Modyfikacje chemiczne do badań metabolizmu i zastosowań terapeutycznych mrna

Transkrypt

1 Modyfikacje chemiczne do badań metabolizmu i zastosowań terapeutycznych mrna Jacek Jemielity LABRATRIUM CHEMII BIRGANICZNEJ Centrum Nowych Technologii Uniwersytet Warszawski Zakład Biofizyki, Wydział Fizyki IGIB, Uniwersytet Warszawski Warszawa, 19 stycznia 2018

2 MNGŚĆ FUNKCJI MNGŚĆ ZASTSWAŃ

3 Nowe metody syntezy Temat 1 Analogi nukleotydów modyfikowane w mostku fosforanowym Reagenty do modyfikacji RNA i DNA Wanat et al. rg. Lett. 17, (2015) Strenkowska et al. rg. Lett., 14, (2012) Warminski et al. EurJC 2015, (2015) Dabrowski-Tumanski et al. EurJC 2013, (2013) Nukleotydy znakowane i nukleotydowe sondy molekularne Walczak et al. Chemical Science 8, (2017) Wojtczak et al. RSC Adv. 6, (2016) Zytek et al. BC 12, (2014) Rydzik et al. BMC 20, , (2012) Strenkowska et al. NAR, (2016) Biokoniugacja, dostarczanie nukleotydów do komórek i organizmów Kowalska et al. NAR, 42, (2014) Ziemniak et al RNA 22, (2016) Nowakowska et al. BC 12, (2014) Jemielity et al. BC, 10, (2012) 2 Patenty US i inne kraje Metody screeningowe inhibitorów pirofosfataz i fosfataz Baranowski et al. JC, 80, (2015) Kasprzyk et al. BC 14, (2016) Ziemniak et al. RSC Adv. 3, (2013) Zochowska et al. Nanomedicine: NBM, 11, (2015) Kijewska et al. Biomacromol. 14, (2013) Baranowski, Nowicka et al. BC 14, (2016). Baranowski et al zgł. Patentowe Mugridge et al. NSMB , (2016)

4 7-metylguanozyna mostek 5,5 -trifosforanowy transkrypt mrna Cechy charakterystyczne, niezwykłe dla kwasów nukleinowych, kluczowe dla specyficznego rozpoznania przez białka: Ujemnie naładowany mostek 5,5 -trifosforanowy : oddziaływania elektrostatyczne i wiąz. wodorowe Dodatnio naładowana zasada nukleinowa (7- metylguanina): kation-π staking

5 Jemielity J. et al. New J. Chem. 34, (2010)

6 Badania podstawowe Funkcjonalne badania nad procesami zależnymi od kapu Strukturalne badania nad białkami rozpoznającymi kap Zastosowania medyczne Stabilizacja mrna do zastosowań w terapii genowej Zastosowania syntetycznych analogów kapu Hamowanie aktywności kapzależnych białek w celach terapeutycznych trzymywanie kapowanego mrna & i ekspresja białek in vitro Sondy molekularne Biotechnologia Żywice do chromatogra fii powinowact wa Biokoniugaty do dostarczania leków Diagnostyka Ziemniak et al., Future Med. Chem. (2013) Jemielity J. et al. New J. Chem. 34, (2010)

7 DNA replikacja nośnika informacji genetycznej transkrypcja, eksport mrna przepis na białko GEN (cdna) translacja Białko Funkcje organizmu: składniki budulcowe, kataliza, transport, sygnalizacja i wiele innych GEN (mrna) GEN (cdna) nie ma niebezpieczeństwa mutacji, gdyż nie następuje integracja z genomem translacja mrna zachodzi w cytoplazmie błona komórkowa jest jedyną barierą do pokonania mniej immunogenne (w przeciwieństwie do DNA nie powoduje niespecyficznej aktywacji układu odpornościowego) efekt jest przejściowy znacznie mniejsza trwałość w warunkach komórkowych niż DNA otrzymywanie mrna transkrypcja in vitro

8

9

10 1. Komórki rakowe prezentują na swojej powierzchni specyficzne białka Komórka Komórka zdrowa rakowa 2. Takie specyficzne białko może być znakiem rozpoznawczym (antygenem) dla układu odpornościowego 3. Znając przepis na to białko (antygen), syntetyzuje się mrna kodujące go 4. mrna wstrzykuje się do węzłów chłonnych. Komórki dendrytyczne produkują atygen na bazie mrna i uczą limfocyty T go rozpoznawać. mrna 5. Wyszkolone limfocyty T rozpoznają i niszczą komórki rakowe

11 Wybór antygenu i synteza mrna ANTYGEN Transfekcja ex vivo Pobranie idc Wstrzyknięcie mrna Ekspresja mrna i dojrzewanie Przeszczep autologiczny dpowiedź swoista

12 koniec 5 Pozostała część cząsteczki mrna Kap Inicjacja biosyntezy białka zaczyna się od rozpoznania kapu przez eif4e Degradacja mrna rozpoczyna się od odłączenia kapu przez specyficzny enzym Dcp2/Dcp1 około 2000 nukleotydów koniec 3

13 Zwiększona odporność na Dcp1/2 = Zwiększony czas życia mrna in vivo Miejsce cięcia przez Dcp2 Dcp1/2 RNA Xrn1 RNA Dcp1/2 RNA Zwiększone powinowactwo do eif4e = Zwiększona szybkość inicjacji translacji, bardziej konkurencyjne terapeutyczne mrna niż endogenne RNA in vivo eif4e eif4e terapeutyczne terapeutyczne endogenne eif4e endogenne endogenne Rozwiązanie: analogi kapu modyfikowane w mostku trifosforanowym

14 P CH 2 P Tetrahedron Lett Bioorg. Med. Chem rg. Biomol. Chem RNA 2012 Bioorg. Med. Chem Zastosowania: J. Biol. Chem RNA 2007 Mol Cell 2008 Mol Cell 2009 RNA 2009 Gene Ther 2010 FEBS J 2010 RNA 2011 RNA 2012 RNA 2013 FEBS J 2013 Nanomedicine: NBM 2014 RNA 2016 NSMB 2016 Nucl. Acids Res J. rg. Chem Zgłoszenie patentowe 2014 Nucl. Acids Res RNA 2003 Biochemistry 2004 Tet. Lett Bioorg. Med. Chem RNA 2008 US Patent 2012 Przegląd modyfikacji mostka oligofosforanowego. New J. Chem Topics in Current Chemistry 2017 P Se Bioorg. Med. Chem ChemBioChem 2009 US Patent 2013 P BH 3 Nucl. Acids Res US Patent 2013

15 Jemielity J. et al. New J. Chem. 34, (2010)

16 Stepinski et al. RNA 7, (2001) Jemielity et al. RNA 9, (2003)

17 Warminski. et al. Topics in Current Chemistry DI: /s y (2017)

18 Joanna KWALSKA * β-s-arca RNA (D1 and D2) Poprawa właściwości biologicznych: Zwiększone powinowactwo do czynnika inicjującego translację, eif4e (2-4x) dporność na enzym Dcp2 odpowiedzialny za odcinanie kapu z końca 5 mrna Zwiększony czas półtrwania mrna in vivo (3x) Zwiększona efektywność translacji w komórkach (5x) = Wysoka wydajność biosyntezy białka in vivo Kowalska J., et al. RNA 14, (2008) Grudzień-Nogalska et al. RNA 13, (2007) Jemielity et al. US Patent 2012, Kowalska et al. US Patent 2013 i patenty w innych krajach

19 Centrum stereogeniczne * (R)-β-S-ARCA D1 D1 D2 m 7 GpppG K AS [µm -1 ] 43.1 ± ± ± 0.4 (S)-β-S-ARCA D2 Lys162 Lys162 Arg 157 Arg 157 Z czego wynika stabilizacja kompleksu eif4e β-s-arca? Współpraca: M Nowotny, IIMCB, Warszawa Warmiński, et al. w przygotowaniu

20 b-s-arca (D1) LUC mrna kodujące lucyferazę wstrzyknięcie do węzła chłonnego 9 myszy Kuhn A., et al. Gene Therapy 17, (2010).

21 SIINFEKL ARCA b-s-arca (D1) krew SIINFEKL-specyficzne komórki T CD8+ śledziona krew śledziona Immunizacja: dzień 0 i 3 wyznaczanie liczby limfocytów T: dzień 8 ARCA b-s-arca (D1) ARCA b-s-arca (D1) 5 myszy Kuhn A., et al. Gene Therapy 17, (2010). Efekt w niedojrzałych komórkach dendrytycznych: 3-krotny wzrost specyficznej aktywacji limfocytów T u myszy po dowęzłowym wstrzyknięciu mrna kodującego antygen (β-s-arca D1 vs ARCA)

22 HH N H 2 N N N N + P P S P N N N NH NH 2 CH 3 H H Zmiana 1 z 80 tysięcy atomów w mrna zbliża nas do terapii genowej opartej na mrna

23 : Cztery badania kliniczne nad szczepionką przeciw czerniakowi złośliwemu i rakowi piersi, szczepionki przeciw innym nowotworom w trakcie przygotowań (BioNTech, Mainz, Germany) XI 2015: Porozumienie o współpracy BioNTech SANFI (sublicencja β-s-arca). 60 M$ 300M$ IX 2016: Porozumienie o współpracy BioNTech Genentech/Roche (sublicencja β-s-arca). 310M$ XII 2017: Genentech/Roche we współpracy z BioNTech rozpoczynają badania kliniczne nad spersonalizowanymi szczepionkami przeciwnowotworowymi

24 PCV Personalized Cancer Vaccine, antygen ustalany na podstawie badań genetycznych komórek zdrowych i nowotworowych danego pacjenta. 572 pacjentów w 38 ośrodkach w Stanach Zjednoczonych, Kanadzie oraz Europie: USA 18, Kanada 2, Belgia 3, Niemcy 5, Holandia 3, Hiszpania 2, Wielka Brytania 3, Szwecja - 2 Melanoma (czerniak złośliwy) Non-Small Cell Lung Cancer (niedrobnokomórkowy rak płuc) Bladder Cancer (rak pęcherza moczowego) Colorectal Cancer (rak jelita grubego) Triple Negative Breast Cancer (potrójnie ujemny rak piersi) Renal Cancer (rak nerki) Head and Neck Cancer (nowotwory głowy i szyi) ther Solid Cancers (inne nowotwory lite)

25 Dostarczanie antygenów Suplementacja białek i peptydów Dostarczanie nukleaz Choroby nowotworowe: immunoterapie oparte na komórkach dendrytycznych Szczepionki przeciw chorobom zakaźnym Choroby genetyczne, zaburzenia metaboliczne Medycyna regeneracyjna -dostarczanie czynników wzrostu (m.in. w chorobach sercowo naczyniowych) -generowanie i modyfikacje komórek macierzystych Edycja genów metodą CRISPR/Cas9

26 Messenger RNA Therapeutics can be developed and tested in just a few weeks, enabling an expedited process from concept to first-in-man studies on the order of less than one year. All messenger RNA Therapeutics are made using the same reagents in the same cell-free production process, enabling rapid, cost-effective GMP manufacturing. This is possible given the chemical similarities between all messenger RNAs, which vary only in their RNA sequence.

27 Czy coś można ulepszyć? Z w i ę k s z y ć ko n k u r e n c y j n o ś ć v s n a t u r a l n e m R N A b e z u t r a t y o d p o r n o ś c i n a e n z y m D c p 2 ( n o w e m o d y f i k a c j e o r a z p o z n a w a n i e s t r u k t u r k o m p l e k s ó w b i a ł k o - k a p ). J e s z c z e b a r d z i e j z w i ę k s z y ć t r w a ł o ś ć k a p u ( n o w e m o d y f i k a c j e o r a z p o z n a w a n i e s t r u k t u r ko m p l e k s ó w b i a ł ko - k a p ). Z w i ę k s z y ć t r w a ł o ś ć k o ń c a 3 m R N A W p ł y w a ć n a i m m u n o g e n n o ś ć m R N A P o p r a w i e n i e i u p r o s z c z e n i e p r o d u k c j i m R N A ( c h e m i c z n y c a p p i n g m R N A ) Z a h a m o w a ć o d c i n a n i e k a p u ( m a ł o c z ą s t e c z k o w e i n h i b i t o r y ) L e p i e j z r o z u m i e ć c o s i ę d z i e j e z m R N A w k o m ó r c e i p o z a n i ą ( m R N A z n a k o w a n e, f o t o z s z y w a l n e ) E f e k t y w n i e j d o s t a r c z a ć m R N A d o k o m ó r k i

28 Ditiofosforanowe analogi kapu biją rekordy, ale Malwina STRENKWSKA Analogi kapu z modyfikacją bis(tiofosforanową) Katarzyna WNĘK Powinowactwo do eif4e wydajność ekspresji mrna w niedojrzałych ludzkich komórkach dendrytycznych (hidcs). Joanna KWALSKA Współpraca: U. Sahin (Mainz, Niemcy) Strenkowska et al. Nucleic Acids Res. 44, (2016)