próbie kompotu, wyznaczono dawk LD 50 dla kompotu z dodatkiem prometazyny (0,25 mg/ml) leku z grupy pochodnych fenotiazyny, cz sto dodawanego przez narkomanów celem wzmocnienia wra eƒ narkotycznych i z agodzenia dzia aƒ niepo àdanych, przede wszystkim wymiotów [8]. Wynios a ona 57,3 mg/kg m.c., czyli kompot z dodatkiem prometazyny cechowa a mniejsza toksycznoêç ostra ni kompot oczyszczony, ale wi ksza ni standardowy roztwór morfiny i kompot nieoczyszczony. Wzbogacenie kompotu prometazynà istotnie zmniejszy o szybkoêç wch aniania i wyd u y o czas eliminacji jednoczeênie podanych opiatów. Wyznaczone wskaêniki LD 50 zosta y wykorzystane przez nas do wyliczeƒ dawek do dalszych badaƒ eksperymentalnych kompotu w modelu szczurzym, tzn. badaƒ parametrów toksykokinetycznych dla poszczególnych rodzajów wyciàgów (1/ 2 dawki LD 50 ) oraz nara enia na kompot w przebiegu 28-dniowego doêwiadczenia (1/ 4 dawki LD 50 ), których wyniki zaprezentujemy w kolejnych pracach. WYKAZ PIÂMIENNICTWA 1. Raport Krajowy Sytuacja narkotykowa w Polsce. Krajowe Biuro ds. Przeciwdzia ania Narkomanii, Warszawa Celiƒski R., Korczyƒska M., Nowicka J. i wsp.: Analiza domowych przetworów s omy makowej (tzw. kompotów ). Cz Êç 1 zanieczyszczenia mikrobiologiczne, organiczne i nieorganiczne. Alkoholizm i Narkomania 2010, 4, Litchfield J.T., Wilcoxon F.A.: A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J Pharmacol Exp Therapeut 1947, 95, Sokal J.A., Knapek R., Majka J. i wsp.: Zakres i metody badaƒ toksycznoêci substancji chemicznych w przemyêle. Wydawnictwo IMP, ódê 1990: Kulikowska J.: Badania nad eliminacjà alkaloidów opium u osób leczonych oêrodku detoksykacyjnym. Rozprawa doktorska. Âlàska Akademia Medyczna w Katowicach, Katowice Geschwinde T.: Rauschdrogen: Marktformen und Wirkungsweisen. Springer-Verlag, Heidelberg 2003: Sybirska H., Nasi owski W., Zawitaj B. i wsp.: Ocena toksykologiczna zjawiska narkomanii na podstawie wyników badaƒ analitycznych moczu pacjentów oêrodka detoksykacyjnego. Zeszyty Problemowe Narkomanii 1987, 2, Albert M., Olszowy Z., Celiƒski R. i wsp.: Interakcje prometazyny z alkaloidami opium okreêlone na podstawie doêwiadczenia przeprowadzonego na szczurach. Z zagadnieƒ nauk sàdowych 2007, LXX, Adres do korespondencji: Prof. dr hab. Zofia Olszowy Instytut Medycyny Pracy i Zdrowia Ârodowiskowego ul. KoÊcielna 13, Sosnowiec lab@imp.sosnowiec.pl