NOVA Gel SS-A/SS-B T Przeznaczenie Podsumowanie i wyjaśnienie testu Zasada badania

Transkrypt

1 NOVA Gel SS-A/SS-B T Do diagnostyki in vitro Przeznaczenie NOVA Gel TM SS-A/SS-B jest systemem testów podwójnej dyfuzji do ustalania miana i półilościowego określania przeciwciał przeciwko SS-A/SS-B, ekstrahowalnemu antygenowi jądrowemu (ENA) w ludzkiej surowicy. Obecność przeciwciał przeciwko SS-A/SS-B może być wykorzystana w powiązaniu z innymi testami serologicznymi i wynikami klinicznymi w celu wsparcia diagnozy toczenia rumieniowatego układowego (SLE) oraz innych powiązanych chorób tkanki łącznej, takich jak zespół Sjogrena. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Pojęcie przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) opisuje różnorodne przeciwciała, które wchodzą w reakcję ze składnikami jąder komórkowych, w tym z DNA, RNA oraz wieloma białkami i rybonukleoproteinami. 1 Te przeciwciała często występują u pacjentów z chorobami tkanki łącznej lub reumatycznymi, szczególnie SLE. Praktycznie wszyscy pacjenci SLE są ANA-pozytywni. Ta wrażliwość diagnostyczna doprowadziła do włączenia testowania ANA do Poprawionych kryteriów z 1982 r. klasyfikacji toczenia rumieniowatego układowego przez podkomisję Stowarzyszenia ds. reumatologii i zapalenia stawów. 2 Pomimo tego, że badanie ANA jest doskonałym badaniem przesiewowym dla SLE (wynik negatywny praktycznie wyklucza aktywne SLE 3 ), w żadnym wypadku nie jest to badanie swoiste. Obecnym trendem w diagnozowaniu i leczeniu chorób tkanki łącznej jest łączenie wrażliwych testów przesiewowych AVA z bardziej swoistymi testami uzupełniającymi, takimi jak dsdna i/lub ENA. Testy ENA są szczególnie ważne, ponieważ dostarczają one informacje diagnostyczne i prognozowe. Autoprzeciwciała przeciwko SS-A znajdują się u 40-50% pacjentów z zespołem Sjogrena oraz u 25% pacjentów z pozytywnym ANA SLE. 4,5 Przeciwciała przeciwko SS-B znajdują się u 23% pacjentów z zespołem Sjogrena oraz 5-10% pacjentów z SLE. 4,5 Przeciwciała SS-A i S -B S zostały znalezione u niektórych pacjentów, którzy mają kliniczne objawy SLE, w tym wyraźne oznaki skórne, ale którzy wykazują pozytywne ANA, szczególnie, gdy jako substrat używane są skrawki gryzonia. 6,7 Przeciwciała przeciwko SS-A i SS-B są silnie związane z noworodkowym SLE oraz wrodzonym blokiem serca. 5,8 Wiele badań wskazuje na używanie przeciwciał SS-B jako znacznika serologicznego dla zespołu SS-sicca, ponieważ przeciwciała SS-B są wykrywane u około 60% takich pacjentów. 9,10 Zasada badania Test podwójnej dyfuzji, opisany przez Ouchterlony, 11 obejmuje wykorzystanie roztworu antygenu, który pasywnie przechodzi przez żelowe podłoże podtrzymujące w kierunku próbki pobranej od pacjenta i/lub przeciwciała zawierającego kontrolę. Specjalnie wyprofilowane dołki umieszczone w podłożu żelowym, pełnią funkcję zasobników, z których roztwory antygenu i przeciwciała przedostają się do siebie. W punkcie zrównoważenia antygenu i przeciwciała, w żelu tworzy się widoczna linia precypityny. Następnie można określić stan immunologiczny pacjenta, poprzez obserwowanie wzorów sąsiednich linii precypityny, formujących się w żelu, przy użyciu próbki kontrolnej znanej swoistości i nieznanej surowicy pacjenta. 1

2 Technika podwójnej dyfuzji może być używana z oczyszczonym preparatem SS-A/SS-B, znaną próbką kontrolną autoprzeciwciała SS-B lub SS-A oraz surowicą pacjenta, która prawdopodobnie zawiera autoprzeciwciała SS-B oraz/lub SS-A w celu wykazania tożsamości immunologicznej lub braku tożsamości. Potwierdzenie aktywności autoprzeciwciał SS-B oraz/lub SS-A w surowicy pacjenta można zrealizować, jeśli jego linia precypityny w charakterystyczny sposób łączy się z linią utworzoną przez znaną próbkę kontrolną. W pewnych przypadkach wymagane jest półilościowe określanie ilości autoprzeciwciał SS-B oraz/lub SS-A w surowicy pacjenta. W takich przypadkach płytka NOVA Gel T może być używana do badania seryjnie rozcieńczanych próbek otrzymanych od pacjenta. Wielkość odwrotna najwyższego rozcieńczenia, które tworzy linię wydzielania się, może być wtedy stwierdzone jako miano autoprzeciwciała SS-B oraz/lub SS-A dla pacjenta. Prawidłowa procedura testowania podwójnej dyfuzji wymaga badana wielu proporcji stężenia antygen przeciwciało, aby nie dopuścić do uzyskania nadmiaru antygenu lub przeciwciała. Nieprawidłowe lub mylne utworzenie linii precypityny może wystąpić w przypadku nadmiaru antygenu lub przeciwciał. Aby tego uniknąć, roztwory surowicy pacjenta powinny być badane wraz z tym samym preparatem antygenu. Można to zrealizować jednocześnie przy ustalaniu stężenia próbki pobranej od pacjenta na płytce NOVA Gel T. Odczynniki 1. Płytki żelowe NOVA Gel T do miarczekowania, każda z 7 dołkami, zawierające stabilizatory oraz azydek sodu 0,09% 2. 0,4 ml antygenu SS-A/SS-B (z grasicy cielęcej), liofizowanej w buforze zawierającym stabilizatory i azydek sodu 0,09% 3. 0,7 ml kontroli SS-B, surowica ludzka zawierająca autoprzeciwciała przeciwko SS-B w buforze zawierającym azydek sodu 0,09% 4. 0,7 ml kontroli SS-A, surowica ludzka zawierająca autoprzeciwciała przeciwko SS-A w buforze zawierającym azydek sodu 0,09% Ostrzeżenia 1. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HbsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. W związku z tym kontrola SS-B oraz kontrola SS-A powinna być obsługiwana w taki sam sposób jak potencjalnie zakaźny materiał Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 3. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 4. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. 2

3 Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Do uwadniania antygenu zalecane jest używanie wody destylowanej lub dejonizowanej. 4. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmuje to temperaturę początkową odczynników, zapobieganie wylewaniu się odczynników lub próbek otrzymanych od pacjenta z dołków oraz jakość wody stosowanej do uwadniania antygenu. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 5. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. Warunki przechowywania Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. Po uwodnieniu antygen zachowuje trwałość przez 2 tygodnie w temperaturze 2 8 C. W razie potrzeby można przygotować 100 µl próbek, które należy przechować w temperaturze -70 o C. Antygen przechowywany w taki sposób zachowuje trwałość przynajmniej przez 1 rok. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 8 dziurkowanych płytek do miareczkowania NOVA Gel T 2 0,4 ml antygenu SS-A/SS-B, liofizowanego 1 0,7 ml kontroli SS-B 1 0,7 ml kontroli SS-A Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety o pojemności µl Jednorazowe końcówki mikropipet 0,85% soli fizjologicznej Woda destylowana lub dejonizowana (najlepiej jałowa) Źródło światła lub pudełko do podglądu żelu 3

4 Sposób przygotowania 1. Uwodnić antygen SS-A/SS-B Ostrożnie otworzyć fiolkę z antygenem i dodać 0,4 ml destylowanej lub dejonizowanej wody do liofilizatu antygenu. W celu uzyskania optymalnych wyników zalecane jest używanie jałowej wody destylowanej lub dejonizowanej. Pozostawić uwodniony antygen na 5 minut, a następnie dobrze wywirować przed użyciem. 2. Napełnianie płytki żelowej Przygotować dwie serie roztworu próbki pacjenta w soli fizjologicznej 0,85%. Napełnić dołki płytki żelowej antygenem (około 80 µl), kontrolą (około 80 µl) oraz roztworami próbki pacjenta (około 80 µl), jak przedstawiono poniżej. Wartości napełniania nie są krytyczne, jednak NIE NALEŻY PRZEPEŁNIAĆ DOŁKÓW. Kontrola może być napełniona bezpośrednio z plastikowych gruszek laboratoryjnych lub mikropipet. W przypadku używania gruszek laboratoryjnych należy umieścić końcówkę dozownika w dołku i delikatnie ścisnąć, aby poziom kontroli zbliżył się do górnej krawędzi dołka. Przykryć płytkę natychmiast po napełnieniu. 3. Inkubacja Pozostawić przykryte płytki do inkubacji w temperaturze pokojowej na stabilnej płaskiej powierzchni na 24 godziny. Sprawdzić płytki i zwrócić uwagę na linie precypityny, które powstają pomiędzy próbką od pacjenta a antygenem. Sprawdzić powiązanie tej linii z linią precypityny jednej z kontroli. Ponownie sprawdzić płytki po 48 godzinach, aby przed końcową interpretacją wyników ustalić, czy powstały nowe linie. Kontrola jakości Kontrole SS-B oraz/lub SS-A powinny być umieszczone na każdej płytce w celu zapewniania, aby wszystkie odczynniki i zabiegi zostały przeprowadzone prawidłowo. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < -70 o C. Aby wyniki testów były traktowane jako wiążące, linia precypityny musi być widoczna pomiędzy kontrolami SS-B oraz/lub SS-A oraz dołkami SS-A/SS-B. 4

5 Interpretacja wyników W celu uzyskania optymalnej analizy linii precypityny zalecane jest zastosowanie poniższej procedury: 1. Zdjąć pokrywę płytki. 2. Przytrzymać płytkę w takiej pozycji, aby maksymalnie ograniczyć odbicie powierzchni żelu. 3. Podświetlić płytkę żelową z boku (np. równolegle do powierzchni żelu). Uwaga: Należy zwrócić uwagę, aby źródło światła było zasłonięte przed bezpośrednim widokiem. 4. Linie precypityny są najlepiej widoczne, gdy są umieszczone na ciemnym tle i oglądane pod kątem. 5. Szkło powiększające może pomóc w obserwacji mniej widocznych linii lub w celu rozróżniania niezidentyfikowanych próbek. Reakcja negatywna. Próbka jest traktowana jako negatywna, jeśli po 48 godzinach nie ma żadnych widocznych linii precypityny pomiędzy dołkami pacjenta oraz dołkami antygenu. Interpretacja swoistości. W przypadku podwójnej dyfuzji swoistość jest określana poprzez porównanie relacji linii precypityny próbki z liniami znanej kontroli. W przypadku testu NOVA Gel SS-A/SS-B występują następujące możliwości: Rys. 1: Brak identyfikacji Rys. 2: Tożsamość SS-A R y s. 3 : T o ż s a m o ś ć -B S S -A i S S Linia precypityny przechodzi lub wykazuje brak tożsamości z kontrolami SS-B i SS-A. Wskazuje to, że pacjent reaguje z antygenem ENA innym niż SS-B lub SS-A. Linia precypityny pacjenta łączy się lub wskazuje tożsamość z linią kontroli SS-A. W tym przypadku pacjent ma autoprzeciwciała przeciwko SS-A. Pacjent ma dwie linie precypityny. Jedna z linii wskazuje tożsamość z kontrolą SS-B, a druga z kontrolą SS-A. Ten pacjent posiada autoprzeciwciała przeciwko SS-B i SS-A. Ograniczenia badania 1. Chociaż jest to mało prawdopodobne w przypadku tego testu z powodu serii rozcieńczeń próbki, to prozoning jest możliwy. Efekt prozone zachodzi, gdy występuje przytłaczająca ilość autoprzeciwciał pacjenta w stosunku do antygenu (nadmiar przeciwciał), skutkiem czego linia precypityny powstaje przy krawędzi dołka antygenu. W takich przypadkach zalecane jest ponowne testowanie możliwych pozytywnych próbek przy wyższym rozcieńczeniu w celu wyeliminowania fałszywej negatywnej interpretacji testu. 2. Jeśli do uwadniania antygenu używana jest niejałowa lub zanieczyszczona woda, antygen może wykazywać natychmiastową lub progresywną degradację. W takim przypadku może pojawić się bardzo delikatna linia precypityny lub może nie pojawić się w ogóle. 3. Kontrola SS-B nie jest monoswoista i może zawierać część SS-A. 5

6 4. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 5. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Test podwójnej dyfuzji NOVA Gel SS-A/SS-B został użyty do oszacowania różnorodności pacjentów z chorobami tkanki łącznej oraz 200 losowo wybranych dawców krwi. Wyniki znajdują się poniżej: Grupa pacjentów Numer Test NOVA Gel ENA na liczbę pozytywnych Pozytywne SS-B Pozytywne SS-A SLE Toczeń polekowy Reumatoidalne zapalenie stawów Twardzina Zapalenie skórno-mięśniowe Zespół Sjogrena Normalne

7 Piśmiennictwo 1. Tan E. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan E, et. al. The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ, Myers LL. Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Alexander, EL et al. Ro(SS-A) and La(SS-B) antibodies in the clinical spectrum of Sjogren's Syndrome, J Rheumatol 9: , Kephart DC et al. Neonatal Lupus Erythematosus: New Serologic Findings, J Invest Derm 77: , Provost TT et al. Antibodies to cytoplasmic antigens in lupus erythematosus-serologic disease. Arth and Rheum 20: , Maddison PJ, Provost TT, Reichlin M. Serological findings in patients with "ANA negative" systemic lupus erythematosus. Medicine 60:87-93, Franco HL et al. Autoantibodies directed against sicca syndrome antigens in the neonatal lupus syndrome. J. Am Acad Dermatol 4:67-72, Alspaugh MA, Tan EM. Serum antibody in rheumatoid arthritis reactive with a cell associated antigen, Arth and Rheum 19: , Scopelitis E, Biundo JJ and Alspaugh MA. Anti-SS-A antibody and other anti-nuclear antibodies in systemic lupus erythematosus, Arth and Rheum 23: , Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. Prog Allergy 5:1, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition,

8 NOVA Gel jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Merzec 2011 Wersja 0 8