CHROMATOGRAFIA JONOWYMIENNA i JONOWA. Prof. Bogdan Zygmunt Prof. Marian Kamiński

Transkrypt

1 CHROMATOGRAFIA JONOWYMIENNA i JONOWA Prof. Bogdan Zygmunt Prof. Marian Kamiński

2 Chromatografia jonowymienna retencja opiera się na zjawisku wymiany jonowej Wymiana jonowa obecne w roztworze jony i cząsteczki obdarzone ładunkiem wiązane są przez jonit, który jednocześnie oddaje do roztworu jony o tym samym znaku Jony oddawane do eluentu, to najczęściej OH -, H +, Na +, Cl - Wymiana jonów proces odwracalny i stechiometryczny MoŜliwość regeneracji jonitu postać pierwotna

3 Wymiana jonowa Pierwsze wzmianki w Piśmie Świętym: Po wrzuceniu wskazanego przez Pana drzewa woda gorzka niezdatna do picia zmieniła smak i stała się zdatną do picia Thompson (1850): Opis adsorpcji jonowymiennej w zakresie filtracji roztworów soli metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych przez gleby zawierające glinokrzemiany Folin i Bell (1917): wymieniacze jonowe do oznaczania amoniaku w moczu H. Small (lata 1950-te): moŝliwość zastąpienia metod oznaczania jonów metodami chromatograficznymi

4 Chromatografia jonowymienna stałe jonity (anionity lub kationity) fazą stacjonarną Anionit zasada na trwale związana z powierzchnią ziarna stałej substancji; grupa z ładunkiem dodatnim na trwale związana, mobilne przeciwjony mają ładunek ujemny i mogą ulegać wymianie przez inne aniony Kationit - kwas związany zany z powierzchnią ziarna stałej substancji; grupa z ładunkiem ujemnym na trwale związana, mobilne przeciwjony mają ładunek dodatni i mogą ulegać wymianie przez inne kationy Jonity amfoteryczne wymiana anionów lub kationów (w zaleŝności od ph) Jonity bipolarne jednocześnie aniony i kationy

5 Jonity naturalne kationity glinokrzemianowe, głównie zeolity Na 2 O. CaO. Al 2 O 3. nsio 2. mh 2 O Jonity półsyntetyczne głównie węgle sulfonowane (Permutyt-H, Zecarb HJ, Wofatit-X) Jonity syntetyczne głównie Ŝywice jonowymienne Jonity syntetyczne głównie Ŝywice jonowymienne czyli wielkocząsteczkowe polimery organiczne nierozpuszczalne w wodzie i większości rozpuszczalników organicznych zawierające grupy funkcyjne zdolne do wymiany jonów w roztworze elektrolitów; takŝeŝele krzemionkowe chemicznie modyfikowane grupami alkilo- lub arylosulfonowymi, karboksylowymi, aminowymi; takŝe sorpcja na C18

6 śywice kationowymienne grupy kwasowe odszczepiające H + wymienialny na inne kationy -Sulfonowe: -SO 3 H mocny -Karboksylowe: -COOH średni -Aminodioctanowe: -N(CH 2 COOH) 2 słaby -Fenolowe: -C 6 H 4 OH bardzo słaby -Fosfonowe: -PO 3 H 2 mocny -Fosfinowe: -PO 2 H słaby

7 śywice anionowymienne grupy funkcyjne o charakterze zasadowym -czwartorzędowe grupy amoniowe: -NR 3+, - N + (CH 3 ) 2 C 2 H 4 OH mocny -aminy i sprotonowane aminy II i III rzędowe: -NH 2, =NH, -NR 2 H +, -NRH 2+ -średni i słaby -dialkilosulfoniowe: -SR słaby

8 śywice amfoteryczne równocześnie grupy funkcyjne o charakterze zasadowym i kwasowym -N(CH) 3+, -COOH - inne kombinacje

9 week centers Sulfonowany kopolimer polistyrenu i diwinylobenzenu Inne grupy: ; -COOH: kopolimeryzacja kwasu akrylowego i diwinylobenzenu -NR 4 Cl: aminowanie kopolimeru polistyrenu i diwinylobenzenu (aminami trzeciorzędowymi)

10 Sposoby przygotowania Ŝywic jonowymiennych

11 śywica kationowymienna - mocny wymieniacz jonowy

12

13 Wysokosprawna chromatografia jonowymienna chromatografia jonowa (IC) lub wysokosprawna chromatografia jonowa (HPIC) Chromatografia jonowa (IC) wysokosprawne kolumny rozdzielające oraz najczęściej detekcja konduktometryczna po supresji jonów eluentu IC wprowadzona 1975 (Small, Stevens, Bauman)

14

15 Detektor konduktometryczny z supresorem mikromembranowym

16

17

18 Chromatografia jonowa (IC) Eluenty o małej sile jonowej: 0,1 1 mm śywice rozdzielające o małej pojemności jonowej Konieczne tłumienie tła: supresja jonów eluentu; elektroniczna korekta tła bardzo mała siła jonowa! Uniwersalna detekcja konduktometryczna po uprzedniej supresji jonów eluentu Próg detekcji ograniczony wartością przewodnictwa oznaczanych jonów

19

20 Kolumny w chromatografii jonowej Generalnie niŝsza sprawność niŝ w niejonowej HPLC Obecnie z cząstkami rzędu 5 µm nawet półek/m Wypełnienia całkowicie porowate grupy funkcyjne w całej matrycy Wypełnienia błonkowate grupy funkcyjne na powierzchni cząstek jonitu

21 Właściwości jonitów całkowicie porowatych i błonkowatych Właściwość Jonit całkowicie porowaty Pojemność jono-wymienna DuŜa Mała Skłonność do pęcznienia DuŜa Mała Rozdzielanie Dobre Słabe Wpływ innych substancji Mały DuŜy Wymagane stęŝenie eluentu DuŜe Małe Jonit błonkowaty Uzyskiwane piki Szerokie Wąskie

22 Wypełnienia kolumn w IC

23 Grupy funkcyjne na powierzchni Struktura pojedynczej cząstki wypełnienia (IonPac AS14) z warstwą anionowymienną: 9 µm; 55%; 52 µeq/13 µeq (2x250 mm); grupa alkiloamoniowa; hydrofobowość; średnia-wysoka

24 Rdzeń z kopolimeru etylowinylobenzenu (EVB) i divinylobenzenu (DVB) EVB sieciowany 55% DVB Grupy funkcyjne na powierzchni Całkowita zgodność z róŝnymi rozpuszczalnikami Z rdzeniem kowalencyjnie związana warstewka polimeru o właściwościach wymieniacza jonowego. Grubość warstewki wymieniacza jonowego mała i kontrolowana szybka wymiana masy i w konsekwencji wysoka sprawność Tego typu wypełnienia zdeformowane piki gaussowskie zaokrąglone wchodząca i schodząca część piku przy podstawie

25 Lateks z rdzeniem oddziaływania elektrostatyczne i van-der-waalsa Struktura Ŝywicy anionowymiennej: sulfonowana powierzchniowo cząstka kopolimeru polistyrenu i diwinylobenzenu (5 µm, 25 µm) Całkowicie aminowana porowata cząstka lateksu (ok. 100 nm) czyli polimeru z polichlorku winylobenzylu lub polimetakrylanu

26 Trzy obszary ziaren Obojętny i mechanicznie trwały rdzeń mechaniczna trwałość i umiarkowane Cienki film grup sulfonowych na rdzeniu Sulfonowani powierzchni rdzenia ogranicza dyfuzję indywiduów nieorganicznych do wnętrza rdzenia wykluczanie Donnana. Proces dyfuzji zdominowany przez grupy funkcyjne związane z kulkami Zewnętrzna warstwa kulek lateksowych z czwartorzędowymi grupami amoniowymi małe rozmiary to szybka dyfuzja i wysoka sprawność Grupy funkcyjne na powierzchni redukcja pęcznienia i kurczenia się Wysoka trwałość chemiczna wiązania jonowe trwałe nawet w 4M NaOH

27 Wypełnienia Kopolimery styrenu i diwinylobenzenu powierzchnia sulfonowana poprzez reakcję ze stęŝonym H 2 SO Pojemność µeq/g Dyfuzja całkowicie zdysocjowanych kationów Na +, K +, Mg 2+ do wnętrza rdzenia pomijalnie mała wysoka sprawność w porównaniu z całkowicie sulfonowanymi wypełnieniami Kopolimer EVB/DVB (8µm, 450m 2 ) w duŝym stopniu usieciowany z kowalencyjnie związanym polimerem z grupami kationowymiennymi (-COOH) ( nm) metale alkaliczne i ziem alkalicznych Mała powtarzalność aminowania brak wypełnień z warstewką sulfonowanych kulek lateksowych

28 Cząstka Ŝywicy kationowymiennej (10µm): ziarna aminowanego lateksu (50 nm); ziarna całkowicie sulfonowanego lateksu (250 nm); dopiero w 1986 bo bezpośrednie aminowanie niepraktyczne

29 Lateksowe wypełnienia dają znacznie wyŝszą sprawność niewiele zmieniającą się ze wzrostem przepływu separacja Na +, NH 4+ i K + w ciągu 3 min Specjalne wypełnienie lateksowe w 1990 do jednoczesnej separacji metali alkalicznych i ziem alkalicznych Wysoce usieciowany kopolimer EVB i DVB (8,5 W czasie polimeryzacji monowarstwa koloidalnych cząstek całkowicie aminowanego polimeru jest kowalencyjnie wiązana na Warstwa ta kotwicą dla sulfonowanych kulek lateksowych (właściwy wymieniacz Wysoka stabilność mechaniczna i Eluent mieszanina kwasu 2,3-diaminopropionowego i HCl

30 76 nm 140 nm Czwartorzędowa grupa amoniowa Wytwarzanie wypełnień dwufunkcyjnych (CSA5A). CEC 20µeq; AEC 40 µeq (250x4 mm)

31 Retencja: Wymiana między jonami próbki i przeciwjonami występującymi na Ŝywicy R-SO 3- H + + Me + R-SO 3- Me + + H + odwracalne R-NR 3+ (OH) - + A - RNR 3+ A - + OH - reakcje Gdy przeciwjon zastąpiony jonem analitu wówczas analit jest tymczasowo zatrzymany w kolumnie RóŜne anality róŝne powinowactwo i róŝny czas przebywania w fazie stacjonarnej i w kolumnie separacja

32 R-NR 3+ (HCO 3 ) - + A - RNR 3+ A - + HCO 3 - R-NR 3+ (HCO 3 ) - + B - RNR 3+ B - + HCO 3 - Stała równowagi czyli współczynnik selektywności K = [X - ] s [HCO ] m / [X ] m. [HCO 3- ] s a i = f i.c i - stęŝenia małe c i zamiast a i WyŜsza wartość K dłuŝszy czas retencji Masowy współczynnik podziału, D g = [X - ] s /[X - ] m Współczynnik retencji, k = D. (m Ŝ )/(V s )

33 Inne mechanizmy retencji: Jony organiczne: oddziaływania hydrofobowe intensyfikowane wysoką siłą jonową fazy ruchomej Pewne sytuacje: wykluczanie - duŝe cząsteczki słabo penetrują pory wypełnienia gdzie występuje większość centrów aktywnych Wykluczanie jonów: potencjał Donnana jony z tym samym ładunkiem nie wchodzą do porów (separacja obdarzonych ładunkiem od obojętnych)

34 Kolejność wymywania - obserwacje ogólne Czynniki zwiększające K (retencję): -Wzrost ładunku jonu -Wzrost promienia jonowego i polaryzowalności -Wzrost oddziaływań hydrofobowych np. jony z pierścieniem aromatycznym silniej oddziaływają z Ŝywicą polistyrenową dodatek modyfikatora organicznego moŝe odwrócić kolejność

35

36 Szeregi selektywności: Kationy: Li + < H + < Na + < NH 4+ < K + < Cs + < Ag +, Cu 2+ < Cd 2+ < Ni 2+ < Ca 2+ < Sr 2+ < Pb 2+ < Ba 2+ Aniony: F < OH < acetate < formate < Cl < SCN < Br < I < NO 2 3 < SO 4 < citrate Aktualny szereg selektywności charakterystyczny dla konkretnego wymieniacza Wymieniacze typu słabych kwasów - preferowane jony H + Wymieniacze typu słabych zasad - preferowane jony OH

37 Optymalizacja separacji: Siła jonowa, ph, temperatura, natęŝenie przepływu, stęŝenie buforu, stęŝenie modyfikatora organicznego Siła jonowa kontrola retencji (wartości k) ph kontrola selektywności ph = pk a ± [ ionized ] [ non ionized ] Optymalne ph buforu ph = pk a (1 2) dla zasad ph = pk a + (1 2) dla kwasów Zmiany temperatury zmiana selektywności przytrzymywane jedynie w postaci zdysocjowanej Modyfikator organiczny najwaŝniejszy jeśli retencja kontrolowana przez mechanizmy faz odwróconych

38 Siła jonowa siła elucyjna wzrasta z siłą jonową; na selektywność mały wpływ; przeciwjon eluentu kontroluje wielkość oddziaływania z fazą stacjonarną ph kontrola selektywności; wzrost ph: spadek retencji w chromatografii kationowymiennej i wzrost w anionowymiennej Modyfikator organiczny najwaŝniejszy jeśli retencja kontrolowana przez mechanizmy faz odwróconych (wzrost siły jonowej); zmiana modyfikatora to zmiana selektywności jak w HPLC; obniŝenie lepkości polepszenie przenoszenia masy

39 NatęŜenie przepływu sprawność: natęŝenia niŝsze niŝ w innych HPLC aby zwiększyć rozdzielczość i poprawić kinetykę wymiany masy Bufor siła elucyjna i selektywność zaleŝna od przeciwjonu soli buforu; sól buforu równieŝ wpływa na ph Wzrost temperatury poprawia kinetykę wymiany masy i obniŝa lepkość fazy ruchomej

40 Supresor zmniejszenie tła pochodzącego od eluentu przez obniŝenie przewodnictwa eluentu po opuszczeniu kolumny Kolumna tłumienia (lata 80-te - przestarzały sposób): konieczność regeneracji; poszerzenie pasm Separacja anionów Za kolumną anionowymienną kolumna z silnym kationitem Ŝywica H + + NaOH Ŝywica Na + + H 2 O (eluent) Konwersja rozdzielanych anionów do kwasów Ŝywica H + + M + + A - Ŝywica M + + H + +A - (a) Separacja kationów Za kolumną kationowymienną kolumna z silnym anionitem Ŝywica OH - + HCl Ŝywica Cl - + H 2 O (eluent) Konwersja rozdzielanych kationów do zasad Ŝywica OH - + M + + Cl - Resin Cl - + M + + OH - (b)

41 Często stosowane eluenty w IC anionów z detekcją koduktometryczną poprzedzoną supresją jonów eluentu Eluent Jon eluentu Produkt supresji Siła elucyjna Na 2 B 4 O 7 B 4 O 7 2- H 3 BO 3 b.słaba NaOH OH - H 2 0 słaba NaHCO 3 HCO 3 - CO 2 + H 2 0 słaba NaHCO 3 /Na 2 CO 3 HCO 3- / CO 3 2- CO 2 + H 2 0 Dość silny H 2 NCH(R)C00H/ NaOH RNHCH(R )SO 3 H/ NaOH H 2 NCH(R)C00 - RNHCH(R )SO 3 - H 3 N + CH (R)COO - RNH 2+ CH( R )SO 3 - Na 2 CO 3 CO 3 2- CO 2 + H 2 0 silny Dość silny Dość silny

42 Eluenty w chromatografii jonowej kationów Wybór funkcją detektora: Metale alkaliczne, amoniak, małocząsteczkowe aminy na mocnych kationitach kwasy mineralne (HCl, H 2 SO 4, HNO 3 ) niezaleŝne czy detekcja z supresją czy bez Kwas metanosulfonowy tylko przy eletrolitycznie generowanym supresorze Dwuwartościowe jony rozcieńczone kwasy mineralne za słabe Metale ziem alkalicznych mieszanina kwasu 2,3- diaminopropionowego i solnego IC bez supresji mieszanina etylenodiaminy i alifatycznych kwasów dikarboksylowych

43

44 Supresor MSM firmy Metrohm: trzy kolumny tłumienia; 1- regeneracja kwasem siarkowym; 2 przemywanie wodą dejonizowaną; 3 połączona z kolumną rozdzielającą (aktualnie pracująca). Mała pojemność mała siła jonowa eluentu; małe szumy w przypadku kolumn tłumienia

45 Ciągła regeneracja, eluent - 3 drogi, dwie: elektroliza jony do regeneracji, jedna do złoŝa supresji, 200µL, mała sprawność

46 Na2SO4 SO 4 2- do ścieków do ścieków Na2SO4 Na + CO 3 2-, HCO3 Na + 2- SO 4 H + H2SO4 do detektora H2CO3 Aniony X - w eluencie Na2CO3/NaHCO3 H2SO4 Ścianka kapilary H + Włókno kationowymienne Włókno kationowymienne Ścianka kapilary

47 BaCl2 Ba 2+ do ścieków Kationy Y + w eluencie HCl do ścieków BaCl2 Cl - H + Cl - Ba 2+ Ba(OH)2 do detektora H2O Ścianka kapilary OH - OH - Włókno anionowymienne Włókno anionowymienne Ścianka kapilary Ba(OH)2

48 H20, O2 do ścieków H + OH - Na + OH - Na +, X -, w eluencie NaOH NaOH, H2 do ścieków 4 H + + O H OH - 2 H2O do detektora X -, w H2O 2 H 2 O 2 H 2 O H2O Membrana kationowymienna Membrana kationowymienna Anoda Katoda H +

49 Reakcje zobojętniania w supresorze z autoregeneracją (CSRS)

50 DuŜy zakres liniowości (0,1 do 100 mg/l), MSA (H + ) całkowicie zdysocjowany Transport jonów w supresorze CSRS-S.C.: ES - supresor eluentu; AC konwertor analitu. Analit np. NH 4+ jako kwas metanosulfonowy w znikomym tle tego samego kwasu

51

52 Roztwór regenerujący (regenerant) pod ciśnieniem 5-10 psi z natęŝeniem 5-10 ml/min. ZuŜyty środek - do ścieków. StęŜenie H2SO4 10 mmol/l w warunkach elucji izokratycznej, ale 2- krotnie większe w IC gradientowej

53 Wymieniacz jonowy Schemat supresora mikromembranowego pracującego w systemie AutoRegen dla pracy ciągłej (kilkudniowej). Czas pracy = pojemność/(stęŝenie x natęŝenie przepływu) nawet do 30 dni dla anionów nieorganicznych

54 Regenerant jest wypierany przez eluat wypływający z celki konduktometrycznej dodatkowa pompa zbyteczna. Zbiorniki eluentu i regeneranta jednakowej objętości

55 Eluat z celki konduktometryczne jako źródło potrzebnej wody dejonizowanej. W supresorze przeciwjony wymieniane są na jony hydroniowe. Eluat z supresora to praktycznie dejonizowana woda (z wyjątkiem nielicznych jonów analitu). Stosowalny z czystymi eluentami wodnymi.

56 Supresor stanowi monolityczny wymieniacz jonowy. ZłoŜe monolityczne pocięte w plastry i poprzedzielane przez krąŝki z otworami. Jony eluentu wymieniane są na jony regenerentu generowane na anodzie.

57 UWAGI PRAKTYCZNE W IC wykorzystywać najwyŝej 5% pojemności jonowej kolumny Stosować stałe ph a siłę elucyjną zmieniać poprzez siłę jonową JeŜeli analit ma fragmenty hydrofobowe a fazą stacjonarną jest organiczny kwas lub zasada lub faza opiera się na kopolimerze PS i DVB dodatek modyfikatora organicznego aby zmniejszyć oddziaływania hydrofobowe Dodatek substancji przeciwgrzybowych NaN3, kwas kapronowy, fenol, krezol Płukać okresowo tłok pompy

58 ALTERNATYWNE - dla chromatografii jonowymiennej - SPOSOBY ROZDZIELANIA JONÓW IPC Chromatografia par jonowych z zastosowaniem sorbentów C18, C8, C2. Przykłady substancji tworzących pary jonowe: kwasy alkilosulfonowe; zasady alkiloamoniowe RP Cofanie dysocjacji kwasów i zasad układy faz odwróconych IEC Wykluczanie jonowe rozdzielanie słabych kwasów i zasad chromatografia jonowo wykluczająca Dodatek substancji przeciwgrzybowych do eluentu / próbki / roztworu wsadu do rozdzialnia (biocydów) - NaN 3, kwas kapronowy, fenol, krezol