ANALIZA KARIOTYPU MIESZAŃCÓW Z KRZYŻOWAŃ ZWROTNYCH POMIĘDZY [4X] PHLEUM COMMUTATUM GAUD. I [4X] PHLEUM PRATENSE L.

ACTA AGRARIA ET SILVESTRIA Series Silvestris Vol. XLVIII PL ISSN 0065-0927 ANALIZA KARIOTYPU MIESZAŃCÓW Z KRZYŻOWAŃ ZWROTNYCH POMIĘDZY [4X] PHLEUM COMMUTATUM GAUD. I [4X] PHLEUM PRATENSE L. Adam Kula Agnieszka Paleczny Barbara Galant Alan Stewart Elwira Śliwińska Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza, ul. Łobzowska 24, PL 31 140 Kraków, Poland PGG Wrightson Seeds, PO Box 939, Christchurch, Nowa Zealandia Zakład Biologii Molekularnej i Cytometrii, Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy, al. Kaliskiego 7, PL 85 796 Bydgoszcz ABSTRACT Kula A., Stewart A., Śliwińska E., Paleczny A., Galant B. 2007. Karyotype analysis of hybrids of reciprocal crossings between [4x] Phleum commutatum Gaud. and [4x] Phleum pratense L. Acta Agr. Silv. Ser. Agr. 48: 15 31. The paper presents the results of the research on the karyotype structure and amount of nuclear DNA in reciprocal hybrids between the tetraploid alpine cats tail grass and the tetraploid timothy grass. The hybrid forms were grown from F1 grains. For the karyotype analysis staining in acetic orceine and C-banding were used. Nuclear DNA measurements were taken in a flow cytometer. In the root apical meristem of the two forms the authors revealed the occurrence of an unstable chromosome number apart from the typical tetraploid number 2n = 28, different aneuploid numbers were recorded. The band karyotype shows the occurrence of the same telomeric type of heterochromatin distribution, characteristic of the genomes of one of the parental forms P. pratense [4x], no matter if it was a maternal or paternal form in the crossing. KEY WORDS: DNA amount, heterochromatin distribution, interspecific hybrids, [4x] Phleum commutatum Gaud., [4x] P. pratense L. SŁOWA KLUCZOWE: dystrybucja heterochromatyny, mieszańce międzygatunkowe, [4x] Phleum commutatum Gaud., [4x] P. pratense L., poziom DNA

16 I. WSTĘP W genetyce i hodowli traw znaczącą rolę ogrywają badania nad mieszańcami międzygatunkowymi. Niektóre z tych form jak oddalone mieszańce Triticosecale i Festulolium należą do ważnych traw zbożowych i pastewnych. Dzięki wszechstronnym badaniom cytogenetycznym opartych na metodach prążkowych (Cbanding) i hybrydyzacyjnych (FISH, GISH) udało się prześledzić losy genomów rodzicielskich w kariotypie licznych mieszańców przy zastosowaniu najrozmaitszych schematów krzyżowań. U mieszańców pomiędzy jęczmieniem i żytem genomy rodzicielskie ulegają separacji lub jeden z nich, najczęściej ojcowski ulega eliminacji (Schwarzacher i inni 1989). W kompleksach mieszańców Triticum-Secale i Lolium-Festuca identyfikowano niezmienione genomy form rodzicielskich, ale także genomy w różnym stopniu zrekombinowane (Zwierzykowski i inni 2004). Badania cytogenetyczne nad międzygatunkowymi mieszańcami w obrębie sekcji Phleum w latach trzydziestych ubiegłego stulecia zapoczątkowała badaczka szwedzka Nordenskiöld. Zajmowała się przede wszystkim koniugacją chromosomów w trakcie mejozy, a także ustaliła liczbę chromosomów oraz płodność wielu form mieszańcowych tymotek (Nordenskiöld 1937, 1945, 1949, 1957, 1960). Ze względu na brak odpowiednich metod nie było wtedy możliwe poznanie struktury genomów rodzicielskich w komórkach mieszańców. W ostatnim czasie ponownie wzrosło zainteresowanie międzygatunkowymi mieszańcami tymotek. W pewnym stopniu było to spowodowane włączeniem do prac hodowlanych, opisanych pod koniec lat siedemdziesiątych ubiegłego wieku naturalnych tetraploidalnych form tymotki łąkowej (Cenci 1979, 1982, Casler 2001). Formy tetraploidalne są pożądanymi rodzicami w krzyżowaniach międzygatunkowych, ponieważ można z nich w najprostszy sposób już w pokoleniu F 1 wyprowadzić płodne amfidiploidy bez standardowo w takich przypadkach stosowanego kolchicynowania. Struktura kariotypu form rodzicielskich omawianych w tej pracy mieszańców międzygatunkowych tymotek została już opisana. Obydwie formy są prawdopodobnie autotetraploidami wyposażonymi w genomy o odmiennym typie dystrybucji heterochromatyny. Pierwsza z form rodzicielskich: tymotka alpejska [4x] Phleum commutatum posiada prawdopodobnie 4 genomy typu C o centromerowym typie dystrybucji heterochromatyny (Kula i in. 2006). Druga z form rodzicielskich tymotka łąkowa [4x] P. pratense zawiera 4 genomy typu P o telomerowym typie dystrybucji heterochromatyny (Kula i in. 2002, Kula 2005a). Celem prezentowanej pracy było przeprowadzenie analizy kariotypu potomstwa krzyżówek zwrotnych pomiędzy tetraploidalnymi cytotypami tymotki alpejskiej i łąkowej oraz określenie ewentualnych zmian w strukturze genomów rodzicielskich u form potomnych.

17 II MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiły dwie formy Phleum otrzymane w wyniku zwrotnego krzyżowania [4x] Phleum commutatum pochodzącego z Point Reyes w Kalifornii i [4x] Phleum pratense wywodzącego się z okolic Brissac we Francji. Formy mieszańcowe wyhodowane zostały w Instytucie Rolniczym (PGG Wrightson Seeds, Christchurch) w Nowej Zelandii przez jednego z autorów (A. Stewart). Rośliny wyhodowano z ziarniaków pokolenia F 1. Siewki rosły w pokoju wegetacyjnym, przy długim dniu (16 godzin dzień, 8 godzin noc) w temperaturze 16 20 C. Ustalenie somatycznej liczby chromosomów oraz analizę struktury kariotypu przeprowadzono na 30 wyrośniętych roślinach każdej z form. Chromosomy barwiono konwencjonalnie orceiną octową (Joachimiak 1994) oraz różnicowo, metodą DAPI C-banding (Pedrosa i in. 2001) i prążków C (Jouve i in. 1980). Analizę kariotypu u danej formy przedstawiano na podstawie pomiarów 20 płytek metafazowych barwionych konwencjonalnie, obserwowanych w preparatach z merystemu korzeniowego różnych roślin. Typy morfologiczne chromosomów wyróżniono na podstawie publikacji Levana i innych z 1964 roku. Współczynnik asymetryczności kariotypu: A obliczano według wzorów, jakie podają Watanabe i inni (1999). Metodę DAPI C-banding wykorzystywano jedynie do wstępnej analizy kariotypu prążkowego. Szczegóły budowy kariotypu prążkowego ustalono na podstawie 10 płytek metafazowych barwionych metodą prążków C, obserwowanych również u osobnych okazów roślin. Archiwizację płytek metafazowych przeprowadzono, wykorzystując system analizy obrazu Lucia G oraz mikroskop Eclipse E800 (Nikon). Pomiary chromosomów i ilości heterochromatyny wykonano w programie CytoPlane wer. 1.2. Budowę kariotypu oraz obrazy graficzne chromosomów przedstawiono dzięki użyciu programu Mr Karyo wer. 3.10. Pomiarów cytometrycznych ilości jądrowego DNA dokonano w jądrach młodych liści z użyciem cytometru przepływowego Partec CCA i linii Phleum pratense [6x] z Kostrza pod Krakowem jako standardu wewnętrznego (8,92 pg/2c ryc. 6; Śliwińska i in. 2003), zaś próby przygotowano według opisanej wcześniej metodyki (Joachimiak i in. 2001). Dla określania ilości 2C DNA dla roślin z danego stanowiska przyjęto średnią z pomiarów 10 okazów. Pomiary cytometryczne zostały wykonane w Zakładzie Biologii Molekularnej i Cytometrii, Uniwersytetu Technologiczno-Przyrodniczego w Bydgoszczy. Użyte do analizy porównawczej dane dotyczące morfologii, struktury kariotypu i wielkości genomu form rodzicielskich uzyskano na podstawie doświadczeń i prac z lat poprzednich (Kula i in. 2002, Śliwińska i in. 2003, Kula i in. 2006).

18 III. WYNIKI Rośliny obydwu form mieszańcowych (P. commutatum x P. pratense nazywaną dalej formą A oraz P. pratense x P. commutatum nazywaną dalej formą B), pokrojem przypominały formy mateczne. Obydwie formy były płodne. Przy swobodnym zapylaniu osadzanie ziarniaków wynosiło około 5%, pomimo, że rośliny rosły w pokoju wegetacyjnym gdzie warunki nie sprzyjały wiatropylności. Ziarniaki miały normalną zdolność kiełkowania. Somatyczna liczba chromosomów i struktura kariotypu U obydwu badanych form zaobserwowano występowanie w merystemie korzeniowym tetraploidalnej liczby chromosomów 2n = 28 (ryc. 1). W celu ustalenia liczby chromosomów przeanalizowano 88 płytek metafazowych formy A i 82 płytki metafazowe formy B. Jednak w przypadku 17 płytek metafazowych formy A i 15 płytek metafazowych formy B, czyli u około 20%, odno- Ryc. 1. Chromosomy metafazowe form rodzicielskich oraz form potomnych barwione orceiną octową a) P. commutatum Gaud. (2n = 28); b) P. pratense L. (2n = 28); c) forma A z powstała krzyżówki: P. commutatum (2n = 28) P. pratense (2n = 28); d) forma B z powstała krzyżówki odwrotnej. Skala 5 µm Fig. 1. Metaphase chromosomes of the parental and filial forms, stained in acetoorceine a) P. commutatum Gaud. (2n = 28); b) P. pratense L. (2n = 28); c) form A derived from the crossing: P. commutatum (2n = 28) P. pratense (2n = 28); d) form B derived from the reverse crossing. Scale 5 µm

Ryc. 2. Płytki metafazowe form potomnych o zróżnicowanej liczbie chromosomów. a) 2n = 25; b) 2n = 30; c) 2n = 32; d) 2n = 40 e) 2n = ~52; f) 2n = ~59 (a, f) forma B powstała z krzyżówki: P. pratense (2n = 28) P. commutatum (2n = 28); (b,c,d,e) forma A powstała z krzyżówki odwrotnej. Skala 5 µm Fig. 2. Metaphase plates of filial forms with different chromosome numbers. a) 2n = 25; b) 2n = 30; c) 2n = 32; d) 2n = 40 e) 2n = ~52; f) 2n = ~59 (a, f) form B derived from the crossing: P. pratense L. (2n = 28) P. commutatum Gaud. (2n = 28); (b,c,d,e) form A derived from the reverse crossing. Scale 5 µm 19

Tabela 1 Table 1 Struktura kariotypu u czterech form Phleum: form rodzicielskich: P. commutatum Gaud. (2n = 28) i P. pratense L. (2n = 28) oraz u form potomnych. Karyotype structure in four forms of Phleum: parental forms: P. commutatum Gaud. (2n = 28) and P. pratense L. (2n = 28) and in filial forms. 20 Lp. No Gatunek/mieszaniec Species/hybrid 2n Średnia długość kariotypu Mean karyotype length [µm] ± SD Średnia długość chromosomu Mean chromosome length [µm] ± SD Współczynnik asymetryczności kariotypu (A) Asymmetry coefficient of karyotype Formuła morfologii chromosomów Formula of chromosome morphology 1 P. commutatum Gaud. 28 106,10 ± 8,72 3,76 ± 0,73 0,18 24 m + 4 sm 2 P. pratense L. 28 128,34 ± 3,50 4,46 ± 0,92 0,18 24 m + 4 sm 3 Forma A powstała z krzyżówki: Form A derived from the crossing: P. commutatum Gaud. P. pratense L. 4 Forma B z krzyżówki: Form B derived from the crossing: P. pratense L. P. commutatum Gaud. 28 85,19 ± 8,89 3,04 ± 0,65 0,20 24 m + 4 sm 28 78,99 ± 12,21 2,84 ± 0,74 0,20 24 m + 4 sm Oznaczenia/Designations: m chromosom metacentryczny/metacentric chromosome, sm chromosom submetacentryczny/submetacentric chromosome

towano odstępstwa o liczby tetraploidalnej. Były to najczęściej aneuploidalne liczby chromosomów: mniejsze lub większe niż 28, obserwowano także liczby oscylujące wokół heksa- i oktoploidalnego poziomu ploidalności (ryc. 2). 21 Ryc. 3. Chromosomy metafazowe barwione metodą prążków C (a,b,e,f,g) i metodą DAPI C-bading (c,d) u form rodzicielskich i potomnych. a) P. commutatum Gaud. (2n = 28); b) P. pratense L. (2n = 28); c) forma A powstała z krzyżówki: P. commutatum (2n = 28) P. pratense (2n = 28); d) forma B powstała z krzyżówki odwrotnej; e,f) forma A; g) forma B. Skala 5 µm Fig. 3. Metaphase chromosomes C-banded (a,b,e,f,g) and DAPI C-banded (c,d) in parental and filial forms. a) P. commutatum Gaud. (2n = 28); b) P. pratense L. (2n = 28); c) form A derived from the crossing: P. commutatum (2n = 28) P. pratense (2n = 28); d) form B derived from the reverse crossing; e,f) form A; g) form B. Scale 5 µm

22 Ryc. 4. Porównanie kariogramów prążkowych form rodzicielskich i potomnych. a) P. commutatum Gaud. (2n = 28); b) P. pratense L. (2n = 28); c) forma A powstała z krzyżówki: P. commutatum (2n = 28) P. pratense (2n = 28); d) forma B powstała z krzyżówki odwrotnej. * chromosomy SAT Fig. 4. Comparison of band karyograms of parental and filial forms. a) P. commutatum Gaud. (2n = 28); b) P. pratense L. (2n = 28); c) form A derived from the crossing: P. commutatum (2n = 28) _P. pratense (2n = 28); d) form B derived from the reverse crossing. * SAT chromosomes

Ze względu na małe zróżnicowanie morfologiczne chromosomów zarówno u form rodzicielskich jak i obydwu form potomnych analiza kariotypu, po barwieniu chromosomów orceiną octową, ograniczyła się do porównania kilku podstawowych parametrów. W przypadku wszystkich analizowanych form formuła kariotypu była identyczna: 24 m + 4 sm. Obie formy mieszańcowe wykazywały duże podobieństwo co do średniej długości kariotypu i chromosomu a także posiadały identyczny współczynnik asymetrii kariotypu i różniły się pod względem tych cech od form rodzicielskich (tab. 1). 23 Analiza kariotypu praz kowego Odmienna struktura chromosomów u form rodzicielskich wskazywała na możliwość rozróżniania chromosomów rodziców w kariotypie mieszańców, tak jak jest to możliwe np. w przypadku prążkowego barwienia chromosomów pszenżyta. Jednak barwienie chromosomów form mieszańcowych metodą DAPI Ryc. 5. Zawartość poszczególnych rodzajów heterochromatyny w kariotypach form rodzicielskich i potomnych Fig. 5. The content of particular types of heterochromatin in the karyotypes of parental and filial forms

24 C-banding oraz C-banding dało taki sam, odmienny od zakładanego wynik, ponieważ wykazywało obecność chromosomów o wzorze prążkowym charakterystycznym dla jednej tylko formy rodzicielskiej: [4x] P. pratense. W pokoleniu F 1 obydwu krzyżówek zaobserwowano bowiem chromosomy głównie o telomerowym typie dystrybucji heterochromatyny (ryc. 3). Wyjątek stanowił jeden okaz spośród 30 analizowanych roślin formy A o wybitnie centromerowej dystrybucji heterochromatyny (ryc. 3f). Roślina powstała przypuszczalnie w wyniku samozapylenia formy matecznej. Szczegółowa analiza kariotypu prążkowego pozwoliła także wyróżnić chromosomy o telomerowo-centromerowym typie dystrybucji heterochromatyny pośrednim pomiędzy formami rodzicielskimi (ryc. 4). Obecność chromosomów tego typu widoczna jest najlepiej u formy A (P. commutatum x P. pratense), co uwidacznia się również przy porównaniu udziału różnych frakcji heterochromatyny w budowie kariotypu wymienionej formy z formami rodzicielskimi (ryc. 5). Ilosc jadrowego DNA Wielkość genomu badanych form Phleum wahała się od 6,2 do 6,7 pg/2c (tab. 2). Formy rodzicielskie analizowanych form potomnych A i B różnią się ilością jądrowego DNA. Różnica ta jest statystycznie istotna i wynosi nieco powyżej 0,5 pg. Z kolei pomiary ilości jądrowego DNA dokonane u obydwu Tabela 2 Table 2 Analiza statystyczna ilości jądrowego DNA u czterech form Phleum: form rodzicielskich: P. commutatum Gaud. (2n = 28) i P. pratense L. (2n = 28) oraz u form potomnych. Statistcal analysis of the nuclear DNA amount in four forms of Phleum: parental forms: P. commutatum Graud. (2n = 28) and P. pratense L. (2n = 28) and in filial forms. Lp. No Gatunek/mieszaniec Species/hybrid Ilość jądrowego DNA Amount of nuclear DNA (2C) ± SD (pg) Wynik testu Duncan'a Duncan's test result (P < 0,05) 1. P. commutatum Gaud. (2n = 28) 6,165 ± 0,093 b 2. P. pratense L. (2n = 28) 6,706 ± 0,082 a 3. Forma A Form A P. commutatum Gaud. (2n = 28 P. pratense L. (2n = 28) 4. Forma B Form B P. pratense L. (2n = 28) P. commutatum L. (2n = 28) 6,197 ± 0,174 b 6,581 ± 0,1s81 a

25 Ryc. 6. Histogramy z pomiarów ilości jądrowego DNA u form potomnych. a) forma A powstała z krzyżówki: P. commutatum Gaud. (2n = 28) P. pratense L. (2n = 28); b) forma B powstała z krzyżówki odwrotnej. Na wykresach wyróżniono szczyty 2C: lewy odpowiedniej formy potomnej, prawy standardu wewnętrznego Fig. 6. Histograms of measurements of the nuclear DNA amount in filial forms. a) form A derived from the crossing: P. commutatum Gaud. (2n = 28) P. pratense L. (2n = 28); b) form B derived from the reverse crossing. In the graphs peaks 2C are distinguished: left appropriate filial form, right internal standard form potomnych wykazały istotne różnice pomiędzy nimi i brak istotnych różnic pomiędzy ich formami matecznymi. IV. DYSKUSJA Liczby chromosomów i struktura kariotypu. U obydwu analizowanych form potomnych A i B stwierdzono znaczną zmienność liczby chromosomów w merystemie wierzchołkowym korzenia, odbiegającą od liczby tetraploidalnej. Jeśli pominąć nawet występowanie aneuploidalnych liczb mniejszych niż 2n = 28 (mogły to być fragmenty płytek tetraploidalnych), to występowanie wyższych liczb poliploidalnych świadczy o zajściu zmian mutacyjnych. Warto zaznaczyć, że Zwierzykowski (1993) badając tetraploidalne mieszańce z kompleksu Lolium-Festuca także opisał występowanie u nich liczb hypotetraploidalnych (< 28). Dla rodzaju Phleum typowe jest występowanie stabilnych, euploidalnych liczb chromosomów będących wielokrotnością genomowej liczby 7. Odstępstwa od liczby euploidalnej zdarzają niezwykle rzadko i polegają na występowaniu pojedynczych chromosomów nadliczbowych lub tez niewielkiej liczby (zwykle od 1 do 2) B-chromosmów, ze względu na swoją niewielką długość łatwo odróżnialnych od chromosomów A kompleksu (Kula 2005b). Niestabilność somatycznej liczby chromosomów obserwowano wielo-

26 krotnie u nowopowstałych mieszańców, opisano je np. w kompleksach: Triticum-Secale i Lolium-Festuca (Zwierzykowski i inni 2004). Udokumentowana w tej pracy niestabilność liczby chromosomów u obukierunkowych mieszańców pomiędzy tymotką alpejską i łąkową jest silnym argumentem za ich rzeczywistym mieszańcowym pochodzeniem. Analiza struktury kariotypu form rodzicielskich i potomstwa obukierunkowych krzyżówek pozwala zauważyć podobieństwo obydwu form potomnych: A i B dotyczące średniej długości kariotypu i chromosomu oraz współczynnika asymetrii kariotypu. Dalsze informacje, pomocne do określenia pochodzenia form potomnych, dostarcza analiza struktury kariotypu prążkowego. W przypadku formy A w kariotypie przeważają chromosomy o ojcowskim, telomerycznym typie dystrybucji heterochromatyny, a więc takie, jakich nie spotyka się u formy matecznej. Fakt ten świadczy o udanym krzyżowaniu. U osobników formy B powstałych w wyniku odwrotnego krzyżowania zaobserwowano identyczny jak poprzednio telomeryczny typ dystrybucji heterochromatyny, tym razem taki sam, jaki występuje u formy matecznej. W tym przypadku nie da się wykluczyć, że badane osobniki nie były allopoliploidami, lecz po prostu następnym pokoleniem tetraploidalnej tymotki łąkowej. Biorąc pod uwagę różny typ dystrybucji heterochromatyny u form rodzicielskich przypuszczano, że uda się znaleźć w kariotypach mieszańców chromosomy obydwu, a nie tylko jednej formy rodzicielskiej. Wytłumaczenie występowania telomerycznego typu dystrybucji heterochromatyny u form A i B może być dwojakie. (1) Chromosomy z centromerycznym układem prążków heterochromatynowych były eliminowane u każdego z obukierunkowych mieszańców tymotek niezależnie od tego, która forma rodzicielska wnosiła je w gametach, natomiast chromosomy z telomerycznym układem heterochromatyny ulegały amplifikacji. (2) W kariotypie obydwu form mieszańcowych występują jedynie chromosomy zrekombinowane. U badanych różnych linii pszenżyta tetraploidalnego udział chromosomów pszenicznych i żytnich był zrównoważony, a obydwa typy chromosomów były łatwo rozróżnialne w barwieniu C-banding (Lukaszewski i in. 1984, Apolinarska 1993). U allopoliploidalnych i introgresyjnych form Lolium-Festuca przy zastosowaniu metody GISH dało się wyróżnić zarówno występujące w przewadze liczbowej chromosomy zrekombinowane, jak i występujące w mniejszości niezmienione chromosomy rodzicielskie. Duży procent chromosomów zrekombinowanych u mieszańców życic i kostrzew bierze się prawdopodobnie z zachodzenia rekombinacji mejotycznej zarówno homo- jak i homeologicznej, a także zmiany lokalizacji crosing-over z dystalnej na losową (Zwierzykowski i inni 1998). Prawdopodobnie w przypadku analizowanych mieszańców pomiędzy tymotką alpejską i łąkową mamy do czynienia z podobnymi procesami rekombinacji genomów jak u Festulolium, przy czym jeszcze bardziej nasilonymi, co spowodowane jest stosunkowo bliskim pokrewieństwem obydwu gatunków

rodzicielskich. Procesom rekombinacyjnym towarzyszyła przypuszczalnie redukcja heterochromatyny centromerowej i amplifikacja heterochromatyny telomerycznej w genomach typu C pochodzących od tymotki alpejskiej, co doprowadziło do ujednolicenia genomów mieszańców. Zmiany tego typu, opisywane także u innych organizmów, wywołane są prawdopodobnie nierównym crosing-over oraz konwersją sekwencji (Vanzela i Guerra 2000, Savitsky i in. 2002, Malkova i in. 2004) Nieprzypadkowe wydaje się także podobieństwo stylu prążkowego u analizowanych form tymotek z dwoma innymi przedstawicielami rodzaju Phleum: P. pratense L. (2n = 6x = 42) i P. echinatum Host (2n = 2x = 10). Obydwa wymienione gatunki mają prawdopodobnie pochodzenie allopoliploidalne, a w ich powstaniu wzięły udział, podobnie jak w przypadku analizowanych mieszańców, gatunki z dwóch grup sekcji Phleum: P. pratense i P. alpinum (Cai i Bullen 1994, Joachimiak i Kula 1997, Kula 2005b). 27 Poziom jadrowego DNA Brak różnic statystycznie istotnych w ilościach DNA pomiędzy formami A i B oraz ich formami matecznymi nie dowodzi ich mieszańcowosci. Jednak wyniki te nie są rozstrzygające. Wiadomo bowiem, że u gatunków poliploidalnych zwykle tuż po powstaniu nowej formy mieszańcowej dochodzić może do różnorakich zmian ilości jądrowego DNA. Umożliwiają one dopasowanie się różnych typów genomów w obrębie nowego jądra komórkowego i polegają na wycinaniu lub replikacji tranzspozonów. Redukcję ilości DNA u nowo wytworzonych form mieszańcowych stwierdzono u pszenic, a także u wielu innych gatunków roślin drzewiastych i zielnych (Feldman i in. 1997, Ozkan i in. 2001, Ohri 1998, Bennetzen 2002). Z kolei wielkość genomów kukurydzy w porównaniu z gatunkami najbliżej z nią spokrewnionymi wskazuje, ze przy powstaniu tego taksonu doszło do powiększenia wielkości genomów na skutek replikacji transpozonów (Kellog 2001). Wreszcie w pewnych przypadkach ilość jądrowego DNA odpowiada sumie genomów spotykanych u form rodzicielskich. Ze zjawiskiem takim spotkano się badając amfidiploidy w rodzaju Brassica (Ohri 1998). Jeśli założyć, że ilość DNA u badanych form mieszańcowych tymotki miałaby ściśle odpowiadać sumie genomów spotykanych u form rodzicielskich to powinna ona wynosić: 2 1,677* pg + 2 1,541 ** pg = 6,436 pg. Faktyczne ilości jądrowego DNA stwierdzone u tych form różnią jedynie o około ±0,2 pg, od ** Szacunkowa wielkość genomu C [4x] P. commutatum wyliczona na podstawie danych z tabeli 2. ** Szacunkowa wielkość genomu P [4x] P. pratense wyliczona na podstawie danych z tabeli 2.

28 ilości założonej teoretycznie (tab. 2). Przytoczone dane nie wykluczają zatem zajścia zmian ilości jądrowego DNA, podobnych do tych, jakie stwierdzono u innych mieszańców międzygatunkowych. Jednorodność wyników pomiarów jądrowego DNA u badanych form (małe odchylenia standardowe od średniej) świadczy o tym, że w komórkach liści, na których takich pomiarów dokonano, występowała jedynie tetraploidalna liczba chromosomów. Niestabilność liczby chromosomów zaobserwowana w merystemie korzeniowym odnosiła się prawdopodobnie tylko do tej tkanki. Z podobną sytuacją spotkano się w przypadku innego taksonu traw: Bromus carinatus odm. Broma, u którego w stożkach wzrostu korzenia udokumentowano miksoploidalność, natomiast w innych tkankach występowanie typowej dla tego gatunku liczby oktoploidalnej (2n = 8x = 56) (Kula 1999, Joachimiak i in. 2002). V. WNIOSKI 1. W merystemie wierzchołkowym korzenia obydwu badanych form: formy A (P. commutatum Gaud. P. pratense L.) oraz formy B (P. pratense L. P. commutatum Gaud.), u około 20% analizowanych metafaz, zaobserwowano niestabilność liczby chromosomów. Nie notowano jej dotąd ani u form rodzicielskich, ani u dalszych przedstawicieli rodzaju Phleum. Występowanie mutacji tego typu spotykane było także u innych mieszańców międzygatunkowych i świadczy o mieszańcowym pochodzeniu form A i B. 2. U obydwu badanych form stwierdzono podobny, telomerowy typ dystrybucji heterochromatyny, który występuje tylko u jednego z rodziców P. pratense L. W przypadku formy A obecność w kariotypie chromosomów o ojcowskim układzie prążków heterochromatynowych, niewystępujących u formy matecznej, potwierdza jej mieszańcowe pochodzenie. Mieszańcowy charakter formy B, nie ma już tak wyraźnego odzwierciedlenia w budowie kariotypu, chociaż podobieństwo struktury kariotypu form A i B może na to pośrednio wskazywać. 3. Biorąc pod uwagę wszystkie zgromadzone dane należy stwierdzić, że formy A i B mają pochodzenie mieszańcowe. Podobny obraz struktury kariotypu, jaki u nich spotykamy wynika przypuszczalnie z zajścia głębokich zmian w strukturze genomów rodzicielskich polegających na ich ujednoliceniu. Zmiany te dotyczyły głównie genomu typu C pochodzącego od tymotki alpejskiej i doprowadziły do jego upodobnienia do genomu typu P wniesionego przez tymotkę łąkową. 4. Celowym wydaje się sprawdzenie przydatności hodowlanej tych form, np. pod kątem występowania u nich najlepszych cech rodziców: mrozoodporności tymotki alpejskiej i smakowitości tymotki łąkowej.

29 LITERATURA Apolinarska B. 1993. Stabilization of ploidy and fertility level of tetraploid triticale from four cross combinations. Genet. Pol. 34: 121 131. Bennetzen J.L. 2002. Mechanisms and rates of genome expansion and contraction in flowering plants. Genetica 115: 29 36. Cai Q., Bullen M.R. 1994. Analysis of genome-specific sequences in Phleum species: identification and use for study of genomic relationships. Theor. Appl Genet. 88: 831 837. Casler M.D. 2001. Patterns of variation in a collection of timothy accessions. Crop Sci. 41: 1616 1624. Cenci C.A. 1979. Numero chromosomico e caratteri morfologici di alcuni ecottipi di Phleum pratesne L. (Graminaee) dellitalia centrale. Giorn. Bot. Ital. 113: 145 155. Cenci C.A., Pegiati M.T., Falistocco E. 1984. Phleum pratense (Gramineae): chromosomal and biometrical analysis of Italian populations. Willdenowia 14: 343 353. Feldman M., Liu B., Segal G., Abbo S., Levy A.A., Vega J.M. 1997. Rapid elimination of low-copy DNA sequences in polyploid wheat: A possible mechanism for differentiation of homeologous chromosomes. Genetics 147: 1381 1387. Joachimiak A., Kula A. 1997. Systematics and karyology of section Phleum in the genus Phleum. J. Appl. Genet. 38: 463 470. Joachimiak A., Kula A., Śliwińska E., Sobieszczańska A. 2001. C-banding and nuclear DNA amount in six Bromus species. Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 43: 105 115. Jouve N., Diez N., Rodriguez M. 1980. C-banding in 6x-Triticale Secale cereale L. hybrid cytogenetics. Theor. Appl. Genet. 57: 75 79. Kellog E.A. 2001. Evolutionary History of the Grasses. Plant Physiol. 125: 1198 1205. Kula A. 1999. Cytogenetics studies in the cultivated form of Bromus carinatus (Poaceae). Fragm. Flor. Geobot. Suppl. 7: 101 106. Kula A. 2005a. Searching for a primeval Phleum karyotype. W: L. Frey, ed. Biology of grasses. Kraków [W:] Szafer Institute of Botany, Academy of Sciences, s. 197 206. Kula A. 2005b. Kariologia i morfologia gatunków z rodzaju Phleum. Zeszyty Naukowe Akademii Rolniczej w Krakowie, s. 171 Kula A., Dudziak B., Sliwinska E., Grabowska-Joachimiak A., Stewart A., Golczyk H., Joachimiak A. 2006. Cytomorphological studies on American and European Phleum commutatum Gaud. (Poaceae). Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. w druku. Kula A., Joachimiak A., Kłos J., Stewart A. 2002. Udział heterochromatyny w budowie kariotypu sześciu linii Phleum z kolekcji z nowej Zelandii. Zesz. Probl. Post. Nauk Roln. 488: 259 266. Levan A., Fredga K., Sandberg A., 1964. Nomenclature for centromeric position of chromosomes. Hereditas 52: 201 220. Lukaszewski A.J., Apolinarska B., Gustafson J.P., Krolow K.D. 1984. Chromosome constitution of tetraploid triticale. Z. Plfanzenzüchtg. 93: 222 236. Malkova A., Swanson J., German M., McCusker J.H., Housworth E.A, Stahl F.W., Chaber J.E. 2004. Gene Conversion and Crossing Over Along the 405-kb Left Arm of Saccharomyces cerevisiae Chromosome VII. Genetics 168: 49 63. Nordenskiöld H. 1937. Intra- and interspecific hybrids of Phleum pratense and P. alpinum. Hereditas 23: 304 316. Nordenskiöld H. 1945. Cytogenetic studies in the genus Phleum. Acta Agr. Suecana 1: 1 137. Nordenskiöld H. 1949. Synthesis of Phleum pratense L. from P. nodosum L. Hereditas 35: 190 202. Nordenskiöld H. 1957. Segregation ratios in progenies of hybrids between natural and synthesized Phleum pratense. Hereditas 43: 525 540. Nordenskiöld H. 1960. The mode of segregation in a family of hexaploid Phleum pratense. Hereditas 46: 504 510. Ohri D. 1998. Genome size variation and plant systematics. Ann. Bot. 82: 75 83.

30 Ozkan H., Levy A.A, Feldman M. 2001. Allopolyploidy-induced rapid genome evolution in the wheat (Aegilops-Triticum) group. Plant Cell 13: 1735 1747. Pedrosa A., Jantsch M.F., Moscone E.A., Ambros P.F., Schweizer D. 2001. Characterisation of pericentromeric and sticky intercalary heterochromatin in Ornithogalum longibracteatum (Hyacinthaceae). Chromosoma 110: 203 213. Savitsky M., Kravchuk O., Melnikova L., Georgiev P. 2002. Heterochromatin Protein 1 Is Involved in Control of Telomere Elongation in Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology 22: (9) 3204 3218. Schwarzacher T., Leith A.R. Bennet M.D., Heslop-Harrison J.S. 1989. In situ localization of parental genomes in wide hybrid. Ann. Bot. 64 (3): 315 324. Śliwińska E., Kula A., Joachimiak A., Stewart A. Genome size in the genus Phleum. W: Application of Novel Cytogenetic and Molecular Techniques in Genetics and Breeding of the Grasses, International Workshop. s. 19. Poznań, 1 2 April 2003. Watanabe K., Yahara T., Denda T., Kosuge K. 1999. Chromosomal evolution in the genus Brachyscome (Asteraceae, Asterae): Statistical tests regarding correlation between changes in karyotype and habit using phylogenetic information. J. Plant. Res. 112: 145 161. Vanzela A.L.L., Guerra M. 2000. Heterochromatin differentiation in holocentric chromosomes of Rhynchospora (Cyperaceae). Genetics and Molecular Biology, 23: (2) 453 456. Zwierzykowski Z., Apolinarska B., Sodkiewicz W., Kosmala A., Leśniewska-Bocianowska A. 2004. W: Krajewski P., Zwierzykowski Z., Kachlicki P. (red.). Genetyka w ulepszaniu roślin użytkowych. Instytut Genetyki PAN w Poznaniu. 39 60. Zwierzykowski Z., Joaś W., Naganowska B. 1993. Amfitetraploidalne mieszańce Festuca pratensis Huds. Lolium multiflorum Lam. [= Festulolium braunii (K. Richter) A. Camus]. Biul. IHAR 188: 61 69. Zwierzykowski Z., Tayyar R., Brunell M., Lukaszewski A.J. 1998. Genome recombination in intergeneric hybrids between tetraploidy Festuca pratensis and Lolium multiflorum. J. Hered. 89: 324 328. Summary Adam Kula 1, Alan Stewart 2, Elwira Śliwińska 3, Agnieszka Paleczny 1 i Barbara Galant 1 Karyotype analysis of hybrids of reciprocal crossings between [4x] Phleum commutatum Gaud. and [4x] Phleum pratense In the years 2005 2006 in the Departament of Plant Breeding and Seed Science the authors conducted cytogenetic research on reciprocal hybrids (forms A and B) from F1 generation obtained from crossing between two tetraploid cytotypes P. commutatum and P. pratense. The two forms were bred in PGG Wrightson Seeds, Christchurch, New Zealand by one of the authors (A. Stewart). The investigation aimed at establishing whether the examined forms were in fact of hybrid origin. In both forms the researchers observed the occurrence of the tetraploid chromosome number 2n = 28, which was also confirmed by the measurements of the amount of nuclear DNA. In the root meristem, apart from the typical tetraploid cells, the presence of considerable number of aneuploid cells (about 20%) was found and the chromosome number in them ranged from tetra-, hexa- to octoploid ploidy level. The observed mutation changes in forms A and B, which were also recorded in other interspecific hybrids, prove their hybrid origin. The karyotype structure of the two examined forms is similar and characterised by the telomeric type of heterochromatin distribution, typical of [4x] P. pratense, no matter if the plants were maternal or paternal forms in the crossing. In the case of form A ([4x] P. commutatum [4x] P. pratense) the presence of the paternal pattern of

heterochromatin bands in the karyotype (which are not present in the maternal form) clearly reveals its allopolyploid origin. However, the hybrid character of form B ([4x] P. pratense 148 [4x] P. commutatum) is not as distincly reflected in the karyotype structure as in the case of form A. On one hand, the similar band karyotype structure of form B and the maternal form [4x] P. pratense might indicate that the form originated as a result of self-pollination. On the other hand, similar structure of the conventional and C-band karyotypes of the two filial forms, where form A is clearly an allopolyploid, also indirectly points to hybrid origin of form B. Considering all the collected cytogenetic data, it can be stated that the two forms are probably alloplyploids. Similar structure of their band karyotypes results from serious changes in the structure of the parental genomes consisting in their unification which was caused by unequal crossing-over and gene conversion. The changes mainly referred to genome type C derived from the alpine cats tail grass and led to its assimilation to geneome type P from the timothy grass. Both examined forms of the timothy were fertile and created properly built, germinating caryopses. In breeding experiments it will be possible to test if they are characterised by the best cultivation features of the parental forms. 31 1 Department of Plant Breeding and Seed Science, Agricultural University of Cracow, Łobzowska 24, PL 31 140 Kraków, Poland 2 Alan Stewart, PGG Wrightson Seeds, PO Box 939, Christchurch, New Zealand, 3 Department of Genetics and Plant Breeding, University of Technology and Life Sciences, Al. Kaliskiego 7, PL 85 796 Bydgoszcz, Poland