(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/GB02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/GB02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO03/22301 (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 38/24 ( ) A61P 15/08 ( ) (54) Zastosowanie hormonu luteinizującego (LH) (30) Pierwszeństwo: , EP, (73) Uprawniony z patentu: LABORATOIRES SERONO SA, COINSINS, CH (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 04/05 (72) Twórca(y) wynalazku: STEPHEN HILLIER, EDINBURGH, GB COLIN MICHAEL HOWLES, GENEVA, GB (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 04/10 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie hormonu luteinizującego (LH). Wynalazek niniejszy dotyczy dziedziny in vivo i in vitro technik rozmnażania wspomaganego rozrodu (ang. assisted reproduction technologies, ART), w szczególności kontrolowanej hiperstymulacji jajeczkowania (ang. controlled ovarian hyperstimulation, COH) przy użyciu gonadotropin. Każdego roku liczne bezpłodne pacjentki poddawane są postępowaniu polegającym na indukcji owulacji. Jeszcze dwadzieścia lat temu, indukowanie owulacji stosowano wyłącznie do leczenia bezpłodności na tle anowulacji (czynnościowej); jednakże, wprowadzenie techniki wspomaganego rozrodu (ART) rozszerzyło stosowanie tych sposobów postępowania na kobiety regularnie miesiączkujące, z zamierzeniem uzyskania mnogiej folikulogenezy. W przypadku technik wspomaganego rozrodu (ART), takich jak zapłodnienie in vitro (IVF) lub IVF w połączeniu z docytoplazmatycznym wstrzyknięciem plemników (IVF/ICSI) oraz przeniesienie zarodka (ET), od pacjentki pobiera się oocyty bezpośrednio przed owulacją. Oocyty poddaje się zapłodnieniu in vitro, po czym zarodki są oceniane i selekcjonowane do implantacji. Nie wszystkie oocyty ulegną zapłodnieniu i nie wszystkie zapłodnione oocyty rozwiną się w żywotny zarodek. Ponadto, może nie dojść do zagnieżdżenia zarodka. Z powodu wielu możliwości niepomyślnego wyniku i stosunkowo inwazyjnego charakteru pobierania oocytów, pożądane jest zmaksymalizowanie liczby pobranych oocytów. Z tego powodu, ART typowo przeprowadza się z zastosowaniem kontrolowanej hiperstymulacji jajeczkowania (COH) z zamiarem zwiększenia liczby oocytów 1. Typowe reżimy 2 przeprowadzania COH obejmują fazę regulacji supresyjnej, w której endogenny hormon luteinizujący (LH) zostaje stłumiony przez podawanie agonisty hormonu uwalniającego gonadotropinę (GnRH), z następującą po tym fazą stymulacyjną, w której dzięki codziennemu podawaniu hormonu folikulotropowego (FSH), zazwyczaj w dawce mieszczącej się w zakresie około IU/dzień, zostaje zaindukowane rozwinięcie się pęcherzykowania (folikulogeneza). Można także stosować inne cząsteczki o aktywności FSH. Alternatywnie, stymulacja zaczyna się od użycia FSH po spontanicznej lub wywołanej menstruacji, z następującym po tym podawaniem antagonisty GnRH (typowo zaczynając od mniej więcej szóstego dnia fazy stymulacyjnej). Gdy już uzyska się co najmniej 3 pęcherzyki > 16 mm (jeden 18 mm), podaje się pojedynczy bolus hcg ( IU) w celu naśladowania naturalnego nagłego wzrostu ilości LH i wywołania owulacji. Czas pozyskiwania oocytów wynosi godzin po wstrzyknięciu hcg. Uzasadnieniem użycia w tym kontekście analogów GnRH, na przykład, agonistów lub antagonistów, jest zapobieganie nagłemu, zachodzącemu w nieodpowiednim momencie, zwiększeniu ilości LH, które może spowodować przedwczesną owulację i luteinizację pęcherzyka 3. Zgodnie z tym stwierdzono, że reżimy polegające na długotrwałym działaniu agonisty GnRH (to znaczy takie, które rozpoczynają się w śródlutealnej fazie cyklu poprzedzającej wywołanie owulacji, albo wcześniej) związane są z łatwiejszym poddaniem się pacjentki schematowi postępowania, większą wydajnością jajeczek i ogólnie lepszymi wynikami klinicznymi 4. Stosunkowo nową praktyką kliniczną jest zastosowanie antagonistów i oczekuje się, że przyniesie ono podobne korzyści, z tą zaletą, że okres dawkowania jest krótszy. Rezultatem przedłużonego podawania agonistów GnRH lub antagonistów GnRH jest głębokie stłumienie endogennego LH w trakcie cyklu (w przypadku agonisty) lub opóźnienie w fazie stymulacyjnej (w przypadku antagonisty). Tego rodzaju sytuacja, aczkolwiek nie jest niezgodna z rozwojem jajeczka, nie naśladuje cyklu naturalnego. W cyklu naturalnym, poziom LH wykazuje stopniowy wzrost przez kilka dni przed dużym pikiem w śródcyklu. Wiele grup naukowców badało znaczenie LH podczas fazy stymulacyjnej COH i reżimów indukcji owulacji. Jak jest to wiadome i dobrze poznane w tej dziedzinie wiedzy, techniki lub metody indukowania owulacji (Ol) różnią się od metod COH, aczkolwiek i jedne i drugie mogą wykorzystywać podawanie FSH. Filicori i in. badali rolę niskich dawek hcg jako środka zastępczego wobec LH w folikulogenezie i wywoływaniu owulacji 5. hcg (50 IU hcg/dzień) podawano zaczynając synchronicznie z podawaniem FSH. Reżim ten kontynuowano co dzień, aż do wywołania owulacji przy użyciu bolusa hcg. Liczba pęcherzyków małych (< 10 mm), średnich (10-14 mm) oraz dużych (> 14 mm) była porównywalna między grupą otrzymującą hcg a grupą kontrolną otrzymująca sam FSH, jednakże i kumulatywna dawka FSH i czas trwania stymulacji FSH były w grupie potraktowanej hcg zmniejszone.

3 PL B1 3 W dokumencie patentowym WO 00/67778 (Applied Research Systems) zaproponowano użycie LH w trakcie fazy stymulacyjnej. W jednym z przeprowadzonych badań, pacjentki otrzymywały FSH i LH we wczesnej fazie stymulacyjnej, a następnie albo oba hormony, FSH i LH, albo tylko LH w trakcie późnej fazy stymulacyjnej. W innym badaniu, pacjentkom podawano sam FSH we wczesnej fazie stymulacyjnej, a następnie LH w późnej fazie stymulacyjnej. Wysunięto sugestię, że LH w późnej fazie stymulacyjnej odpowiedzialny jest za atrezję pęcherzyków niedominujących. Proponuje się wykorzystanie tego reżimu do stymulowania rozwoju pojedynczego pęcherzyka dominującego. European Recombinant Human LH Study Group doniosła o podawaniu rhlh (75 i 225 IU/dzień) w celu podtrzymania indukowanego rhfsh rozwoju pęcherzykowego u kobiet z hipogonadyzmem hipogonadotropowym, w celu stymulowania wydzielania estradiolu, wzmożenia wpływu FSH na wzrost pęcherzyków i umożliwienia luteinizacji pęcherzyków eksponowanych na hcg, w porównaniu z reżimem stosującym sam FSH 6. LH podawano zaczynając w tym samym dniu, w którym przeprowadzano stymulację FSF, i kontynuowano, aż do podania hcg w celu wywołania owulacji. Sullivan i in. donoszą, że LH późno w fazie stymulacyjnej przedłuża wytwarzanie pęcherzykowego estradiolu w przypadku odstawienia FSH 7. Sills i in. donoszą o badaniu, w którym pacjentki cierpiące na niepłodność rozmaitego typu potraktowano albo FSH, albo FHS i 75 IU rhlh podczas fazy stymulacyjnej. Autorzy wyciągają wniosek, że dodanie zewnątrzpochodnego LH podczas indukcji owulacji nie zmienia w sposób istotny wydajności cyklu 8. Ben-Amor i in. 9 oraz Werlin i in. 10 badali skutek podawania rhlh podczas drugiej połowy fazy pęcherzykowania u pacjentek normalnie jajeczkujących, z reżimem o długotrwałej regulacji supresyjnej, a Williams i in. 11 zbadali wpływ podania różnych dawek r-hlh w trakcie całej stymulacji FSH. Nie doniesiono o żadnych zasadniczych korzyściach klinicznych dla obu tych grup pacjentek. W reżimach COH stosujących FSH, niektóre pacjentki ("słabo odpowiadające"- w dalszym tekście określane jako słabi responderzy") nie odpowiadały na początkowe dawki FSH i cyklu leczenia należało zaniechać. Nowy cykl rozpoczynał się już od wyższej początkowej dawki FSH. Inne grupy pacjentek wymagały powtarzania cykli, ponieważ kobiety te nie zachodziły w ciążę nawet pomimo pomyślnego pozyskiwania oocytów. W przypadku potrzeby powtórzenia cykli, mogą wystąpić u pacjentki szkodliwe skutki fizyczne i psychiczne. Każdy powtarzany cykl pociąga za sobą potężny rozłam w pożyciu bezpotomnej pary. Toteż, pożądane byłoby dysponowanie sposobem umożliwiającym taką samą lub polepszoną, polegającą na pęcherzykowaniu odpowiedź na COH przy użyciu zmniejszonych dawek FSH lub skróconych okresów dawkowania. Pożądane byłoby dysponowanie testem diagnostycznym umożliwiającym ustalenie, które pacjentki mogą być słabymi lub suboptymalnymi responderami i które mogą odpowiadać na zmniejszoną dawkę FSH. Celem wynalazku jest umożliwienie przeprowadzania COH według polepszonego reżimu, w którym zachodzi indukcja wielu pęcherzyków przeznaczonych do uzyskiwania wielu oocytów dla ART. Celem wynalazku jest również umożliwienie ustalania, która pacjentka może wykazywać silną, słabą lub suboptymalną odpowiedź na FSH w COH. Wynalazek dotyczy zastosowania hormonu luteinizującego (LH) do wytwarzania leku do indukowania mnogiej folikulogenezy u człowieka, który to lek jest przeznaczony do podawania w okresie primingu zaczynającym się od 1 dnia fazy stymulacyjnej w kontrolowanej hiperstymulacji jajników (COH) i nie przekraczającym 4 dnia fazy stymulacyjnej w COH. Korzystnie, okres primingu trwa od dnia 1 do dnia 4, korzystnie od dnia 1 do dnia 3, a najkorzystniej od dnia 1 do dnia 2 fazy stymulacyjnej. Stosować można pojedyncze dawki dzienne leku. Korzystnie, lek można podawać jako dawkę pojedynczą w dniu 1 fazy stymulacyjnej. Korzystnie lek jest przeznaczony do podawania bez podawania egzogennego FSH w okresie primingu. Korzystnie lek jest przeznaczony do podawania w dawkach wynoszących 20 do 400 Ul LH/dzień, 100 do 200 IU LH/dzień lub 150 IU LH/dzień. Korzystnie LH stanowi rhlh. Lek wytwarzany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku do indukowania mnogiej folikulogenezy, a tym samym polepszenia reżimu COH u człowieka w sensie, na przykład, zwiększenia liczby pozyskiwanych zarodków, które wykazują wczesne bruzdkowanie, a przez to mają większą szansę zagnieżdżenia się i ciąży, zwiększenia liczby pęcherzyków o wielkości ponad 15 mm w dniu wywołania owulacji, wyższego stosunku ilości dużych pęcherzyków do małych pęcherzyków w dniu wywołania owulacji i większej liczby oocytów w porównaniu z pacjentką lub grupami pacjentek poddawanych typowemu reżimowi COH.

4 4 PL B1 Nieoczekiwanie stwierdzono, że stosowanie porównawczo krótkotrwałego reżimu ze stosowaniem LH, rozpoczynając go od początku fazy stymulacyjnej, z następującym potem podawaniem FSH w prowadzonej COH, daje efekt wzmożenia mnogiej fulikulogenezy i ogólnego polepszenia reżimu COH w sensie, na przykład, zwiększenia liczby pozyskiwanych zarodków wykazujących wczesne bruzdkowanie, a przez to mających większą szansę zagnieżdżenia się i pomyślnego rozwoju podczas ciąży, zwiększenie liczby pęcherzyków o ponad 15 mm w dniu wywołania owulacji, wyższy stosunek ilościowy dużych pęcherzyków do małych pęcherzyków w dniu wywołania owulacji oraz większą liczbę oocytów. Ponadto, możliwe staje się zmniejszenie dawki FSH potrzebnej do uzyskania u danej pacjentki rozwinięcia mnogiego pęcherzykowania. Technice takiej nadano nazwę LH priming" [w niniejszym opisie określana jest ona jako priming" (przy użyciu LH]. Okres podawania LH nazwano okresem primingu". Dla celów niniejszego opisu, początek okresu primingu oznacza początek fazy stymulacyjnej. Sądzi się, że LH oddziałuje z receptorami komórek osłonki rozwijającego się pęcherzyka Graafa, stymulując wytwarzanie androgenów. Synteza estrogenów wymaga dostępności androgenów jako substratów aromatazy. Sądzi się, że podwyższenie miejscowego stężenia androgenów indukowane przez LH wzmaga oddziaływanie FSH na rozwijający się pęcherzyk. W przypadku użycia lub zastosowania LH w aspektach opisywanego tu wynalazku, dawkowanie może mieścić się w zakresie od 20, lub około 20, do 400, lub około 400, IU, korzystnie w zakresie od 50, lub około 50, do 300, lub około 300, IU, albo w zakresie od 75, lub około 75, do 225, lub około 225, IU, korzystniej w zakresie od 100, lub około 100, do 200, lub około 200, IU, albo w zakresie od 75, lub około 75 IU do 150, lub około 150, IU LH, najkorzystniej może wynosić 150, lub około 150, IU LH. Alternatywne dawkowanie może mieścić się w zakresie od 150, lub około 150, IU, do 300, lub około 300, IU LH, korzystnie może wynosić 225, lub około 225 IU LH. Korzystnie, wszystkie te dawki są dawkami dziennymi. W przypadku użycia analogów LH, można obliczyć i zastosować dawki równoważne wspomnianym dawkom LH. Gdy FSH jest używany lub stosowany w aspekcie opisywanego tu wynalazku, dawkowanie może mieścić się w zakresie od 50, lub około 50, do 300, lub około 300, IU, korzystnie w zakresie od 100, lub około 100, do 250, lub około 250, IU, najkorzystniej może wynosić 150, lub około 150, IU LH. Alternatywne dawki FSH mogą mieścić się w zakresie od 75 do 600, lub około 75 do 600 IU, w zakresie od 75 do 450, lub około 75 do 450, korzystnie w zakresie od 150 do 375, lub w zakresie od około 150 do 375 IU i korzystniej mogą wynosić 300, lub około 300 IU. Korzystnie, dawki te są dawkami dziennymi. W przypadku użycia analogów FSH, można obliczyć i zastosować dawki równoważne wspomnianym dawkom LH. Zgodnie z korzystnym protokołem, agonistę GnRH podaje się pacjentce w dawce wystarczającej do uzyskania stłumienia czynności jajników. Odpowiednie sposoby osiągania takiego stłumienia aktywności są dobrze znane i udokumentowane w tej dziedzinie wiedzy i można tu użyć jakiejkolwiek z tych metod, na przykład pojedynczego wstrzyknięcia 3,75 mg tryptoreliny depot, albo też dziennych dawek buzereliny lub octanu leuproreliny. Stłumienia czynności jajników można monitorować przez śledzenie i kontrolowanie poziomu LH lub estradiolu (na ogół, wartości: LH < 5 IU/litr, E 2 < 50 pg/ml wskazują na stan spoczynkowy). Fazę stymulacyjną można rozpocząć od codziennych wstrzyknięć LH (na przykład w dawkach wyżej opisanych, na przykład mieszczących się w zakresie około IU, korzystnie wynoszących 150 IU lub 225 IU). Po upływie około 3 do 4 dni, na przykład po upływie 2,5 dnia, 3 dni, 3,5 dnia, 4 dni lub 4,5 dnia, zaprzestaje się podawania LH i rozpoczyna podawanie FSH (na przykład w dawkach wyżej opisanych, zazwyczaj mieszczących się w zakresie około IU/dzień). Podawanie FSH kontynuuje się, na ogół, do momentu, gdy obrazowanie ultradźwiękowe potwierdzi obecność co najmniej 3 pęcherzyków > 16 mm (jeden 17 mm lub 18 mm lub większy). Owulację wywołuje się podaniem bolusa hcg ( IU). Zgodnie z alternatywnym korzystnym protokołem, podawania FSH i LH mogą nakładać się na siebie przez jeden dzień, co oznacza, że FSH można zastosować w ostatnim dniu podawania LH. Wystarczające może okazać się pojedyncze podanie LH lub jego analogu, a stosowanie FSH można rozpocząć równocześnie lub, korzystnie, następnego dnia. Gdy podaje się pojedyncza dawkę LH, powinna ona, korzystnie, mieścić się w zakresie około IU LH. Alternatywnie, LH można podawać w ciągu, ogółem, 4 dni, na przykład LH (lub jego analog) można podawać od dnia 1 do dnia 4, lub około 4, albo od dnia 1 do dnia 3, lub około 3, albo od dnia 1 do dnia 2, lub około 2. W takich przypadkach, LH, korzystnie, stosuje się w trybie dziennym lub półdziennym, na przykład, w dawkach wyżej opisanych. Podawanie FSH można rozpocząć równocześnie z podawaniem LH, albo stosowanie ich może nakładać się na siebie w ciągu trzech dni, dwóch dni lub jednego dnia, ale korzystnie rozpo-

5 PL B1 5 czyna się ono po zaprzestaniu podawania LH, lub przy jednym dniu nakładania się tych zabiegów na siebie. Innymi słowy, korzystnie LH stosuje się przy niepodawaniu egzogennego FSH w okresie primingu. Korzystne pod tym względem dawki FSH i LH są opisane powyżej. Dawki dzienne nie muszą być równe. I tak, na przykład, w korzystnym reżimie można podawać: w dniu 1 dawkę mieszącą się w zakresie od 150 do 300 IU LH, korzystnie wynoszącą 225 IU LH, w dniu 2 dawkę mieszczącą się w zakresie od 75 do 225 IU LH, korzystnie wynoszącą 150 IU LH i w dniach 3 i 4 dawki mieszczące się w zakresie od 75 do 225 IU LH, korzystnie w zakresie od 75 do 150 IU LH. Alternatywnie, dawki dzienne mogą być równe i w przypadku alternatywnego korzystnego reżimu można stosować dawki dzienne wynoszące 225 IU LH. Korzystne drogi podawania gonadotropin są dobrze znane i udokumentowane w tej dziedzinie wiedzy i są to wstrzykiwania podskórne, domięśniowe lub dożylne. Analogi można podawać we wstrzyknięciach podskórnych, domięśniowych lub dożylnych, albo doustnie, przezskórnie, doodbytniczo lub donosowo, tak, jak jest to stosowne dla konkretnego analogu. Reżim primingu przy użyciu LH można stosować także w połączeniu z leczeniem przy użyciu agonisty GnRH, a nie agonisty GnRH. Faza stymulacyjna rozpoczyna się wraz z podaniem LH (jak to powyżej opisano) w późnej fazie lutealnej poprzedniego cyklu (korzystnie są to dni 23-26, albo około trzech dni przed spodziewanym rozpoczęciem się miesiączki). Następnie podaje się FSH, jak powyżej, zaczynając od dnia 1-3 menstruacji (bez poprzedzającego podania antagonisty GnRH). Następnie, około 6 dnia stymulacji przy użyciu FSH, podaje się agonistę GnRH, takiego jak, na przykład, antide, azalina B, cetroreliks, ganireliks lub antareliks. Owulację wyzwala się zaaplikowaniem bolusa hcg. Zazwyczaj, antagonistę podaje się aż do dnia podania hcg. Korzystnie, podawania LH i FSH zasadniczo nie nakładają się na siebie, na przykład, korzystnie nakładają się one na siebie nie dłużej niż przez trzy dni, korzystniej przez nie dłużej niż przez dwa dni, a najkorzystniej nie dłużej niż przez jeden dzień. Korzystniej, podawanie FSH rozpoczyna się po zaprzestaniu podawania LH, co oznacza, że zabiegi te nie nakładają się na siebie. W celu lepszego przewidywania rozpoczęcia się miesiączki, może okazać się pożądane podawanie pacjentce pigułki antykoncepcyjnej w ciągu mniej więcej jednego miesiąca przed rozpoczęciem reżimu primingu przy użyciu LH. Zazwyczaj, po około 2 lub 3 dniach od odstawienia środka antykoncepcyjnego następuje miesiączka. W przypadku użycia pigułki antykoncepcyjnej, priming przy użyciu LH można rozpoczynać w dniu wycofania pigułki. Podczas fazy stymulacyjnej do monitorowania rozwoju pęcherzyków można wykorzystać obrazowanie ultradźwiękowe. Użycie LH we wczesnej fazie stymulacyjnej reżimu COH może pozwolić na zmniejszenie ogólnej zastosowanej dawki FSH w porównaniu z reżimem COH bez udziału LH. I tak, na przykład, zwykła dawka FSH stosowana z pominięciem poprzedniego podania LH, mieści się w zakresie od 100 do 250 IU/dzień i zazwyczaj wynosi około 150 IU/dzień. W przypadku primingu przy użyciu LH, jeżeli odpowiedź polegająca na pęcherzykowaniu uznana została za wystarczającą, dawkę FSH można zmniejszyć do, na przykład, poziomu poniżej 150 IU/dzień, albo poniżej 100 IU/dzień i może to być dawka mieszcząca się, na przykład, w zakresie od 50 do 140 IU/dzień lub w zakresie od 50 do 90 IU/dzień. Alternatywnie, można stosować te same lub mniejsze dawki dzienne i owulację wywołać wcześniej niż w przypadku pominięcia LH, co oznacza, że skumulowana dawka FSH jest mniejsza. Kontrolowaną hiperstymulację jajeczkowania można też prowadzić stosując związki o aktywności LH, to znaczy analogi LH wywierające takie samo działanie fizjologiczne, biochemiczne lub biologiczne, jak LH. I tak, na przykład, jest rzeczą dobrze znaną, że jako środek zastępczy dla LH może służyć gonadotropina kosmówkowa (CG). Jako ogólną zasadę przyjmuje się, że 1 IU hcg jest równoważna 5-7 IU LH (biopróba w farmakopoei Van Hell 12 ) i że wobec tego specjalista w tej dziedzinie wiedzy może obliczyć równoważne dawki hcg. Ujawnione są już inne przykładowe analogi LH, takie jak, na przykład, opisane w patencie europejskim nr EP (Applied Research Systems), w publikacjach WO 99/25849, WO 90/06844, WO 93/06844 i WO 96/05224 (wszystkie: Washington University) oraz WO 00/61586 (Akzo Nobel). W opisanej powyżej procedurze stosowano FSH jako główny czynnik folikulotropowy. Specjalista w tej dziedzinie wiedzy rozumie jednak, że FSH można zastąpić biologicznie aktywnym analogiem albo związkiem stymulującym endogenne wydzielanie FSH. Do tej ostatniej grupy substancji należą inhibitory aromatazy oraz antyestrogeny, takie jak tamoksyfen i cytrynian klomifenu (CC). Związki te stymulują wydzielanie endogennego FSH przez eliminowanie sprzężenia zwrotnego ujemnego wywieranego przez estrogeny na podwzgórze (albo przez antagonizowanie receptorów estrogenowych, jak

6 6 PL B1 w przypadku CC i tamoksyfenu, albo przez daleko posunięte obniżanie stężenia estrogenów, jak w przypadku inhibitorów aromatazy). FSH można także zastosować w połączeniu z tymi środkami w trakcie fazy stymulacyjnej. Szczególnie korzystna postać FSH, która może być stosowana z lekiem opartym na LH wytworzonym zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, jest znana jako FSH-CTP. Taki ludzki FSH o długotrwałym działaniu opisany jest w publikacji WO 93/ Ma on podjednostkę a FSH typu dzikiego oraz podjednostkę β, która składa się z podjednostki β FSH typu dzikiego sprzężonej na swym C-końcu z C-końcowym peptydem (CTP) podjednostki β hcg (reszty do pozycji 145 natywnej sekwencji hcgβ). Do innych typów analogów FSH należą, na przykład, analogi jednołańcuchowego FSH, w których podjednostka β sprzężona jest z CTP lub hcg, która z kolei sprzężona jest z podjednostka α FSH, jak to opisano w publikacji WO 96/05224 ujednołańcuchowy FSH-CTP). FSH można także stosować w połączeniu z tymi środkami podczas fazy stymulacyjnej. Podawanie LH rozpoczyna się dnia 1 fazy stymulacyjnej i nie kontynuuje się go poza dzień 4. Jeśli ocenia się, że pacjentka jest dobrym responderem, mogą okazać się wystarczające dawki dzienne LH mieszczące się w zakresie około w dniach 1 i 2. Jeśli pacjentkę oceniono jako respondera słabego lub suboptymalnego, podawanie dawek dziennych mieszczących się w zakresie około IU LH można kontynuować i zatrzymać w którymkolwiek z dni następnych, a więc w dniu 3 lub 4. Ocenę, czy pacjentka jest responderem dobrym, suboptymalnym czy słabym można oprzeć na wynikach poprzednich cykli ART lub na wynikach testu diagnostycznego, jak to poniżej opisano. Jak już o tym poprzednio wspomniano, hcg wywiera wiele tych samych działań biologicznych jak LH. Ponieważ hcg ma znacznie dłuższy okres półtrwania niż LH, więc w przypadku użycia hcg zamiast LH, może okazać się wystarczające pojedyncze podanie hcg (około IU hch) w dniu 1. Lek wytworzony zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może też być stosowany w sposobie określania odpowiedzi pacjentki na FSH w COH. Umożliwia on dopasowanie reżimu COH do konkretnej pacjentki, pozwalając na uniknięcie stosowania nadmiernych dawek FSH u dobrych responderów i na zwiększenie szans powodzenia dla responderów suboptymalnych i słabych. W sposobie tym, stosuje się podawania pojedyncze, na przykład we wstrzyknięciu LH (na przykład w dawkach powyżej opisanych, na przykład mieszczących się w zakresie około 50 do 300 IU, korzystnie w zakresie od 100 do 200 IU, korzystniej wynoszących około 150 IU) na początku fazy stymulacyjnej reżimu COH, jako prowokację", w celu stymulowania syntezy androgenu w komórkach osłonki pęcherzyka Graafa. Wstrzyknięcia LH dokonuje się w dniu 1 fazy stymulacyjnej. Następnie mierzy się poziom androgenu w surowicy, co najmniej jeden raz, co najmniej po 6 lub po około 6 godzinach od podania LH, korzystnie co najmniej po 12, lub po około 12 godzinach od podania LH. Przed upływem godziny 6 odpowiedź na prowokację przy użyciu LH nie będzie znacząca. Korzystniej, poziom androgenu mierzy się w okresie, na przykład jak następuje: w godzinach 0, 1,6, 12 i 24 od wstrzyknięcia LH. W wyniku tego otrzymuje się obraz wzrostu stężenia androgenu w odpowiedzi na wstrzyknięcie LH. Poziomy androgenu po prowokacji przy użyciu LH porównuje się z poziomami sprzed prowokacji. I tak, na przykład, gdy poziom androgenu przed wstrzyknięciem LH określi się jako A 1, a poziom androgenu po prowokacji określi się jako A 2, wtedy można obliczyć różnicę między tymi dwiema wartościami (ΔA) według równania: ΔA = A 2 - A 1 Wartość ΔA jest parametrem ogólnym, przedstawiającym zmianę poziomu androgenu w surowicy. Nie jest on ograniczony wyłącznie do prostej różnicy obliczonej z tych dwu wartości, ale może stanowić wartość złożoną, wywodzącą się z szeregu punktów pomiarowych. W przypadku przeprowadzania pojedynczego pomiaru poziomu androgenu, nie należy dokonywać go przed upływem około 6 godzin, ponieważ w innym przypadku organizm nie zdąży jeszcze odpowiedzieć na prowokację przy użyciu LH zmianą poziomu androgenu. W przypadku przeprowadzania pojedynczego pomiaru, korzystnie dokonuje się go po upływie 12 godzin, korzystniej po upływie 18, lub około 18 godzin, albo po upływie 24, lub około 24 godzin. Korzystnie, sposób z zastosowaniem prowokacji przy użyciu LH wykorzystuje się u pacjentek poddawanych przysadkowemu reżimowi z regulacją supresyjną, z podaniem agonisty GnRH na co najmniej około 3 dni, korzystnie około 7 dni przed podaniem LH. Pacjentki wykazujące dobrą odpowiedź jeśli chodzi o poziom androgenu, mogą kontynuować COH z udziałem samego tylko FSH. Pacjentkom wykazującym odpowiedź słabą lub suboptymalną można wstrzykiwać LH (na przykład w opisanych powyżej dawkach, takich jak, na przykład, dawki

7 PL B1 7 mieszczące się w zakresie od 50 do 300 IU, korzystnie w zakresie od 75 do 225 IU, korzystniej wynoszące około 150 IU/dzień) jeszcze w ciągu dalszych 3, lub około 3 dni. Na przykład, pacjentka będzie otrzymywać wstrzyknięcia jeszcze przez 1, 2 lub 3 dni, na przykład, aż do stwierdzenia dobrej odpowiedzi pod względem poziomu androgenu. Następnie podaje się codziennie FSH, w dawkach mieszczących się w zakresie około lub IU/dzień, korzystnie około IU/dzień, korzystniej wynoszących około 300 IU/dzień. Korzystnie, androgenami, które się monitoruje, są androstenodion i testosteron, korzystniej androstenodion. Oprócz tego, można mierzyć także poziom prekursorów, takich jak, na przykład, 17α-hydroksyprogesteron (17αOHP). Dobrymi responderami są te pacjentki, które wykazują wzrost stężenia androstenodionu (ΔA) po upływie 24 godzin wynoszący 2, lub około 2 nmol/litr lub większy. Pacjentki będące słabymi lub suboptymalnymi responderami wykazują wzrost stężenia androstenodionu poniżej 2, lub około 2 nmol/litr. Gdy dokonuje się pomiaru stężenia testosteronu, dobry responder będzie wykazywać wzrost poziomu testosteronu w surowicy po upływie 24 godzin mieszczący się w zakresie 0,25 do 0,75, lub w zakresie około 0,25 do 0,75 nmol/litr, podczas gdy pacjentki będące słabymi lub suboptymalnymi responderami wykazują wzrost poniżej 0,25 nmol/litr. Pacjentki, które wykazują dobrą, słabą lub suboptymalną odpowiedź pod względem poziomu androgenu, to pacjentki, które z kolei określa się jako prawdopodobnie, odpowiednio, dobrych, słabych lub suboptymalnych responderów jeśli chodzi o odpowiedź na FSH w COH. I tak, na przykład, pacjentka wykazująca dobrą odpowiedź pod względem poziomu androgenu to prawdopodobnie pacjentka, co do której można oczekiwać, że wykaże dobrą odpowiedź na FSH w COH opisanych w niniejszym opisie. W celu wzmożenia czułości sposobu, poziom tła androgenu można w zasadzie wyeliminować przez podanie pacjentce inhibitora nadnerczowego wydzielania androgenów, takiego jak, na przykład, deksametazon, jeszcze przed prowokacją przy użyciu LH. W odmianie powyższej prowokacji przy użyciu LH, monitoruje się raczej poziom estrogenu w surowicy a nie poziom androgenu. LH stymuluje wytwarzanie androgenów przez komórki osłonki pęcherzyka jajnikowego, po czym androgeny ulegają przekształceniu w estrogeny działaniem aromatazy. Ponieważ przekształcenie androgenów w estrogeny aktywowane jest przez FSH, w innej odmianie metody prowokowania z zastosowaniem LH, po prowokacji przy użyciu LH następuje wstrzyknięcie FSH, po czym można zmierzyć poziom estrogenu. I znów, stosuje się pojedyncze wstrzyknięcie LH (na przykład w dawkach powyżej opisanych, na przykład mieszczących się w zakresie około IU, korzystnie w zakresie od 75 do 225 IU, korzystniej wynoszących około 150 IU) w dniu 1 fazy stymulacyjnej reżimu COH, jako prowokację", w celu stymulowania syntezy androgenu w komórkach osłonki pęcherzyka Graafa. Po wstrzyknięciu LH, podaje się, we wstrzyknięciu, FSH (w dawce mieszczącej się w zakresie około IU, korzystnie wynoszącej około 150 IU). Wstrzyknięcia FSH dokonuje się nie wcześniej niż po upływie 6, lub około 6, godzin, korzystnie po upływie 12, lub około 12, godzin, korzystniej po upływie 24, lub około 24, godzin od prowokacji przy użyciu LH. FSH stymuluje wytwarzania aromatazy, w wyniku czego ilość androgenu zwiększona stymulowaniem komórek osłonki pęcherzyka Graafa przez LH, zostaje przekształcona przez aromatazę w estrogeny. Następnie mierzy się poziom estrogenu w surowicy, co najmniej jeden raz, korzystnie nie wcześniej niż po upływie 12, lub około 12, godzin od podania FSH. 12-godzinny odstęp czasu umożliwia zajście aktywacji aromatazy w odpowiedzi na FSH. Korzystniej, poziom estrogenu mierzy się w okresie, na przykład jak następuje: w godzinach 0, 6, 12 i 24 od wstrzyknięcia FSH. Poziomy estrogenu po prowokacji LH porównuje się z poziomami sprzed prowokacji. I tak, na przykład, gdy poziom estrogenu przed wstrzyknięciem LH określi się jako E 1, a poziom estrogenu po prowokacji określi się jako E 2, wtedy można obliczyć różnicę między tymi dwiema wartościami (ΔE) według równania: ΔE = E 2 - E 1 Wartość ΔE jest parametrem ogólnym, przedstawiającym zmianę poziomu estrogenu w surowicy. Nie jest on ograniczony wyłącznie do prostej różnicy obliczonej z tych dwu wartości, ale może stanowić wartość złożoną, wywodzącą się z szeregu punktów pomiarowych. W przypadku przeprowadzania pojedynczego pomiaru poziomu estrogenu, nie należy dokonywać go przed upływem około 12 godzin od prowokującego wstrzyknięcia FSH, ponieważ w innym przypadku organizm nie zdąży jeszcze odpowiedzieć na prowokację LH/FSH zmianą poziomu estro-

8 8 PL B1 genu. W przypadku przeprowadzania pojedynczego pomiaru, korzystnie dokonuje się go po upływie 18 godzin, korzystniej po upływie 24, lub około 24 godzin. Korzystnie, sposób z prowokacją przy użyciu LH + FSH wykorzystuje się u pacjentek poddawanych przysadkowemu reżimowi z regulacją supresyjną, z podaniem agonisty GnRH na co najmniej około 3 dni, korzystnie około 7 dni przed użyciem LH. Pacjentki wykazujące dobrą odpowiedź jeśli chodzi o poziom estrogenu mogą kontynuować COH z udziałem samego tylko FSH (około 100 do 225 IU FSH/dzień, korzystnie około 150 IU FSF/dzień). U pacjentek wykazujących odpowiedź słabą lub suboptymalną można kontynuować wstrzykiwanie LH (na przykład w opisanych powyżej dawkach, takich jak, na przykład, dawki mieszczące się w zakresie od 50 do 300 IU, korzystnie w zakresie od 75 do 225 IU, korzystniej wynoszących około 150 IU/dzień) jeszcze w ciągu dalszych 3, lub około 3, dni. Na przykład, pacjentka będzie otrzymywać wstrzyknięcia jeszcze przez 1, 2 lub 3 dni, na przykład, aż do zaobserwowania dobrej odpowiedzi pod względem poziomu estrogenu. Następnie, rozpoczyna się podawanie FSH (na przykład w opisanych powyżej dawkach mieszczących się w zakresie około 75 do 450 IU FSH/dzień korzystnie w zakresie około 150 do 375 IU/dzień, korzystniej wynoszących 300 IU/dzień). Korzystnie, estrogenem, który się monitoruje, jest estradiol (E 2 ). Dobrymi responderami są te pacjentki, które wykazują wzrost stężenia estradiolu w surowicy po upływie 24 godzin wynoszący 50, lub około 50 pmol/litr lub większy. Pacjentki będące responderami słabymi lub suboptymalnymi wykazują odpowiedź na poziomie niższym od podanego. Pacjentki, które wykazują dobrą, słabą lub suboptymalną odpowiedź pod względem poziomu estrogenu, to pacjentki, które z kolei określa się jako prawdopodobnie, odpowiednio, dobrych, słabych lub suboptymalnych responderów jeśli chodzi o odpowiedź na FSH w COH. I tak, na przykład, pacjentka wykazująca dobrą odpowiedź pod względem poziomu estrogenu to prawdopodobnie pacjentka, co do której można oczekiwać, że wykaże dobrą odpowiedź na FSH w COH w sposobach opisanych w niniejszym opisie. W celu wzmożenia czułości sposobu, poziom tła androgenu można w zasadzie wyeliminować przez podanie pacjentce inhibitora nadnerczowego wydzielania androgenów, takiego jak, na przykład, deksametazon, jeszcze przed prowokacją przy użyciu LH. W trakcie przebiegu fazy stymulacyjnej można powtarzać którąkolwiek z powyższych prowokacji. Korzystnie, w którejkolwiek z powyższych prowokacji, monitoruje się zarówno androgeny jak i estrogeny. Sposoby monitorowania androgenów i estrogenów są dobrze znane i udokumentowane w tej dziedzinie techniki i zastosować można jakikolwiek z tych sposobów. Poziom testosteronu można mierzyć stosując, na przykład, radioimunologiczną technikę badania stałej fazy ( solid-phase coated-tube radioimmunoassay", Coat-A-Count, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, USA). Poziom androstenodionu można mierzyć, stosując, na przykład, technikę radioimmunologiczną (Diagnostic Laboratories Inc., Webster, USA). 17-β-estradiol można mierzyć, na przykład, stosując, na przykład, technikę radioimmunologiczną (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, USA). Korzystnie, gonadotropinami powinny być gonadotropiny ludzkie, przy czym pochodzić one mogą z jakiegokolwiek źródła, z tym, że nie będą one zanieczyszczone jakimikolwiek substancjami (zwłaszcza innymi gonadotropinami), które mogłyby szkodliwie wpływać na ich aktywność. Można stosować gonadotropiny z moczu, aczkolwiek korzystnie używa się rekombinantowych FSH i LH (rhfsh i rhlh), a to z uwagi na ich wysoką czystość. Zwłaszcza korzystne jest stosowanie rhlh. Farmakokinetyka (PK) rhlh jest bardzo podobna do farmakokinetyki przysadkowej LH. Po szybkiej fazie rozmieszczenia z początkową wartością t 1/2 wynoszącą 1 h, rhlh jest eliminowany z końcową wartością t 1/2 około 10 h. Całkowity klirens organizmu wynosi 2 litry/godzinę, przy czym mniej niż 5 % dawki jest wydzielane przez nerki. Objętość w stanie równowagi dynamicznej wynosi 8 litrów. Taka charakterystyka PK kontrastuje z charakterystyką PK pochodzącej z moczu hcg. Końcowa wartość t 1/2 tej ostatniej przekracza 30 godzin. Przewiduje się, że hcg utrzymuje się w krążeniu od 2 do 3 razy dłużej niż LH. Zgodnie z zastosowaniem można wytwarzać lek w postaci kompozycji farmaceutycznej zawierającej LH oraz farmaceutycznie dozwolony rozcieńczalnik, nośnik lub zaróbkę. Specjalista w tej dziedzinie techniki zdaje sobie sprawę z tego, że istnieje wielka rozmaitość takich rozcieńczalników lub zaróbek nadających się do sformułowania kompozycji farmaceutycznej. Korzystnie, wspomniane kompozycje farmaceutyczne zawierają dzienną dawkę LH (na przykład dawkę mieszcząca się w zakresie od 20 do 400 IU, korzystnie w zakresie od 50 do 300 IU, korzystniej w zakresie od 75 do 225 IU lub w zakresie 100 do 200 IU, a najkorzystniej wynoszącą 150 IU LH), przy stosowaniu od dnia 1 do

9 PL B1 9 mniej więcej dnia 4, korzystnie od dnia 1 do dnia 4, korzystniej od dnia 1 do dnia 3, najkorzystniej od dnia 1 do dnia 2, lub tylko w dniu 1 fazy stymulacyjnej w COH. Inne właściwe dawki LH podane są w tekście niniejszego opisu. Typowo, LH formułuje się jako dawkę jednostkową w postaci ciała stałego, gotowego do rozpuszczenia z utworzeniem jałowego roztworu do wstrzykiwań domięśniowych lub podskórnych. Zazwyczaj, ciałem stałym jest w tym przypadku liofilizat. Do typowych zaróbek lub nośników należy sacharoza, laktoza, chlorek sodu, środki buforujące, takie jak diwodorofosforan sodu i wodorofosforan(v) sodu. Roztwór można sporządzić przez rozpuszczenie w wodzie do wstrzykiwań, bezpośrednio przed użyciem. LH można sformułować jako roztwór do wstrzykiwań, zawierający dowolne zaróbki i bufory wyszczególnione powyżej oraz inne znane specjaliście w tej dziedzinie techniki. Małe cząsteczki antagonistów LH, takie jak cząsteczki, o których donosi publikacja WO 00/61586 (Akzo Nobel) można podawać drogą doustną, w postaci syropu, tabletek lub kapsułek, po zmieszaniu z odpowiednią zaróbką. Alternatywnie, można je podawać donosowo, w postaci roztworu lub subtelnie rozdrobnionego proszku nadającego się do rozpylania. Wynalazek opisany zostanie w sposób bardziej szczegółowy w następującym przykładzie, nieograniczającym zakresu wynalazku. P r z y k ł a d Pacjentki wybrano w sposób następujący: Kryteria włączenia - Typ bezpłodności: bezpłodność jajowodowa IVF i bezpłodność niewyjaśniona (n = 120 ogółem) - Normalny rytm menstruacyjny - Wiek < 37 lat - Wskaźnik masy ciała (BMI): 30 - Nieprzyjmowanie aktualnie żadnych hormonów - 2 czynne jajniki Kryteria wyłączenia - Ultradźwiękowe stwierdzenie PCO (zespołu jajników wielotorbielowatych) - BMI > 30 - Jeden czynny jajnik - Inne choroby upośledzające Protokół Pacjentki poddaje się regulacji supresorowej (zaczynając od dnia cyklu miesiączkowego) za pomocą wstrzyknięć Lupron, Synarel lub Zoladex przez dni przed rozpoczęciem. Punkt startowy dla okresu primingu (dzień L1) wymaga poziomu estradiolu (E 2 ) w surowicy wynoszącego < 150 pmol/litr (50 pg/ml) i nie więcej niż jednej torbieli jajnika o średnicy < 30 mm. W okresie dnia L1 - L4 (okres primingu) pacjentki otrzymują codziennie placebo lub 225 IU rhlh. Zaczynając od ostatniego dnia okresu primingu, pacjentki otrzymują codziennie 150 IU FSH (przyjmowanie LH ustaje po L4) w ciągu 7 dni (S1 do S7). Dawki można zmniejszyć w dniu S7 lub później, jeżeli istnieje ryzyko nadmiernej stymulacji. W S7 dawki zwiększa się do 300 IU FSH /dzień, jeżeli stężenie E 2 w krążeniu jest mniejsze od 450 pmol/litr i/lub występuje < 6 pęcherzyków o średnicy > 8 mm. Podawanie FSH kontynuuje się, aż do momentu, gdy największy pęcherzyk osiągnął średnią średnicę wynoszącą co najmniej 17 mm i obecne są dwa inne pęcherzyki o średnicy średniej 16 mm, w którym to punkcie podaje się dawkę hcg wywołującą owulację ( IU hcg). W ciągu 36 godzin po wstrzyknięciu hcg odmierza się czas pozyskiwania oocytów. Oocyty zapładnia się in vitro. Zarodki wykazujące wczesne bruzdkowanie (do 25 godzin od inseminacji) uważa się za mające większe szanse jeśli chodzi o zagnieżdżenie się i pomyślny rozwój podczas ciąży. Sprawdzenia wczesnego bruzdkowania (EC) dokonuje się w 25 godzinie od inseminacji i rejestruje się liczbę zbruzdkowanych zarodków, zapłodnienie (połączenie się plemników z jajami) i zarodków niezbruzdkowanych. Rejestruje się także: - liczbę i średnicę pęcherzyków w dniu hcg, a w szczególności liczbę pęcherzyków o średnicy ponad 15 mm; - wydajność oocytów; - ilość zużytych ampułek rfsh;

10 10 PL B1 - ilość zużytych ampułek rfsh / oocyt; - stężenie estradiolu w krążeniu w S7; - zmniejszenie występowania słabych odpowiedzi" na traktowanie typową dawką (150 IU FSH/d) w populacji klinicznej; - stosunek ilości dużych pęcherzyków do ilości małych pęcherzyków w czasie podawania hcg; - liczbę pęcherzyków o średnicy średniej > 10 mm w S7; - stężenie inhibiny-b w krążeniu w S7. Odnośniki 1 Healy i in., Lancet, 343, (1994); 2 na przykład, typowa technika opisana jest w dokumencie patentowym EP Serono Laboratories, Inc.; 3 M. Filicori, J. Clin Endocrinol. Metab., 81, (1996); 4 M. Filicori i in., Fertil. Steril., 65, (1996); 5 Filicori i in., J. Clin. Endocrinol. Metab., 84, (1999); 6 The European Recombinant Human LH Study Group., J. Clin. Endocrinol. Metab., 83, (1998); 7 M.W. Sullivan i in., J. Clin. Endocinol. Metab., 84, (1999); 8 Sills i in., Humań Reproduction, 14, (1999); 9 A-F Ben-Amor, z ramienia Study Group (B.Tarlatzis, E. Tavmergen, Z. Shoham, M. Szamatowicz, A. Barash, A. Amit, I. Levitas i E. Geva): The effect of luteinizing hormone administered during late follicular phase in normo-owulatory women undergoing in vitro fertilization", Hum. Reprod., 15 (Abstract book 1): 46 (Abstract no (2000); 10 L. Werlin, E. Kelly., P. Weathersbee, L. Nebiolo, L. Ferrande: A multicenter, randomized, comparative, open-trial to assess the safety and efficacy of Gonal-F (r-hfsh) versus Gonal-F and recombinant human luteinizing hormone (r-hlh) in patients undergoing ICSI: Preliminary data", Fertil. Steril., 72, 3 (Suppl.l )(Abstract no.o-032) (1999). 11 R.S. Williams: A multi-center study comparing the efficacy of recombinant human FSH (Gonal-F) versus r-hfsh plus recombinant human LH in patients undergoing Controlled Ovarian Hyperstimulation for Assisted Reproductive Technology", Fertil. Steril., 74; 3 (Suppl. 1)(Abstract no. P-428) (2000). 12 Van Heil i in., Acta Endocrin., 47, (1964). Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie hormonu luteinizującego (LH) do wytwarzania leku do indukowania mnogiej folikulogenezy u człowieka, który to lek jest przeznaczony do podawania w okresie primingu zaczynającym się od 1 dnia fazy stymulacyjnej w kontrolowanej hiperstymulacji jajników (COH) i nie przekraczającym 4 dnia fazy stymulacyjnej w COH. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania bez podawania egzogennego FSH w okresie primingu. 3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania w dawkach wynoszących 20 do 400 Ul LH/dzień, 100 do 200 IU LH/dzień lub 150 IU LH/dzień. 4. Zastosowanie według zastrz. 1-3, znamienne tym, że okres primingu trwa od dnia 1 do dnia 3 fazy stymulacyjnej. 5. Zastosowanie według zastrz. 1-3, znamienne tym, że okres primingu trwa od dnia 1 do dnia 2 fazy stymulacyjnej. 6. Zastosowanie według zastrz. 1-3, znamienne tym, że lek podawany jest jako dawka pojedyncza w dniu 1 fazy stymulacyjnej. 7. Zastosowanie według zastrz. 1-6, znamienne tym, że LH stanowi rhlh. Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,00 zł.