Przeszczepianie - Transplantacja

Transkrypt

1 ZASTOSOWANIE PROMIENIOWANIA JONIZUJĄCEGO DO WYJAŁAWIANIA PRZESZCZEPÓW TKANKOWYCH Izabela Uhrynowska-Tyszkiewicz Tyszkiewicz, Artur Kamiński Zakład Transplantologii i Centralny Bank Tkanek Akademii Medycznej w Warszawie Krajowe Centrum Bankowania Tkanek i Komórek ul. Chałubińskiego 5, WARSZAWA, tel. (22) , tel./fax: (22) ityszk@gmail.com url:

2 Przeszczepianie - Transplantacja postępowanie powanie operacyjne polegające na przeniesieniu komórki / tkanki / narządu w miejsce komórki / tkanki / narządu brakującego lub niefunkcjonującego. cego.

3 Jakby w cieniu wielkiej medycyny transplantacyjnej, zajmującej się przeszczepianiem narządów w unaczynionych znajduje się mała medycyna transplantacyjna, zajmująca się przeszczepianiem tkanek i komórek Przeszczepione narządy ratują ludzkie życie lub jak przeszczepione tkanki poprawiają jego jakość!

4 ortopedia i traumatologia okulistyka Mała tkankowa medycyna transplantacyjna (m.t.. a nie transplantologia!) przeszczepy tkanek mięś ęśniowo-szkieletowych: kości, więzad zadła, a, ścięgna, łąkotki wady wrodzone, urazy, nowotwory przeszczepy tkanek oka: rogówki, twardówka; wka; przeszczepy owodni choroby i urazy oczu kardiochirurgia przeszczepy zastawki serca wady wrodzone i nabyte chirurgia naczyniowa przeszczepy naczyń krwionośne ne (żylne,( tętnicze) t tnicze) wady, choroby, urazy neurochirurgia płaty kostne sklepienia czaszki, powięzie operacje wymagające czasowego usunięcia częś ęści kosci sklepienia czaszki, rekonstrukcja opony twardej leczenie ubytków w powłok ok ciała i inne przeszczepy skóry, przeszczepy owodni oparzenia, owrzodzenia troficzne, nowotwory

5 ROZWÓJ BANKOWANIA TKANEK NA ŚWIECIE W latach 50-tych i 60-tych XX-go wieku w operacjach odtwórczych zaczęto stosować alloprzeszczepy tkankowe Bethesda, USA (Bank Tkanek Szpitala Marynarki Wojennej) 1956 Hradec Kralove, ex-czechosłowacja 1957 Berlin, ex-nrd 1960 Rostów nad Donem, ex-zsrr

6 ROZWÓJ BANKOWANIA TKANEK W POLSCE 1963 Bank Tkanek przy Katedrze Histologii i Embriologii prof. K. Ostrowski 1966 Zakład Konserwowania Tkanek i Narządów przy Katedrze Histologii i Embriologii prof. S. Moskalewski 1970 Zakład Transplantologii i Centralny Bank Tkanek prof. J. Komender (do 2001); prof. A. Dziedzic- Gocławska (do 2006) dr A. Kamiński (od 2006) od 2004 roku działa Krajowe Centrum Bankowania Tkanek i Komórek (nadzór merytoryczny)

7 Prof. Janusz Komender Prof. Anna Dziedzic-Goclawska Dr Artur Kamiński

8 LAT BANKOWANIA I STERYLIZACJI RADIACYJNEJ TKANEK W POLSCE PRZESZCZEP W WALCE Z KALECTWEM

9 BANKI TKANEK (i KOMÓREK) wyspecjalizowane laboratoria przygotowujące dla potrzeb chirurgii odtwórczej auto-, allo- lub ksenogeniczne przeszczepy biowitalne nieunaczynione lub biostatyczne

10 SIEĆ BANKÓW TKANEK W POLSCE banki tkanek mięśniowoszkieletowych (Warszawa, Katowice, Morawica) banki zastawek serca (Kraków, Zabrze, Warszawa) - banki przygotowujące przeszczepy z kilku grup banki tkanek oka (Warszawa, Lublin) banki skóry (Bydgoszcz, Siemianowice Śl.)

11 Kampus Lindley a AM Szkoleniowo Badawczy Bank Tkanek KCBTiK

12 PRZESZCZEPY - w zależności od relacji dawca-biorca przeszczepu: auto - (izo - ) allo - kseno - geniczne w zależności od obecności żywych komórek w przeszczepach biowitalne unaczynione własna sieć nn. krwionośnych nych nieunaczynione odżywiane na zasadzie dyfuzji biostatyczne ( martwe( martwe )

13 PRZESZCZEPIANIE cd. Przeszczepiane komórki, tkanki i narządy mogą pochodzić od: tego samego osobnika przeszczep autogeniczny osobnika identycznego pod względem genetycznym, np. przeszczep między bliźniakami monozygotycznymi lub zwierzętami tego samego szczepu przeszczep izogeniczny osobnika tego samego gatunku przeszczep allogeniczny osobnika różnego gatunku przeszczep ksenogeniczny

14 PRZESZCZEPY I. BIOWITALNE = ŻYWE muszą podjąć funkcję bezpośrednio po przeszczepieniu IA: BIOWITALNE UNACZYNIONE - NARZĄDY brak możliwości dłuższego przechowywania, brak możliwości sterylizacji nerka, wątroba, serce, trzustka kilkanaście godzin IB: BIOWITALNE NIEUNACZYNIONE możliwość dłuższego przechowywania, brak możliwości sterylizacji (ew. dekontaminacja antybiotykami) rogówki kilka kilkanaście dni zastawki serca, naczynia kilka kilkanaście miesięcy komórki kilka - kilkanaście lat tylko przechowywane: komórki macierzyste krwi pępowinowej, szpiku rozhodowywane in vitro: keratynocyty, chondrocyty, fibroblasty

15 PRZESZCZEPY cd. II. BIOSTATYCZNE = BEZKOMÓRKOWE tkanki (przede wszystkim z grupy tkanek łącznych) po przejściach - poddawane różnym procedurom, niezawierające żywych komórek istotne są właściwości macierzy pozakomórkowej (obecność kolagenu np. typu I, lub II właściwości strukturalne + jako nośniki substancji aktywnych) możliwość długotrwałego przechowywania i sterylizacji protezy biologiczne / opatrunki biologiczne ulegają stopniowemu zastąpieniu przez tkanki własne biorcy przykłady przeszczepy z grupy tkanek łącznych: biostatyczna kość, chrząstka biostatyczne ścięgna, więzadła biostatyczna skóra pełna, biostatyczna skóra właściwa biostatyczna błona owodniowa biostatyczne osierdzie, (opona twarda)

16 PRZESZCZEPY ALLOGENICZNE biowitalne biostatyczne & unaczynione biowitalne nieunaczynione Immunogenność wysoka niska Dobór biorca-dawca wymagany nie wymagany Immunosupresja z reguły konieczna nie konieczna

17 LICZBA PRZESZCZEPÓW TKANKOWYCH WYDANYCH do szpitali Rodzaje przeszczepów Rok Rogówki (szt.) średnio 630 szt. / rok Skóra (cm 2 ) średnio cm 2 / rok Zastawki serca średnio 180 szt. / rok Kości przeszczepy masywne (szt.) (fragmenty kości długich) średnio 250 szt. / rok Kości materiał wypełniający (op.) (kość gąbczasta i korowo-gąbczasta) średnio op. / rok Owodnie (op.) średnio 590 op. / rok

18 ZAKŁAD TRANSPLANTOLOGII I CENTRALNY BANK TKANEK AKADEMII MEDYCZNEJ W WARSZAWIE ul. Chałubińskiego 5, WARSZAWA, tel./fax:( 22) , tel.(22) ib.amwaw.edu.pl/transp/ Allogeniczna mrożona kość gąbczasta -gruz 30 cm 3 Sterylizowana Radiacyjnie (35 kgy) SERIA / Data przygotowania: Termin ważności: (-70 o C - 5 lat) lub (-20 o C - 3 m-ce)

19 ZAKŁAD TRANSPLANTOLOGII I CENTRALNY BANK TKANEK AKADEMII MEDYCZNEJ W WARSZAWIE ul. Chałubińskiego 5, WARSZAWA, tel./fax:( 22) , tel.(22) ib.amwaw.edu.pl/transp/ Allogeniczna mrożona kość gąbczasta - plaster Sterylizowana Radiacyjnie (35 kgy) SERIA / Data przygotowania: Termin ważności: (-70 o C - 5 lat) lub (-20 o C - 3 m-ce)

20 ZAKŁAD TRANSPLANTOLOGII I CENTRALNY BANK TKANEK AKADEMII MEDYCZNEJ W WARSZAWIE ul. Chałubińskiego 5, WARSZAWA, tel./fax:( 22) , tel.(22) ib.amwaw.edu.pl/transp/ Allogeniczna mrożona kość gąbczasta -głowa kości udowej Sterylizowana Radiacyjnie (35 kgy) SERIA / Data przygotowania: Termin ważności: (-70 o C - 5 lat) lub (-20 o C - 3 m-ce)

21 ZAKŁAD TRANSPLANTOLOGII I CENTRALNY BANK TKANEK AKADEMII MEDYCZNEJ W WARSZAWIE ul. Chałubińskiego 5, WARSZAWA, tel./fax:( 22) , tel.(22) ib.amwaw.edu.pl/transp/ Allogeniczna mrożona kość zbita - belka dł. 10 cm Sterylizowana Radiacyjnie (35 kgy) SERIA / Data przygotowania: Termin ważności: (-70 o C - 5 lat) lub (-20 o C - 3 m-ce)

22 ZAKŁAD TRANSPLANTOLOGII I CENTRALNY BANK TKANEK AKADEMII MEDYCZNEJ W WARSZAWIE ul. Chałubińskiego 5, WARSZAWA, tel./fax:( 22) , tel.(22) ib.amwaw.edu.pl/transp/ Allogeniczna mrożona nasada dalsza kości udowej Sterylizowana Radiacyjnie (35 kgy) SERIA / Data przygotowania: Termin ważności: (-70 o C - 5 lat) lub (-20 o C - 3 m-ce)

23 ZAKŁAD TRANSPLANTOLOGII I CENTRALNY BANK TKANEK AKADEMII MEDYCZNEJ W WARSZAWIE ul. Chałubińskiego 5, WARSZAWA, tel./fax:( 22) , tel.(22) ib.amwaw.edu.pl/transp/ Allogeniczna mrożona nasada bliższa kości piszczelowej Sterylizowana Radiacyjnie (35 kgy) SERIA / Data przygotowania: Termin ważności: (-70 o C - 5 lat) lub (-20 o C - 3 m-ce)

24 ZAKŁAD TRANSPLANTOLOGII I CENTRALNY BANK TKANEK AKADEMII MEDYCZNEJ W WARSZAWIE ul. Chałubińskiego 5, WARSZAWA, tel./fax:( 22) , tel.(22) ib.amwaw.edu.pl/transp/ Allogeniczna świeża chrząstka żebrowa konserwowana w 0,9%NaCl Sterylizowana Radiacyjnie (35 kgy) SERIA / Data przygotowania: Termin ważności: (-70 o C - 5 lat) lub (-20 o C - 3 m-ce)

25

26 BANKOWANIE TKANEK etap I wstępna kwalifikacji dawcy, uzyskanie (i zabezpieczenie) materiału etap II testowanie materiału dalsza kwalifikacja dawcy (przeprowadzenie testów biologicznych) oraz kontrola przydatności samego materiału zakończone zwolnieniem z kwarantanny uzyskanego materiału i dopuszczeniem do przetwarzania lub jego dyskwalifikacją i utylizacją etap III przetwarzanie materiału przygotowanie przeszczepów etap IV przechowywanie materiału etap V dystrybucja materiału etap VI monitorowanie losów przeszczepów informacja zwrotna (ang. traceability)

27 Uczelnie medyczne Bank Tkanek Regionalne Stacje Krwiodawstwa Potencjalni dawcy: zmarli: - pobrania wielonarządowe -Zakłady Medycyny Sądowej żywi: - oddział ortopedyczny (głowy kości udowej) - oddział położniczy (owodnia) Badania serologiczne potencjalnych dawców: obowiązkowe: opcjonalne: - anty HIV 1, 2 - anty CMV (IgM, IgG) - HBs Ag, anty HBc - anty Toxo (IgM, IgG) - anty HCV - w kierunku kiły Obróbka tkanek, konserwacja, pakowanie Sterylizacja radiacyjna: - źródło 60 Co - akcelerator elektronów 10 MeV Walidacja procesu - pomiar dawki pochłoniętej Przechowywanie tkanek Dystrybucja do klinik i szpitali Monitorowanie wyników terapeutycznych po zastosowaniu przeszczepów

28 USTAWA z dnia 1 lipca 2005 r. o POBIERANIU, PRZECHOWYWANIU I PRZESZCZEPIANIU KOMÓREK, TKANEK I NARZĄDÓW (Dz. U. Nr 169 z dn. 6 września 2005, poz. 1411) 59 artykułów + AKTY WYKONAWCZE DO USTAWY (w trakcie tworzenia)

29 DYREKTYWA TKANKOWA DYREKTYWA MATKA DYREKTYWA 2004/23/WE PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY Z DNIA 31 MARCA 2004 r. dotycząca STANDARDÓW JAKOŚCI I BEZPIECZEŃSTWA POZYSKIWANIA, POBIERANIA, TESTOWANIA, PRZETWARZANIA, KONSERWACJI, PRZECHOWYWANIA I DYSTRYBUCJI LUDZKICH TKANEK I KOMÓREK

30 DYREKTYWA TKANKOWA TECHNICZNA I Wymogi techniczne I DYREKTYWA 2006/17/WE KOMISJI Z DNIA 8 LUTEGO 2006 r. wprowadzająca w życie DYREKTYWĘ 2004/23/WE PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY w odniesieniu do niektórych wymagań technicznych dotyczących DAWSTWA, POBIERANIA I TESTOWANIA LUDZKICH TKANEK I KOMÓREK

31 DYREKTYWA TKANKOWA TECHNICZNA II Wymogi techniczne II DYREKTYWA 2006/86/WE KOMISJI Z DNIA 24 PAŹDZIERNIKA 2006 r. wprowadzająca w życie DYREKTYWĘ 2004/23/WE PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY w odniesieniu do niektórych wymagań technicznych dotyczących OZNAKOWYWANIA, PRZETWARZANIA, KONSERWOWANIA, PRZECHOWYWANIA I DYSTRYBUCJI LUDZKICH TKANEK I KOMÓREK

32 Metody konserwacji przeszczepów w tkankowych Przygotowanie przeszczepów pakowanie mrożenie płukanie w torebki w - 72 o C w 0.9% NaCl poliester/polietylen liofilizacja ( suszenie w próżni ni ) mrożenie w - 72 o C pakowanie w torebki poliester/polietylen pakowanie w torebki poliester/polietylen z 0.9% NaCl Sterylizacja radiacyjna dawką 35 kgy Walidacja procesu sterylizacji radiacyjnej

33 Metody sterylizacji przeszczepów tkankowych sterylizacja termiczna ( -tkanki są termolabilne!) sterylizacja w roztworach glicerolu (???) sterylizacja tlenkiem etylenu ( - toksyczne pozostałości) sterylizacja plazmowa (? działanie b. powierzchowne) sterylizacja radiacyjna ( )

34 Sterylizacja radiacyjna 1896 W. Roentgen - promieniowanie jonizujące metodą sterylizacji 1899 J. i M. Curie - pierwsze obserwacje wpływu promieniowania beta i gamma na różne materiały i tkanki 1929 M. Curie - inaktywacja bakterii poprzez promieniowanie jonizujące Sterylizacja radiacyjna materiałów medycznych została na szeroką skalę wprowadzona w połowie lat 50- tych XX w.

35 Sterylizacja materiałów w medycznych (%) Metody termiczne Sterylizacja gazowa (EtO) Sterylizacja radiacyjna

36 Zalety sterylizacji radiacyjnej wysoka skuteczność niszczenia patogenów dobra penetracja oraz praktycznie równomierne rozłożenie działania ania promieniowania jonizującego, szczególnie gamma, w wyjaławianych awianych obiektach uwaga 1: problem z przeszczepami masywnymi (strukturalnymi), brak w Polsce źródła 60 Co o odpowiedniej mocy dawki; rozkład dawki pozostaje nie do końca poznany (b. duża różnorodność kształtu tu przeszczepów) uwaga 2: problem z kość śćmi czaszki - krzywizny

37 Zalety sterylizacji radiacyjnej cd. nieznaczne podniesienie temperatury możliwo liwość wyjaławiania awiania termolabilnych materiałów w i tkanek możliwo liwość wyjaławiania awiania obiektów w w zamkniętych opakowaniach docelowych, co eliminuje ryzyko wtórnego ich zakażenia niewprowadzanie obcych substancji do wyjaławianych awianych obiektów

38 Dobór r dawki sterylizującej skażenie wstępne (bioburden, initial contamination): rodzaj, liczba i wrażliwo liwość patogenów w obecnych w materiale; warunki napromieniowania - np. moc dawki, temperatura, obecność w środowisku wody, tlenu lub substancji osłabiaj abiających działanie anie promieniowania, takich jak np. glicerol, czynniki redukujące, wymiatacze wolnych rodników w itp.

39 Dobór r dawki sterylizującej cd. założony ony poziom jałowo owości (SAL) dla płynp ynów infuzyjnych oraz dla wyrobów w medycznych mających styczność z krwią lub z tkankami, a także e dla przeszczepów w tkankowych przyjęto SAL 10-6 co oznacza, że e w wyjaławianych awianych obiektach może e przeżyć jeden patogen na milion obecnych przed sterylizacją

40 Zalecana przez IAEA dawka sterylizacji radiacyjnej przeszczepów tkankowych wynosi 25 kgy W CBT od 1963 roku do sterylizacji przeszczepów w tkankowych stosowana jest dawka 33 kgy +/- 10%

41 Skażenie wstępne Materiały y medyczne stopień skażenia wstępnego jest z reguły y niski i możliwy do każdorazowego ustalenia (przyjmuje się, że max.. wynosi 10 6 ) Tkanki pobierane ze zwłok stopień skażenia jest wysoki i z praktycznych względów niemożliwy do każdorazowego określenia lenia; stopień skażenia może e różnir nić się nie tylko pomiędzy poszczególnymi dawcami ale także e pomiędzy różnymi tkankami pobranymi od tego samego dawcy możliwo liwość zakażenia dawcy wirusami, których obecności ci nie można wykluczyć przeprowadzając c testy serologiczne ze względu na istnienie tzw. okienka serologicznego

42 Oporność patogenów w na napromieniowanie - Najbardziej oporne sąs priony - Formy przetrwalnikowe bakterii są bardziej oporne niż formy wegetatywne - Oporność grzybów porównywalna jest z oporności cią form przetrwalnikowych bakterii - Wirusy są bardziej oporne od bakterii

43 Wpływ sterylizacji radiacyjnej na wirusy jest słabo s poznany HCV - dawka 17 kgy zabezpiecza przed infekcją HBV - brak danych HIV - dawka D 10 wynosi od 4 kgy do 5,6 kgy przy zakażeniu wstępnym (TCID 50 ) /ml, dla SAL 10-6 dawka całkowita wynosi od 36 kgy do ok. 50 kgy. - w badaniach przy użyciu u metody PCR inaktywacja wirusa HIV w mrożonych onych i świeżych przeszczepach kostnych występuje przy dawce kgy. - inaktywacja wirusa w surowicy o log 10 w postaci zamrożonej onej do - 80 o C wymaga dawek kgy, a temp. 15 o C - 25 kgy. Dawki powyżej kgy mogą powodować zmiany właściwości fizyko-chemicznych i biologicznych alloprzeszczepów.

44 Zwiększenie oporności patogenów: obecność glicerolu, DMSO, próżnia, niska temperatura Obniżenie oporności patogenów: obecność wody, obecność tlenu, wysoka temperatura

45 Wybór r dawki sterylizującej dla przeszczepów w tkankowych stanowi kompromis między dawką na tyle wysoką,, aby zniszczyć możliwie wszystkie patogeny i na tyle niską aby zachować właściwości biologiczne i mechaniczne tkanek (szczególnie ważne w przypadku strukturalnych przeszczepów w kostnych używanych u do celów w podporowych)

46 Przeszczepy tkankowe,, w tym przeszczepy kostne powinny pobudzać procesy odtwórczo rczo-naprawcze w organizmie biorcy

47 Przeszczepy kostne pobudzanie procesów w odtwórczo rczo-naprawczych = pobudzanie odbudowy tkanki kostnej w miejscu umieszczenia przeszczepu = pobudzanie kościotworzenia Zdolności pobudzania kościotworzenia przez przeszczep kostny zależą od jego właściwow ciwości: ci: osteoindukcjnych osteokondukcjnych osteogenetycznych

48 Właściwości osteoindukcyjne przeszczepu zdolność do stymulacji proliferacji i różnicowaniar prekursorów w komórek kostnych biorcy (pluripotencjalne macierzyste komórki mezenchymalne) zależą od: obecności ci białek morfogenetycznych kości (ang. BMPs bone morphogenetic proteins) stan nośnika nika tych białek, czyli od stanu kolagenu

49 wielkości porów w przeszczepie Właściwości osteokondukcyjne przeszczepu zdolność do stymulacji przylegania, migracji i dystrybucji komórek biorcy do przeszczepu / w przeszczepie zależą od szeregu fizycznych właściwow ciwości przeszczepu, m.in. od: trójwymiarowej architektury przeszczepu stopnia porowatości przeszczepu

50 Właściwości osteogenetyczne przeszczepu zdolność do niezależnego nego od komórek biorcy tworzenia nowej kości warunkowane sąs obecności cią w przeszczepie żywych komórek kościotw ciotwórczych dawcy przeszczepy biostatyczne nie mają właściwości osteogenetycznych

51 Wgajanie się i przebudowa przeszczepów kostnych Stopniowa resorpcja przeszczepu i zastępowanie przez własną tkankę kostną biorcy Oba procesy są ze sobą ściśle związane, a proces resorpcji warunkuje wystąpienie procesu kościotworzenia - typ tkanki kostnej (zbita, gąbczasta) - metoda konserwacji (liofilizacja, mrożenie) - warunki sterylizacji (dawka, temperatura) - kontakt przeszczepu z tkanką kostną i okostną biorcy

52 Wgajanie się i przebudowa przeszczepów kostnych (1) - chemotaksja makro- i mikrofagów - resorpcja przeszczepu (uwalnianie BMPs) -różnicowanie i proliferacja komórek osteogennych śródkostnej i warstwy rozrodczej okostnej

53 Wgajanie się i przebudowa przeszczepów kostnych (2) - postępująca resorpcja przeszczepu kostnego - tworzenie pomostów kostniny między tkanką kostną biorcy a przeszczepem kostnym

54 Wgajanie się i przebudowa przeszczepów kostnych (3) - postępująca resorpcja przeszczepu kostnego - przebudowa nowopowstałej tkanki kostnej splotowatej w kość blaszkowatą

55 WPŁYW METOD KONSERWACJI I STERYLIZACJI RADIACYJNEJ NA WŁAŚCIWOŚCI BIOLOGICZNE (wł. osteoindukcyjne) PRZESZCZEPÓW KOSTNYCH Zakład Transplantologii i Centralny Bank Tkanek Akademii Medycznej W Warszawie ul. Chałubińskiego 5, WARSZAWA, tel. (22) , tel./fax:(22) agoclaw@ib.amwaw.edu.pl

56 Dogodnym modelem do badań właściwości osteoinducyjnych przeszczepów jest model indukcji heterotopowego kościotworzenia ( Urist,, 1965). Polega on na wszczepianiu w miejsca heterotopowe np. w mięś ęśnie ściany brzucha szczurów, odwapnionych matryc kostnych konserwowanych i sterylizowanych w różnych r warunkach.

57 Materiał i metody odwapnione szczurze matryce kostne podzielono na grupy: liofilizowane i napromieniowane w temp. pokojowej dawkami 35 i 50 kgy (promieniowanie γ ) mrożone i napromieniowane w temp. -72 o C dawkami 35 i 50 kgy (akcelerator elektronów 10 MeV) świeże napromieniowane w temp. pokojowej dawkami 35 i 50 kgy (promieniowanie γ ) nienapronieniowane kontrole

58 Schemat wszczepienia matryc kostnych w mięśnie ściany brzucha szczurów liofilizowane Matryce kostne mrożone liofilizowane Matryce kostne świeże 20 o C napromieniowane w temp oo C napromieniowane w temp. 20 o C dawki dawki 35 kgy 35 kgy 50 kgy 50 kgy kontrola kontrola

59 Badanie radiologiczne 6 tygodni po wszczepieniu matryc kostnych w mięśnie ściany brzucha szczurów liofilizowane Matryce kostne mrożone 20 o C napromieniowane w temp. -72 o C dawki 35 kgy liofilizowane Matryce kostne świeże 50 kgy 20 o C napromieniowane w temp. 20 o C dawki kontrola 35 kgy 50 kgy kontrola

60 Analiza morfometryczna matryc kostnych 6 tygodni po wszczepieniu w mięśnie ściany brzucha szczurów liofilizowane Matryce kostne mrożone liofilizowane Matryce kostne świeże 20 o C napromieniowane w temp o C napromieniowane w temp. 20 o C dawki dawki 35 kgy 35 kgy 50 kgy 50 kgy kontrola kontrola całkowicie zresorbowana matryca kostna niezresorbowana matryca kostna indukcja de novo chrząstki, szpiku i tk. kostnej

61 Kolagen fibrylarny promieniowanie jonizujące BMP kolagen w stanie suchym (liofilizacja) w obecności wody: H 2 O radioliza. OH Efekt bezpośredni: cięcie łańcuchów polipeptydowych Efekt pośredni: tworzenie wiązań krzyżowych

62 WPŁYW PROCESU KONSERWACJI I WARUNKÓW STERYLIZACJI RADIACYJNEJ NA WYTRZYMAŁOŚĆ MECHANICZNĄ KOŚCI Zakład Transplantologii i Centralny Bank Tkanek Akademii Medycznej W Warszawie ul. Chałubińskiego 5, WARSZAWA, tel. (22) , tel./fax:(22) agoclaw@ib.amwaw.edu.pl

63 Metody konserwacji - niska temperatura (-20 o C o C) - brak wpływu na wytrzymałość mechaniczną kości (Sedlin i Hirsh, 1966; Komender, 1976; Ashman, 1982; Pelker i wsp., 1984) - liofilizacja - wzrost wartości modułu Younga i siły łamiącej, spadek wartości sztywności (Evans i Lebow, 1951; Komender, 1976)

64 Metody sterylizacji - autoklawowanie i gotowanie -zmniejszenie wartości siły łamiącej i modułu Younga (Borchers i wsp., 1995; Vicecionti, 1996) - tlenek etylenu - brak wpływu na wytrzymałość mechaniczną kości (White i wsp., 1996) - sterylizacja radiacyjna wpływ na wytrzymałość mechaniczną zależny od: - dawki napromieniowania - stanu fizycznego tkanki - temperatury napromieniowania (Komender, 1976; Anderson i wsp., 1992; Goetzenet i wsp., 1995; Cornu, 2000)

65 Metoda liofilizowane, napromieniowane w temperaturze pokojowej dawkami 25, 35, lub 50 kgy mrożone, napromieniowane w teperaturze -72 o C dawkami 25, 35, or 50 kgy świeże, napromieniowane w temperaturze pokojowej dawkami 25, 35, lub 50 kgy nie napromieniowane kontrole

66 Metoda Pomiary wytrzymałości mechanicznej (Instron Universal Testing Machine) F F (N) F (N) rozstaw podpór 19 mm prędkość głowicy 0.1cm/s (mm) siła łamiąca (N) (mm) strzałka ugięcia (mm)

67 Wyniki: siła łamiąca (N) * * p< * * 60 * kontrola liofiliz. liofiliz. liofiliz. liofiliz. nie napromieniowana 25 kgy 35 kgy 50 kgy 20 o C 20 o C 20 o C

68 Wyniki siła łamiąca i strzałka ugięcia * siła łamiąca (N) kontrola liofilizacja * p<0.05 * strzałka ugięcia (µm)

69 Wyniki: siła łamiąca (N) 140 * p<0.05 * * * kontrola liofiliz. mrożone mrożone mrożone nie napromieniowane 25 kgy 35 kgy 50 kgy -72 o C - 72 o C - 72 o C

70 Wyniki: siła łamiąca (N) 140 * p< * * * kontrola liofiliz. świeże świeże świeże nie napromieniowane 25 kgy 35 kgy 50 kgy 20 o C 20 o C 20 o C

71 WPŁYW KONSERWACJI I WARUNKÓW STERYLIZACJI RADIACYJNEJ NA DEGRADACJĘ KOLAGENU -rozpuszczalność kolagenu in vitro podatność kolagenu na trawienie enzymatyczne - PODSTAWOWEGO SKŁADNIKA PRZESZCZEPÓW TKANKOWYCH Zakład Transplantologii i Centralny Bank Tkanek Akademii Medycznej W Warszawie ul. Chałubińskiego 5, WARSZAWA, tel. (22) , tel./fax:(22) agoclaw@ib.amwaw.edu.pl

72 Materiał i metody szczurza kość zbita ( 14 tygodni) ludzka kość zbita ( 35 lat) ludzka chrząstka żebrowa ( 20 lat) cielęce ścięgno Achillesa ( 6 tygodni) świeże i liofilizowane napromieniowane w temp. pokojowej dawkami 25, 35, 50 lub 100 kgy (promieniowanie γ)

73 Materiał i metody Oznaczanie kolagenu rozpuszczalnego w roztworach obojętnych: ekstrakcja w 0,5 M NaCl (Ph 7,0), 48 h, 4 o C supernatant użyto do oznaczenia kolagenu rozpuszczalnego w roztworach obojętnych (NSC) Oznaczanie kolagenu rozpuszczalnego w roztworach kwaśnych: ekstrakcja pozostałego osadu w buforze cytrynianowym (ph 3,6), 48h, 4 o C supernatant do oznaczenia kolagenu rozpuszczalnego w roztworach kwaśnych (ASC) Oznaczanie ilości hydroksyproliny w ekstraktach: mg PrOH / g suchej macierzy organicznej TSC = NSC + ASC

74 Rozpuszczalność in vitro kolagenu (TSC) świeżej i liofilizowanej szczurzej kości zbitej ( 14 tygodni) napromieniowanej w temp. pokojowej 12 (10.84%) mg Pr-OH/g suchej masy tkanki (0.39%) (0.94%) (4.81%) 4.52 (1.36%) nienapromieniana świeże liofiliz. świeże liofiliz. kontrola 35 kgy 50 kgy (całkowita zawartość ProOH w próbce mg ProOH/g suchej masy)

75 mg Pr-OH/g suchej masy tkanki Rozpuszczalność in vitro kolagenu (TSC) świeżej i liofilizowanej ludzkiej kości zbitej ( 35 lat) napromieniowanej w temp. pokojowej (0.15%) (0.19%) (0.93%) 1.29 (0.30%) (2.64%) 3.67 (0.40%) 0.56 (3.33%) 4.62 (0.80%) 1.11 (10.15%) nienapromieniana świeża liofiliz. świeża liofiliz. świeża liofiliz. świeża liofiliz. kontrola 25 kgy 35 kgy 50 kgy 100 kgy (całkowita zawartość ProOH w próbce mgprooh/g suchej masy)

76 Rozpuszczalność in vitro kolagenu (TSC) świeżej i liofilizowanej ludzkiej chrząstki żebrowej ( 20 lat) napromieniowanej w temp. pokojowej mg Pr-OH/g suchej masy tkanki (0.85%) 0.68 (3.55%) (4.40%) (4.00%) (6.26%) 4.99 (3.99%) 3.10 (9.70%) 7.74 (4.71%) 3.76 (20.18%) nienapromieniana świeża liofiliz. świeża liofiliz. świeża liofiliz. świeża liofiliz. kontrola 25 kgy 35 kgy 50 kgy 100 kgy (całkowita zawartość ProOH w próbce mg ProOH/g suchej masy)

77 18 16 Rozpuszczalność in vitro kolagenu (TSC) cielęcego ścięgna Achillesa ( 6 tygodni) napromieniowanego w temp. pokojowej (13.14%) mg Pr-OH/g suchej masy tkanki (1.07%) (0.75%) (3.98%) 5.09 (1.72%) 2.21 (5.46%) 6.97 (0.81%) 1.03 (7.50%) 9.57 (1.86%) nienapromieniana świeża liofiliz. świeża liofiliz. świeża liofiliz. świeża liofiliz. kontrola 25 kgy 35 kgy 50 kgy 100 kgy (całkowita zawartość ProOH w próbce mg ProOH/g suchej masy)

78 Materiał i metody Oznaczenie in vitro podatności na trawienie enzymatyczne próbek kolagenu cielęcego ścięgna Achillesa : inkubacja z 20% pepsyną Ekstrakcja sproszkowanych próbek: kwas octowy (ph 3.6) 4 o C, 12 godz. Oznaczanie ilości hydroksyproliny w ekstraktach: mg PrOH / g suchej macierzy organicznej

79 Podatności na działanie pepsyny in vitro próbek kolagenu cielęcego ścięgna Achillesa napromieniowanego dawkami kgy Rozpuszczalność (%) świeża liofiliz. świeża liofiliz. świeża liofiliz. świeża liofiliz. nienapronieniana 25 kgy 50 kgy 100 kgy kontrola

80 Wpływ sterylizacji radiacyjnej na kolagen próbki suche (liofilizacja ) próbki uwodnione radioliza (świeże: H 2 O OH) efekt bezpośredni efekt pośredni cięcie tworzenie wewnątrz i międzyłańcuchów cząsteczkowych wiązań sieciujących wytrzymałość mechaniczna rozpuszczalność in vitro podatność na trawienie enzymatyczne resorpcja in vivo wzrost spadek 0 brak efektu

81 NIE ZABIERAJ SWOICH NARZĄDÓW W DO NIEBA W NIEBIE WIEDZĄ, ŻE E POTRZEBUJEMY ICH TUTAJ... DON T TAKE YOUR ORGANS TO HEAVEN, HEAVEN KNOWS WE NEED THEM HERE

82 TKANKI TEŻ POZOSTAW NA ZIEMI!!!!

83 DZIĘKUJ KUJĘ ZA UWAGĘ