Ocena przydatności wykorzystania żyta hybrydowego firmy KWS Lochow Polska sp. z o.o. w opasie młodego bydła rzeźnego

Transkrypt

1 RAPORT KOŃCOWY z doświadczenia wykonanego dla KWS LOCHOW POLSKA Sp. z o.o. Ocena przydatności wykorzystania żyta hybrydowego firmy KWS Lochow Polska sp. z o.o. w opasie młodego bydła rzeźnego Kierownik: dr hab. Marek Pieszka, prof. nadzw. IZ PIB Instytut Zootechniki PIB w Balicach - Dział Żywienia Zwierząt i Paszoznawstwa Współwykonawcy: Dr inż. Marian Kamyczek Instytut Zootechniki PIB Zakład Doświadczalny Pawłowice Dr inż. Magdalena Łopuszańska-Rusek - Instytut Zootechniki PIB w Balicach Dział Żywienia Zwierząt i Paszoznawstwa prof. dr hab. Władysław Migdał - Uniwersytet Rolniczy w Krakowie Katedra Przetwórstwa Produktów Zwierzęcych Wydziału Technologii Żywności Jednostki realizujące badania: Dział Żywienia Zwierząt i Paszoznawstwa Instytutu Zootechniki PIB Instytut Zootechniki PIB Zakład Doświadczalny Pawłowice Jednostki wykonujące usługi: Centralne Laboratorium Instytutu Zootechniki PIB Katedra Przetwórstwa Produktów Zwierzęcych Wydziału Technologii Żywności Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie Okres realizacji badań: Balice, listopad 2011

2 Doświadczenie II Ocena przydatności wykorzystania żyta hybrydowego firmy KWS-Lochow Polska Sp. z o.o. w opasie młodego bydła rzeźnego Celem podjętych badań było określenie optymalnego udziału w mieszance treściwej oraz wpływ stosowania żyta hybrydowego na parametry tuczne i rzeźne rosnących buhajków rasy polskiej holsztyńsko-fryzyjskiej odmiany czarno-białej. Materiał i metody Doświadczenie przeprowadzono w ZD IZ Pawłowice na 30 buhajkach rasy Polskiej Holsztyńsko-Fryzyjskiej odmiany czarno-białej przydzielonych losowo do 3 grup po 10 sztuk w każdej. Opas rozpoczynał się gdy zwierzęta osiągnęły masę ciała 200 kg (tj. w około 7-8 miesiącu życia). Tucz prowadzono do osiągnięcia przez zwierzęta masy ciała 600 kg (wiek ok. 19 m-cy). Zwierzęta otrzymywały kiszonkę z kukurydzy, kiszonkę z lucerny, wysłodki buraczane oraz mieszankę treściwą w ilości podanej w tabeli 3. Mieszanki zawierały w swoim składzie 0 lub 20% i hybrydowego odmiany Visello, które w mieszance zastępowało pszenicę. Mieszanki skarmiano w ilości podanej w tabeli 1. Zwierzęta żywiono indywidualnie według norm DLG, odważając kiszonkę z dokładnością ± 0,5 kg, a mieszankę treściwą z dokładnością ± 0,1 kg. Niedojady ważono raz w tygodniu. W odstępach comiesięcznych kontrolowano masę ciała zwierząt. Skład chemiczny pasz oznaczono metodami (AOAC, 1995) w Centralnym Laboratorium IZ-PIB będącym Laboratorium Referencyjnym spełniającym normę PN-EN ISO/IEC posiadającym akredytację nr 512 Polskiego Centrum Akredytacji. Po zakończeniu doświadczenia buhajki skierowano do uboju. Oceniono mięsność oraz klasę poszczególnych półtusz wycenioną według skali EUROP. Ponadto pobrano próbki z mięśnia najdłuższego (M. longissimus dorsi) z okolicy ostatniego kręgu piersiowego i pierwszego kręgu lędźwiowego, Oznaczono skład chemiczny (Budsławski i Drabent, 1972), ph - mierzono pehametrem w 45 minut po uboju, a następnie po schłodzeniu w temperaturze 4ºC według Polskiej Normy PN-77 A W próbkach mięsa oznaczono parametry jakości: barwa mięsa w systemie L*a*b* (CIE, 1976), wodochłonność oznaczona metodą Graua i Hamma (1953), ubytki cieplne (straty soków mięsnych) podczas przygotowania mięsa do oceny tekstury mięsa. Ocena tekstury mięsa została wykonano według metodyki opisanej przez Breene (1975) przy użyciu teksturometru Texture Analyzer TA XT2 firmy Stable Micro Systems z przystawką Warnera-Bratzlera. Oznaczono takie parametry jak: siła cięcia, twardość, sprężystość, żujność, odbojność i kohezja. W próbkach mięsa oznaczono chromatograficznie: skład kwasów tłuszczowych po uprzedniej ekstrakcji tłuszczu metodą

3 Folcha (1957), zawartość cholesterolu według zmodyfikowanej metody Russo i in. (2005), poziom witaminy E i A według metody podanej przez Ueda i Igarashi (1987) oraz poziom TBARS po okresie przechowywania próbek mięsa przez okres 3 miesięcy w zamrożeniu według zmodyfikowanej metody podanej przez Pikula (1993). Uzyskane wyniki badań opracowano statystycznie stosując jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA natomiast dla określenia istotności różnic zastosowano test Tukey a z wykorzystaniem programu Statgraphics Plus 4.0. Istotność różnic testowano przy poziomach istotności P 0,05 i P 0,01. Wyniki i ich omówienie Ważnym czynnikiem decydującym o jakości mięsa wołowego jest sposób żywienia. Obowiązuje zasada, by w pierwszym okresie życia cielęta poić zmniejszoną ilością mleka dążąc do wczesnego rozwoju przedżołądków. Przyrosty w tym okresie nie powinny być mniejsze niż gramów dziennie. W drugim etapie opasu przyrosty dobowe nie powinny być niższe od gramów, bo tylko takie przyrosty pozwolą na uzyskanie bydła dobrze umięśnionego, z którego otrzymamy mięso kulinarne wysokiej jakości. Stopień intensywności żywienia może wywierać wpływ na otłuszczenie tusz wołowych. W przeprowadzonym doświadczeniu zastosowano 0, 20 i 40% udział żyta hybrydowego odmiany Visello w mieszance treściwej w opasie bydła rzeźnego według schematu podanego w tabeli 1. Buhajki przydzielono do 3 grup żywieniowych po 10 sztuk w każdej. Skład oraz wartość pokarmową pasz treściwych wchodzących w skład dawek pokarmowych przedstawiono w tabeli 2 i 3. Dawki pokarmowe charakteryzowały się zbliżoną zawartością białka oraz wartością pokarmową (nbo białko, MJ energia netto). Można więc wnioskować, że przy takich samych warunkach utrzymania wszystkich grup, czynnikiem doświadczalnym mógł być rodzaj paszy. Opas buhajków rozpoczęto przy masie ciała 200 kg a długość opasu wynosiła 275 dni. Stwierdzono istotne zróżnicowanie (P 0,05) w końcowej masie ciała buhajków po zakończeniu tuczu. Zwierzęta z grupy otrzymującej uzyskały najwyższą masę ciała 615,2 kg, kolejno buhajki z grupy kontrolnej 595,7 kg, a najniższą średnią masą ciała odznaczały się zwierzęta grupy z udziałem w mieszance 588,4 kg. Średnie dobowe przyrosty masy ciała za cały okres opasu były wysokie i kształtowały się w przedziale między 1280 g a 1350 g (tab. 5). Wysoki jak na rasę mleczną poziom przyrostów masy ciała buhajków świadczy o odpowiedniej do zapotrzebowania podaży energii i białka w dawce pokarmowej w trakcie opasu. Na rys. 1 przedstawiono narastająco średnie dzienne przyrosty masy ciała buhajków w poszczególnych grupach żywieniowych w kolejnych miesiącach opasu.

4 Najniższe zużycie paszy na kg przyrostu masy ciała stwierdzono w grupie otrzymującej, gdyż wynosiło 12,87 kg/kg natomiast w grupie kontrolnej i w grupie z udziałem odpowiednio: 13,10 i 13,09 kg/kg. Najwyższą masę tusz uzyskano od zwierząt z grupy otrzymującej, gdyż były one średnio o 10 kg cięższe w porównaniu do masy tusz pozostałych grup, jakkolwiek nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic. Tusze pochodzące od zwierząt z grup otrzymujących żyto hybrydowe (20% i 40%) charakteryzowały się wyższą wydajnością rzeźną o 1% w porównaniu do grupy kontrolnej (tab. 6). Tusze zwierząt we wszystkich grup żywieniowych charakteryzowały się podobnym średnim otłuszczeniem (O2). Zdania są podzielone, jeśli chodzi o ilość tłuszczu śródmięśniowego w mięsie wołowym. W Europie środkowej poszukiwane jest mięso nieznacznie marmurkowate; w krajach Ameryki Północnej i Południowej najchętniej jest spożywane mięso silnie marmurkowate. Wiąże się to z potwierdzonym faktem, iż marmurkowatość korzystnie wpływa na kruchość, soczystość i smakowitość mięsa wołowego (Bruns i in., 2004). Należy w tym miejscu przypomnieć, że stopień marmurkowatości mięsa jest wysoko skorelowany z ogólną zawartością tłuszczu w tuszy. Odkładaniu się tłuszczu wewnątrz mięśni towarzyszy zazwyczaj odkładanie się tłuszczu międzymięśniowego, podskórnego i wewnętrznego. Większe ilości tych tłuszczów w tuszy są niepożądane. Wiadomo też, że tłuszcz najpierw odkłada się w okolicy nerek i jelit, w następnej kolejności odkładany jest tłuszcz podskórny, a jako ostatni odkłada się dopiero tłuszcz międzymięśniowy i śródmięśniowy. Dlatego też trudno jest wyprodukować tusze, które zawierałyby w mięsie dużo tłuszczu śródmięśniowego, a małe ilości pozostałych tłuszczów. Powszechnie uważa się, że zawartość tłuszczu w mięsie ma istotny wpływ na wrażenia sensoryczne. W Stanach Zjednoczonych wyznaczono poziom 3% tłuszczu w mięśniu najdłuższym, jako granicę, poniżej której smakowitość mięsa gwałtownie spada. W Wielkiej Brytanii poziom ten wynosi 2,1%, zaś w Danii - 1,7%. W najnowszych badaniach sugeruje się, by poziom ten nie był mniejszy niż 1%, oraz że inne czynniki niż marmurkowatość wpływają na pożądalność sensoryczną wołowiny (Bruns, 2004). Również badania konsumenckie wykazują, że łatwo można się zaadaptować do spożywania mięsa wołowego o niskiej zawartości tłuszczu. W przeprowadzonej analizie sensorycznej próbek mięsa nie stwierdzono istotnego zróżnicowania m.in. w takich cechach jak siła cięcia, twardość, sprężystość, kohezja, gumowatość, żujność i odbojność. Próbki mięsa pochodzące od buhajków grupy kontrolnej charakteryzowały się istotnie niższym ph 45 w porównaniu do mięsa pochodzącego od zwierząt z grup doświadczalnych. Po schłodzeniu mięsa przez 24h nie stwierdzono zróżnicowania w ph, gdyż zawierało się w zakresie 6,30-6,40. Nie stwierdzono zróżnicowania w barwie mięsa mierzonej w systemie L*a*b*. Zastosowanie zwiększonego udziału żyta hybrydowego w mieszance treściwej korzystnie wpłynęło na wzrost ilości kwasów nienasyconych z poziomu 12,60 % w grupie

5 kontrolnej do poziomu 16,40 i 14,63% w grupach doświadczalnych (P 0,05). Wzrostowi zawartości kwasów PUFA towarzyszyło istotne obniżenie zawartości kwasu C18:0 w grupie otrzymującej (P 0,05). Stwierdzono istotne obniżenie zawartości kwasów nasyconych SFA w mięsie buhajków otrzymujących w mieszance treściwej 20% udział żyta w porównaniu do pozostałych grup żywieniowych (P 0,05). Również zaobserwowano korzystną tendencję do wyższej zawartości kwasów PUFA z rodziny n-3 w grupach doświadczalnych (20% i ) odpowiednio 1,39% i 1,23% w porównaniu do grupy kontrolnej 0,97%. Ponadto w mięsie pochodzącym od buhajków z grup doświadczalnych stwierdzono istotnie wyższy poziom witaminy E odpowiednio 3,02 i 3,08 µg/g w porównaniu do grupy kontrolnej 2,65 µg/g (P 0,05). Zawartość witaminy A w mięsie kształtowała się na podobnym poziomie we wszystkich grupach. Nie stwierdzono również istotnego wpływu zastosowanej dawki żywieniowej zawierającej udział 20% i w mieszance treściwej na zróżnicowanie zawartości cholesterolu ogólnego w mięsie. Nie stwierdzono wpływu dawki pokarmowej na poziom oksydacji lipidów mięsa mierzony zawartością substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS), który mieścił się w zakresie 0,443 do 0,505 mg/kg. Wnioski: Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że buhajki rasy Polskiej Holsztyńsko-Fryzyjskiej odmiany czarno-białej odznaczają się wysokim potencjałem wzrostu. Przez pierwsze pięć miesięcy opasu stwierdzono wysokie przyrosty masy ciała buhajków świadczące o bardzo dobrym wykorzystaniu składników pokarmowych przez buhajki i zbilansowaniu dawek pokarmowych. Najwyższą masę ciała w okresie opasu (275 dni) uzyskały buhajki otrzymujące w diecie hybrydowego, w porównaniu do grupy kontrolnej i grupy otrzymującej hybrydowego. Uzyskane tusze, pochodzące od zwierząt z grup doświadczalnych żywionych żytem hybrydowym, charakteryzowały się wyższą wydajnością rzeźną o 1% w porównaniu do grupy kontrolnej. Stwierdzono istotny wzrost zawartości witaminy E w mięsie buhajków otrzymujących w dawce pokarmowej żyto hybrydowe. Stwierdzono korzystny skład kwasów tłuszczowych w mięsie pochodzących od buhajków otrzymujących w diecie żyto hybrydowe. Obserwowano tendencję do poprawy tekstury w mięsie pochodzącym od buhajków żywionych mieszanką z udziałem żyta hybrydowego.

6 Tabela 1 Schemat doświadczenia żywieniowego na buhajkach Wyszczególnienie Kontrolna Mieszanka 1 Doświadcz. Mieszanka 2 Doświadcz. Mieszanka 3 Udział żyta w mieszance, % Tabela 2 Skład i wartość pokarmowa mieszanek treściwych stosowanych w doświadczeniu: Udział w mieszance [%] Pasze Mieszanka 1 - kontrola Mieszanka 2 Mieszanka 3 Pszenica 50,0 30,0 10,0 Żyto hybrydowe - 20,0 40,0 Kukurydza 10,0 10,0 10,0 Otręby pszennae 10,0 8,0 10,0 Śruta rzepakowa 22,0 24,0 22,0 Kreda 1,2 1,2 1,2 Fosforan 1 Ca 0,8 0,8 0,8 Melasa 3,0 3,0 3,0 Olej 1,0 1,0 1,0 Premix 2,0 2,0 2,0 SUMA 100,0 100,0 100,0 Wartość pokarmowa [w 1kg SM] SM % 88,21 88,21 88,21 NEL (MJ) 10,84 10,85 10,79 BO % 16,12 16,14 15,35 TS % 3,31 3,17 3,10 WS % 5,06 5,09 5,13 Ca % 1,24 1,26 1,25 P % 0,79 0,77 0,77

7 Tabela 3 Skład dawek w poszczególnych okresach opasu buhajków Udział w mieszance [kg] Pasze Mieszanka 1 - Mieszanka 2 Mieszanka 3 kontrola 20% żyto 40% żyto I Etap opasu masa ciała 200 a 300 kg Kiszonka z kukurydzy Kiszonka z lucerny M1* 2, M2-2,65 - M ,65 Wartość pokarmowa [w 1kg SM] SM g ME (MJ) 57,39 57,42 57,23 BO g II Etap opasu masa ciała 300 a 400 kg Kiszonka z kukurydzy Kiszonka z lucerny M1 3,5 - - M2-3,5 - M ,5 Wartość pokarmowa [w 1kg SM] SM g ME (MJ) 74,3 74,4 74,6 BO g III Etap opasu masa ciała 400 a 500 kg Kiszonka z kukurydzy Kiszonka z lucerny M M2-4 - M Wartość pokarmowa [w 1kg SM] SM g E metabol. (MJ) 93,8 93,8 93,9 NEL (MJ) 57,1 57,0 57,2 BO g IV Etap opasu masa ciała 500 a 600 kg Kiszonka z kukurydzy Kiszonka z lucerny M1 4,5 - - M2-4,5 - M ,5 SM g E metabol. (MJ) 112,5 112,5 112,6 NEL (MJ) 68,5 68,4 68,64 BO g *skład mieszanek treściwych M1, M2 i M3 podano w tabeli 2

8 Tabela 4 Średnie dzienne pobranie paszy przez buhajki opasowe (SM, kg -1 /dzień) Grupy Pasze Pobranie dawki pokarmowej, kg: 1 3 miesiąc opasu 4 7 miesiąc opasu 7 do końca opasu wartość średnia. za cały okres opasu Mieszanka 1 - kontrola 10,26 15,61 26,27 17,74 Mieszanka 2 20% żyto 10,10 15,46 26,39 17,32 Mieszanka 3 40% żyto 10,19 15,56 26,21 16,79 0,029 0,17 0,32 0,24 P 0,08 0,95 0,97 0,27 Tabela 5 Średnia masa ciała i średnie przyrosty dzienne buhajków w poszczególnych grupach żywieniowych Ilość zwierząt Wyszczególnienie Masa ciała początkowa, kg Masa ciała końcowa, kg Ilość dni żywienia Śr. dzienny przyr. w okresie opasu, g Zużycie paszy na 1 kg przyrostu, kg Mieszanka 1 - kontrola ,7 ab ,10 żywieniowa Mieszanka 2 20% żyto ,2 b ,87 Mieszanka 3 40% żyto ,4 a ,09 Średnie wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami różnią się od siebie istotnie przy: a, b p 0,05; A, B p 0,01 5,12 14,53 1,12 P 0,11 0,12 0,09 Tabela 6. Ocena poubojowa tusz Wyszczególnienie Mieszanka 1 kontrolna Masa tuszy (kg) 300,37 Wydajność rzeźna (%) 49,99 Otłuszczenie O2 żywieniowa Mieszanka 2 309,48 50,31 O2+ Mieszanka 3 299,64 50,94 O2 2,910 0,192 P 0,31 0,12

9 Tabela 7 Parametry tekstury mięśnia najdłuższego (M. longissimus dorsi) Wyszczególnienie Siła cięcia, kg Twardość Sprężystość Kohezja Gumowatość Żujność Odbojność kontrolna 0% żyta 5,85 84,25 0,55 0,54 82,47 25,57 0,23 5,63 61,60 0,51 0,49 54,34 15,17 0,19 5,53 76,04 0,53 0,47 105,49 21,73 0,18 0,30 9,57 0,019 0,02 6,51 3,99 0,01 Tabela 8. Cechy fizyko-chemiczne mięśnia najdłuższego (M. longissimus dorsi) Wyszczególnienie ph 45 min ph 24h Barwa mięsa: L* a* b* kontrolna 0% żyta 6,62 aa 6,39 33,79 23,56 3,47 7,04 bb 6,42 32,10 23,40 5,22 6,91 abab 6,30 32,13 21,96 4,11 Średnie wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami różnią się od siebie istotnie przy: a, b p 0,05; A, B p 0,01 0,08 0,12 0,99 0,97 0,30

10 Tabela 9 Skład kwasów tłuszczowych w próbkach mięśnia najdłuższego (M. longissimus dorsi) wyrażony jako procent sumy kwasów Kwasy tłuszczowe C 10:0 C 12:0 C 14:0 C 14:1 C 15:0 C16:0 C 16:1 n-9 C 16:1 n-7 C 17:0 C 17:1 C 18:0 C 18:1 n-9 C 18:1 n-7 C 18:2 n-6 C 18:3 n-6 C 18:3 n-3 CLA C 20:0 C 21:1 C 20:2 n-6 C 20:3 n-6 C 20:4 n-6 C 20:5 n-3 C 22:4 n-6 C 22:5 n-3 C 22:6 n-3 SFA MUFA PUFA PUFA n-3 PUFA n-6 PUFA n6/n3 kontrolna 0% żyta 0,059 0,067 1,85 0,51 0,27 21,89 0,27 3,73 0,82 0,86 13,62 b 40,14 2,47 7,69 0,071 0,32 a 0,35 0,080 0,20 0,09 0,45 2,56 0,09 0,39 0,45 0,10 38,69 b 48,48 12,60 0,97 11,27 11,99 0,061 0,072 1,71 0,52 0,26 21,17 0,25 3,92 0,79 0,88 11,83 a 38,47 2,79 10,07 0,084 0,46 b 0,35 0,084 0,20 0,12 0,59 3,30 0,15 0,48 0,65 0,11 36,01 a 47,30 16,40 1,39 14,66 11,13 0,068 0,081 1,93 0,51 0,29 21,83 0,32 3,56 0,87 0,91 13,13 ab 38,47 3,03 9,03 0,081 0,42 ab 0,35 0,089 0,17 0,10 0,52 2,85 0,12 0,44 0,56 0,12 38,37 b 46,75 14,63 1,23 13,04 10,94 Średnie wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami różnią się od siebie istotnie przy: a, b p 0,05; A, B p 0,01 0,005 0,007 0,15 0,06 0,02 0,70 0,02 0,24 0,08 0,06 0,41 1,47 0,14 1,25 0,006 0,040 0,02 0,008 0,015 0,01 0,09 0,40 0,02 0,07 0,09 0,02 1,03 1,64 1,91 0,18 1,74 0,76

11 Tabela 10 Zawartość witaminy A i E oraz cholesterolu ogólnego w próbkach mięśnia najdłuższego (M. longissimus dorsi) Wyszczególnienie kontrolna 0% żyta Witamina A, µg/g 0,052 0,074 0,039 0,02 0,60 Witamina E, µg/g 2,65 a 3,02 b 3,08 b 0,11 0,02 Cholesterol ogólny, mg/100g 58,62 60,75 60,77 0,83 0,13 Średnie wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami różnią się od siebie istotnie przy: a, b p 0,05 P Tabela 11. Zawartość TBARS (substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym) w próbkach M. longissimus dorsi przechowywanych w temperaturze 19 0 C przez okres 3 miesięcy Wyszczególnienie kontrolna 0% żyta TBARS, mg/kg 0,496 0,505 0,443 0,03 0,40 P Rys. 1 Średnie dzienne przyrosty masy ciała buhajków w poszczególnych grupach żywieniowych przedstawione narastająco w kolejnych miesiącach opasu przyrost dzienny, g % żyta 20 % żyta 40 % żyta

12 Piśmiennictwo: AOAC., Association of Official Analytical Chemists Official methods of Analysis, 16 th ed., Arlington, Virginia, USA. Breene W. M Application of texture profile analysis to instrumental food texture evaluation. J. Texture Stud. 1975, 6, Bruns K.W., Pitchard R.H., Boggs D.L., (2004) - The relationships among body composition and intramuscular fat content in steers. J. Anim. Sci., 82: Budławski J., Drabent Z Metody analizy żywności. WNT, Warszawa. CIE CIE Publication No. 15 (E-1.3.1), 1971/tc-1-1), Suppl. 2. Recommendations on uniform color spaces-color difference equations. DLG (1997) Tabele wartości pokarmowej pasz i norm żywienia przeżuwaczy w opinii recenzentów. Lic. :DLG Verlags GmbH, Frankfurt a. Main., Niemcy. Folch J., Lees M., Stanley G.H.S A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, Grau R., Hamm R Eine einfache Methode zur Bestimmung der Wasserbindung im Muskel. Naturwissenschaften, 40: 29. Pikul J Ocena technologiczna surowców i produktów przemysłu drobiarskiego. Wyd. AR Poznań, Poznań, Polska Norma PN-77/A Mięso i przetwory mięsne. Oznaczanie ph. Russo M.V., De Leonardis A., Macciola V Solid phase extraction gaschromatographic method to determine free cholesterol in animal fats. J. Food Composit., Anal., 18, Ueda T., Igarashi O Effect of coexisting fat on the extraction of tocopherols from tissues after saponification as pretreatment for HPLC determination. J. Micronutr. Anal., 3,