WPŁYW KRIOPREZERWACJI NA ULTRASTRUKTURĘ KOMÓREK ROŚLINNYCH ORAZ ICH ZDOLNOŚĆ DO DALSZEGO ROZWOJU 1

Acta Sci. Pol., Biotechnologia 16 (1) 2017, 33-44 ISSN 1644065X (print) ISSN 20838654 (on-line) WPŁYW KRIOPREZERWACJI NA ULTRASTRUKTURĘ KOMÓREK ROŚLINNYCH ORAZ ICH ZDOLNOŚĆ DO DALSZEGO ROZWOJU 1 Dariusz Kulus 1, Anna Mikuła 2 1 Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy w Bydgoszczy 2 Ogród Botaniczny Centrum Zachowania Różnorodności Biologicznej PAN, Pracownia Biotechnologii Roślin Streszczenie. Krioprezerwacja jest obecnie najbardziej efektywną metodą ochrony roślinnych zasobów genowych. Technologia ta spotyka się z coraz większym zainteresowaniem zarówno laboratoriów badawczych, jak i komercyjnych. Wciąż jest to jednak młoda nauka, która wymaga jeszcze wielu badań. Jednym z najbardziej interesujących zagadnień jest wpływ krioprezerwacji na szeroko rozumianą stabilność materiału biologicznego. Ze względu na wysokie koszty i skomplikowane procedury analizy ultrastrukturalne przeprowadzone są rzadko. Dotychczasowe badania wskazują komórki merystematyczne jako najbardziej optymalne do przechowywania w ciekłym azocie. Komórki silniej zróżnicowane i zwakuolizowane na ogół nie przeżywają przechowywania w ciekłym azocie, chociaż czasem udaje się to w przypadku młodych części primordiów. Zwykle procedura krioprezerwacji nie wpływa na strukturę komórkową. Zdarza się jednak, że przedtraktowanie eksplantatów prowadzi do mniej lub bardziej odwracalnych zmian, które mogą wpływać na ich odpowiedź morfogenetyczną i/lub potencjał regeneracyjny. Słowa kluczowe: analiza mikroskopowa, organella komórkowe, regeneracja, stabilność WSTĘP Od około stu lat poszukuje się skutecznych metod ochrony roślinnych zasobów genowych. Tradycyjne metody ochrony in situ są jednak obciążone licznymi ograniczeniami, wynikającymi z czynników klimatycznych i ekologicznych [Kulus 2015]. Od lat 70. XX Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Adres do korespondencji Corresponding author: Dariusz Kulus, Katedra Roślin Ozdobnych i Warzywnych, Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy w Bydgoszczy, ul. Bernardyńska 6, 85-029 Bydgoszcz, dkulus@gmail.com

34 Dariusz Kulus, Anna Mikuła. wieku w produkcji i hodowli roślin coraz częściej wykorzystuje się techniki bazujące na kulturach tkankowych. Jednak warunki in vitro znacznie odbiegają od naturalnych i w związku z tym są źródłem stresu dla mikrosadzonek. W efekcie długotrwałe utrzymywanie roślin w szkle może doprowadzić do wystąpienia zmienności. W 1981 roku Larkin i Scowcroft nazwali zmienność występującą wśród roślin otrzymywanych in vitro zmiennością somaklonalną, a same rośliny somaklonami. Zmiany te mają zwykle charakter mutacyjny. Masters [1869] dokonał następującej klasyfikacji zmian anatomii/ morfologii organów roślinnych wywołanych przez mutacje: 1) łączenie się organów normalnie występujących oddzielnie; 2) rozdzielanie się organów (lub ich części) normalnie występujących razem; 3) zmiana miejsca położenia, czyli przemieszczenie (heterotaksja) poszczególnych organów bądź ich części; 4) zmiana liczby organów lub ich części; 5) zmiana normalnej formy organów (symetrii, kształtu, wielkości itd.). Przyjmuje się, że krioprezerwacja (przechowywanie tkanek w ciekłym azocie) eliminuje ryzyko ich wystąpienia, chociaż zmiany o charakterze genetycznym i/lub epigenetycznym, rzadziej fenotypowym, były również obserwowane [Kulus i Zalewska 2014]. Wpływ krioprezerwacji na stabilność materiału biologicznego nie został jak dotąd w pełni poznany, zwłaszcza na poziomie komórkowym [Kulus i Mikuła 2016]. Wynika to z faktu, że krioprezerwacja tkanek roślinnych jest młodą gałęzią nauki. Stąd więcej uwagi powinno poświęcić się kompleksowej analizie stabilności materiału biologicznego poddanego krioprezerwacji. Istnieje wiele typów markerów stabilności: molekularne (genetyczne, epigenetyczne, proteomiczne itd.), biochemiczne (chemotaksonomia, izoenzymy), histologiczne, fenotypowe itd. Na ich podstawie stabilność roślin można badać zarówno na poziomie całego organizmu, jak i na poziomie subkomórkowym. Jak do tej pory, markery molekularne były najczęściej wykorzystywane (tab. 1). Zastosowanie technik mikroskopowych oraz obserwacji histologicznych stosuje się rzadziej u roślin otrzymanych z eksplantatów przechowywanych w ciekłym azocie. Wiąże się to z wysokimi kosztami oraz złożoną i długotrwałą metodyką przygotowania preparatów. Obserwacje takie są jednak bardzo cenne w przypadku chimer roślin o niejednorodnej strukturze genetycznej, u których uszkodzenia komórek i reorganizacja warstw histogenowych prowadzą do pojawienia się zmienności [Fukai i in. 1994]. Ponadto analizy mikroskopowe dostarczają informacji na temat powstających kriouszkodzeń oraz ich wpływu na regenerację eksplantatów. Celem pracy było przedstawienie dotychczasowych informacji na temat wpływu krioprezerwacji na strukturę komórkową roślin wyższych oraz regenerację eksplantatów. Acta Sci. Pol.

Wpływ krioprezerwacji na ultrastrukturę komórek roślinnych... 35 Tabela 1. Zastosowanie różnych typów markerów w badaniu stabilności roślin poddanych krioprezerwacji Table 1. Application of various marker types to investigate cryopreserved plant species stability Gatunek Species molekularne molecular cytogenetyczne cytogenetic Zastosowane markery Applied markers histologiczne histological biochemiczne biochemical fenotypowe phenotypical Źródło Reference 1 2 3 4 5 6 7 Actinidia chinensis Xiao-Biao i in. 2006 Argyranthemum Yellow Empire Zhang i in. 2015 Bletilla striata Hirano i in. 2005 Carica papaya Chrysanthemum grandiflorum Kaity i in. 2008 Kaity i in. 2009, 2013 Martín i in. 2010, 2011 Wang i in. 2014 Jeon i in. 2015a,b Bi i in. 2016 Cocos nucifera Rival i in. 2010 Cyrtopodium hatschbachii Surenciski i in. 2007 Dendrobium Bobby Messina Antony i in. 2012 Antony i in. 2015 Dendrobium candidum Yin i Hong 2009 Dendrobium sonia-28 Poobathy i in. 2013 Dioscorea rotundata Mandal i in. 2008 Diospyros kaki Ai i Luo 2005 Fragaria ananasa Gentiana cruciata Hao i in. 2002 Medina i in. 2007 Mikuła i in. 2011a Mikuła i in. 2008 Gentiana kurroo Mikuła i in. 2011b Ginko biloba Popova i in. 2009 Biotechnologia 16 (1) 2017

36 Dariusz Kulus, Anna Mikuła. Tabela 1 cd. Table 1 cont. Gentiana tibetica 1 2 3 4 5 6 7 Mikuła i in. 2005 Mikuła i in. 2008 Grammatophyllum speciosum Sopalun i in. 2010 Hypericum perforatum Skyba i in. 2010 Indigofera tinctoria Nair i Reghunath 2009 Paeonia lactiflora Seo i in. 2007 Pinus nigra Salaj i in. 2011 Pinus pinaster Marum i in. 2007 Pinus sylvestris Häggman i in. 2007 Pistacia vera Akdemir i in. 2013 Oncidium hamana Miao i in. 2005 Oryza rufipogon Zeliang i in. 2010 Quercus suber Álvarez i in. 2007 Fernandes i in. 2008 Ribes spp. Johnston i in. 2009 Rubus grabowskii Castillo i in. 2010 Solanum tuberosum Zarghami i in. 2008 Theobroma cacao Adu-Gyamfi i in. 2016 Vanda coerulea Jitsopakul i in. 2009 Vanilla planifolia González-Arnao i in. 2009 Wasabia japonica Maki i in. 2015 marker użyty/marker used; marker nieużyty/marker not used Acta Sci. Pol.

Wpływ krioprezerwacji na ultrastrukturę komórek roślinnych... 37 Wpływ krioprezerwacji na strukturę komórkową Zdecydowana większość dostępnej literatury odnosząca się do badań z zakresu krioprezerwacji wskazuje, że największe szanse na przeżycie mrożenia mają małe, niezróżnicowane komórki merystematyczne lub embriogeniczne o niewielkich wakuolach [Steinmacher i in. 2007, Poobathy i in. 2013]. Większe i bardziej zróżnicowane komórki silniej narażone są na zniszczenia w wyniku mrożenia. U pąków wierzchołkowych Dianthus większość subapikalnej tkanki została zniszczona. Żywotne pozostały jedynie merystem oraz zawiązki liści [Kartha 1985]. Podobnie, w wierzchołkach pędów banana mrożenie przeżyły tylko merystematyczne komórki tuniki oraz primordiów [Helliot i in. 2002]. Obserwacje histologiczne Wanga i in. [2014] wykazały, że po krioprezerwacji żywotne były jedynie komórki warstw 13 u chryzantemy. Natomiast w przypadku badań Fukai i in. [1994] mrożenie przeżyła tylko warstwa L1 tuniki. Bardzo rzadko obserwuje się, aby mrożenie przeżywały też większe, bardziej zróżnicowane i silniej uwodnione komórki. Matsumoto [2001] porównał efektywność trzech technik krioprezerwacji wasabi (Eutrema japonicum) na poziomie zmian histologicznych. Zaobserwował on, że o ile technika witryfikacji (w połączeniu z kapsułkowaniem lub bez) zabezpieczyła niemal wszystkie komórki eksplantatu, to wśród eksplantatów mrożonych z wykorzystaniem kapsułkowania-dehydratacji obserwowano rozległe nekrozy z wyjątkiem ścisłego merystemu. W przypadku Cosmos atrosanguineus poza merystemem przeżyły jeszcze tylko komórki podstawy primordiów [Wilkinson i in. 2003]. Także Wang i in. [2014] obserwowali żywe komórki primordiów chryzantem odmian Japanese Red oraz Xizi Qiuzhuang. W sytuacji, gdy krioprezerwację przeżyje fragment blaszki liściowej, to może w tych miejscach dochodzić do różnicowania się kalusa i proliferacji pędów przybyszowych, co zaobserwowano na przykład u chryzantemy [Halmagyi i in. 2004]. Fang i Wetten [2011] opisali dwa rodzaje komórek po krioprezerwacji zarodków somatycznych Theobroma cacao. Pierwszy typ obejmował żywe komórki z nienaruszonymi jądrami komórkowymi, wyraźnie widoczną błoną komórkową, dużymi mitochondriami oraz siateczką endoplazmatycznego retikulum. Drugą grupę stanowiły martwe komórki, w których nie dało się zaobserwować żadnych organelli komórkowych. Analizy ultrastrukturalne wykazały deformacje oraz uszkodzenia komórek pojawiające się już na etapie prekultury potęgujące się wraz z każdym kolejnym etapem kriotraktowania. Także u chryzantemy samo przedtraktowanie pąków wierzchołkowych roztworem witryfikacyjnym (mieszanką krioprotektantów) wpłynęło na ich strukturę [Jeon i in. 2015b]. Według Fang i Wetten [2011] intensywna dehydratacja osmotyczna przyczynia się do fałdowania błon plazmalemmy. U Amarylis belladonna zaburzenia ultrastruktury zarodków były minimalne. Natomiast Sershen [2011] nie zaobserwował żadnych zmian w komórkach przedtraktowanych glicerolem, natomiast te, które odwadniano sacharozą, miały silniej rozwinięte grzebienie mitochondrailne oraz zagęszczoną macierz mitochondrialną. Plastydy po traktowaniu glicerolem zawierały więcej skrobi. Mikuła i in. [2005] zaobserwowali z kolei, że odwadnianie PEMs Gentiana tibetica powoduje zastąpienie pojedynczej, dużej wakuoli przez liczne mniejsze, zagęszczenie cytoplazmy, gromadzenie skrobi oraz fragmentację retikulum endoplazmatyczengo. Przedtraktowanie roztworem krioprotektantów (PVS) zaś prowadzi do degradacji skrobi, łączenia amyloplastów oraz obkurczenia jąder komórkowych. Zróżnicowane standardowo pod względem kształtu mitochondria po traktowaniu PVS przyjmują wyłącznie kształt sferyczny z niewieloma grzebieniami. Biotechnologia 16 (1) 2017

38 Dariusz Kulus, Anna Mikuła. Mrożenie oraz rozmrażanie powodowały także zmiany w strukturze kariolemmy, błonach mitochondrialnych oraz retikulum endoplazmatycznym. Zmiany te jednak miały charakter odwracalny i ustępowały po około dwóch dniach [Mikuła i in. 2005]. Stanowią one najprawdopodobniej odpowiedź eksplantatów na warunki prekultury (szczególnie stosowanego zwykle podwyższonego stężenia sacharozy) oraz przedtraktowania (dehydratacji). W badaniach Mikuły i in. [2005] już dwa dni po rozmrożeniu wakuole mrożonych komórek były odbudowane i w zasadzie nie dało się już obserwować różnic pomiędzy grupą komórek poddanych krioprezerwacji i kontrolnych (poza obecnością nekroz). Oceniając żywotność materiału roślinnego po krioprezerwacji, na ogół dokonuje się obserwacji w mikroskopie stereoskopowym i przyjmuje, że żywe tkanki zachowują pierwotny kolor [Dżugan 2006]. Czasem obserwuje się brązowienie żywych komórek spowodowane wydzielaniem związków fenolowych. Może to (choć nie musi) być letalne i wpływać na zmianę przeżywalności eksplantatów w trakcie prowadzenia kultury postmrożeniowej [Shibli 2000, Pawłowska 2008]. Dawniej parametr ten określano relatywnie szybko po rozmrożeniu. Jednakże badania przeprowadzone przez Mikułę i in. [2005, 2006] wskazują na konieczność odczekania co najmniej 57 dni przed dokonaniem wstępnej oceny. Przykładowo PEMs Gentiana cruciata i G. tibetica wykazywały bardzo wysoką przeżywalność bezpośrednio po rozmrożeniu i gwałtowne jej obniżenie po dwóch godzinach. Stąd efektywność krioprezewacji lepiej określać po dłuższym czasie prowadzenia kultury postmrożeniowej. Wpływ krioprezerwacji na efektywność regeneracyjną eksplantatów Fukai i in. [1994] zaobserwowali, że w trakcie regeneracji pędów przybyszowych u chryzantemy komórki warstwy L2 są zastępowane przez te z warstwy L1. Aż u 70% roślin odtworzonych po krioprezerwacji doprowadziło to do znacznej zmiany fenotypu kwiatostanów (z pomarańczowych stały się różowe) wskutek uszkodzenia komórek w warstwie L2 i intensywnych podziałów zachodzących w pierwszej warstwie tuniki. Dlatego ważne jest, aby w przypadku chimer w pełni zabezpieczyć przed destrukcyjnym wpływem ciekłego azotu wszystkie piętra inicjalne merystemu i nie dopuścić do regeneracji pędów za pomocą organogenezy przybyszowej. Odtwarzanie pędu powinno zachodzić na drodze klasycznego wzrostu i aktywności merystemu. W konsekwencji uszkodzeń mrożeniowych może dochodzić do regeneracji pędów w zwielokrotnionej liczbie z żywych obszarów merystemu apikalnego, podstawy zawiązków liści lub komórek kalusa [Fukai i Oe 1990, Wilkinson i in. 2003]. Zjawisko takie zaobserwowano na przykład u chryzantemy [Fukai i in. 1994, Zalewska i Kulus 2014], a także Dhalia pinnata [Liu i in. 2009]. W przypadku eksplantatów chryzantemy Jinba i Lishui Yeju, wykazujących rozległe nekrozy, pozostałe przy życiu komórki przechodziły w kulturze postmrożeniowej intensywne podziały, które prowadziły do tworzenia się pędów przybyszowych drogą pośrednią. Wang i in. [2014] otrzymali 48% pędów przybyszowych uzyskanych na drodze pośredniej przez kalus na pożywce MS 0,09 M sacharoza 1,0 mg dm -3 BA (4,44 μm) 0,1 mg dm -3 (0,54 μm) NAA. Zalewska i Kulus [2013] uzyskali u odmian Lady Orange i Lady Salmon od 13 do 4057% pędów wielokrotnych, przy czym ich udział zwiększał się wraz ze wzrostem stężenia sacharozy w pożywce w trakcie prekultury. Natomiast Fukai i in. [1991] otrzymali z przechowywanych w ciekłym azocie eksplantatów kilkunastu przedstawicieli rodzaju Chrysanthemum Acta Sci. Pol.

Wpływ krioprezerwacji na ultrastrukturę komórek roślinnych... 39 wzrost pojedynczych pędów z niewielkimi ilościami kalusa jedynie u ich podstawy (technika powolnego schładzania). Pobudzanie do rozwoju pąków bocznych in vitro jest korzystne, ponieważ pozwala na zwielokrotnienie w krótkim czasie uzyskiwanego w kulturze postmrożeniowej materiału biologicznego. Zgoła inaczej sytuacja przedstawia się w przypadku pędów przybyszowych. W tym przypadku należy odnieść się do doniesień Hejnowicza [2002]. Opisuje on, że części wierzchołka apikalnego powstałe w wyniku nacięć nie zrastają się, a raczej indywidualizują. Wynika stąd, że zniszczenie komórek w centrum inicjalnym powoduje odtworzenie jednego lub kilku centrów po bokach uszkodzonego wierzchołka. Efektem tego jest pojawianie się licznych, zdeformowanych pędów regenerujących z komórek eksplantatu. Z silnie uszkodzonych pąków z wyraźnie widocznymi nekrozami w obrębie merystemów, primordiów i młodocianych liści, gdzie żywe pozostają jedynie pojedyncze komórki, mogą tworzyć się nowe centra merystematyczne, które dają początek kalusowi i/lub zdeformowanym pędom. Ta sytuacja jest niepożądana może bowiem prowadzić na przykład do rozszczepienia komponentów chimer lub zmienności somaklonalnej. Ponadto struktury takie często nie nadają się do dalszej uprawy nawet in vitro. Prawdopodobną przyczyną zahamowania wzrostu takich pędów (także po kolejnych pasażach na pożywki wzbogacone cytokininami) są mutacje w obrębie tzw. house-keeping genes oraz naturalna selekcja roślin. Udział takich zdeformowanych struktur można ograniczyć, zastępując cytokininy w pożywce wzrostowej kwasem giberelinowym (GA 3 ) w stężeniu 0,05 mg dm -3 (0,14 μm), czego dowiodły badania przeprowadzone na chryzantemie Japanese Red [Wang i in. 2014]. Krioprezerwacja może wpływać na potencjał regeneracyjny eksplantatów. W przypadku Iris nigricans jedynie 10% zamrożonych zarodków wykazywało wtórny potencjał embriogeniczny [Shibli 2000]. Spotykane są w literaturze również doniesienia na temat wzrostu zdolności regeneracyjnych przechowywanych w ciekłym azocie tkanek. W przypadku Cyclamen persicum [Winkelmann i in. 2004], Gentiana cruciata oraz G. kurroo [Mikuła i in. 2011a,b] zaobserwowano wzrost potencjału embriogenicznego proembriogenicznych mas komórek (PEMs). Przedtraktowanie krioprotektantami oraz powolne schładzanie przyspieszyły regenerację embriogenicznych kultur Pinus sylvestris [Häggman i in. 1998] oraz Abies cephalonica [Aronen i in. 1999], natomiast zahamowały Abies nordmanniana [Norgaard i in. 1993]. Może to wynikać z krioselekcji, polegającej na eliminowaniu komórek silniej zwakuolizowanych z całej grupy komórek poddanych krioprezerwacji. Taki efekt był obserwowany w agregatach komórek embriogenicznej zawiesiny Gentiana tibetica [Mikuła i in. 2005]. Innym przykładem może być eliminowanie nieembriogenicznych komórek z embriogenicznych kultur roślin iglastych [Häggman i in. 1998]. Po krioprezerwacji żywotność utrzymywały jedynie komórki części embrionalnej zarodków somatycznych Pinus sylvestris, podczas gdy większość wydłużonych, zwakuolizowanych komórek suspensoria zamierała. Żywe komórki merystematyczne rozpoczynają intensywną proliferację tuż po rozmrożeniu materiału. Tkanki niemrożone z kolei regenerują wolniej ze względu na duży udział zróżnicowanych komórek, które wolniej przechodzą podziały [Cruz-Cruz i in. 2013]. Potencjał regeneracyjny i aktywność metaboliczna mogą być w przyszłości kontrolowane przez manipulację określonymi etapami procedury mrożenia. Mikuła i in. [2011b] zaobserwowali 922-krotny wzrost potencjału embriogenicznego Gentiana kurroo Biotechnologia 16 (1) 2017

40 Dariusz Kulus, Anna Mikuła. (w zależności od pochodzenia materiału) jedynie pod wpływem dehydratacji osmotycznej. Kolejne etapy (desykacja i mrożenie w LN) nie wpłynęły na zdolności regeneracyjne. PODSUMOWANIE Przyjmuje się, że krioprezerwacja nie wpływa na właściwości przechowywanego w ciekłym azocie materiału biologicznego. Potwierdzają to liczne przeprowadzone analizy molekularne oraz fenotypowe [Kulus i Zalewska 2014]. Spośród stosowanych dotychczas markerów stabilności najrzadziej wykorzystywane są analizy histologiczne. Ich rola jest jednak kluczowa w przypadku chimer roślinnych oraz przy próbie określenia typu odpowiedzi morfogenetycznej eksplantatów poddanych krioprzechowywaniu (pochodzenia pędów). Przeprowadzone do tej pory obserwacje mikroskopowe nie wskazują na występowanie znaczących zmian w ultrastrukturze komórki. Czasem obserwuje się okresowe zmiany, związane na przykład z gromadzeniem skrobi lub zmianami w błonach komórkowych. Zmiany te jednak zwykle mijają po kilku-kilkunastu dniach od odtajania. Natomiast rozległe nekrozy mogą prowadzić do zmiany typu odpowiedzi morfogenetycznej eksplantatu. PIŚMIENNICTWO Adu-Gyamfi R., Wetten A., Lopez C.M.R., 2016. Effect of cryopreservation and post-cryopreservation somatic embryogenesis on the epigenetic fidelity of cocoa (Theobroma cacao L.). Plos One, doi: 10.1371/journal.pone.0158857. Ai P., Luo Z., 2005. Cryopreservation of dormant buds and genetic stability analysis of regenerated plantlets in persimmon. Acta Hortic., 685, 8592. Akdemir H., Süzerer V., Tilkat E., Yildirim H., Onay A., Çiftçi Y.O., 2013. In vitro conservation and cryopreservation of mature pistachio (Pistacia vera L.) germplasm. J. Plant Biochem. Biotechnol., 22 (1), 4351. Álvarez R., Revilla M.A., Ordás R.J., 2007. Transgene stability in cryopreserved cork oak somatic embryos. Cryopreservation of Crop Species in Europe, Oviedo, 4647. Antony J.J.J., Poobathy R., Danial M., Sinniah U.R., Subramaniam S., 2012. Polymorphism analysis of cryopreserved Dendrobium Bobby Messina protocorm-like bodies (PLBs) using RAPD markers. Plant Omics, 5, 427431. Antony J.J.J., Wai L.K., Oyunbileg Y., Subramaniam S., 2015. Characterization of the second generation cryopreserved Dendrobium Bobby Messina using histological and RAPD analyses. Mongolian J. Biol. Sci., 13 (12), 1318. Aronen T.S., Krajnakova J., Haggman H., Ryynänen L., 1999. Genetic fidelity of cryopreserved embryonic cultures of open-pollinated Abies cephalonica. Plant Sci., 142, 163172. Bi W.-L., Pan C., Liu J., Wang Q-C., 2016. Greenhouse performance, genetic stability and biochemical compounds in Chrysanthemum morifolium Hangju plants regenerated from cryopreserved shoot tips. Acta Physiol. Plant., 38, 268. Castillo N.R.F., Bassil N.V., Wada S., Reed B.M., 2010. Genetic stability of cryopreserved shoot tips of Rubus germplasm. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 46, 246256. Cruz-Cruz C.A., González-Arnao M.T., Engelmann F. 2013. Biotechnology and conservation of plant biodiversity. Resour., 2, 7395. Acta Sci. Pol.

Wpływ krioprezerwacji na ultrastrukturę komórek roślinnych... 41 Dżugan M., 2006. Czynniki wpływające na stabilność zielonych barwników roślin. Zeszyty Naukowe Polskiego Towarzystwa Inżynierii Ekologicznej, 7, 2733. Fang J.-Y., Wetten A., 2011. Importance of structural integrity of somatic embryos for long-term cryopreservation of cocoa (Theobroma cacao L.) germplasm. Afr. J. Agric. Res., 6 (17), 3954 3961. Fernandes P., Rodriguez E., Pinto G., Roldan-Ruiz I., De Loose M., Santos C., 2008. Cryopreservation of Quercus suber somatic embryos by encapsulation-dehydration and evaluation of genetic stability. Tree Physiol., 28, 18411850. Fukai S., Goi M., Tanaka M., 1991. Cryopreservation of shoot tips of Chrysanthemum morifolium and related species native to Japan. Euphytica, 54, 201204. Fukai S., Goi M., Tanaka M., 1994. The chimeric structure of the apical dome of chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum (Ramat.) Kitam.) is affected by cryopreservation. Sci. Hortic., 57, 347351. Fukai S., Oe M., 1990. Morphological observations of chrysanthemum shoot tips cultured after cryoprotection and freezing. J. Jpn. Soc. Hortic. Sci., 59 (2), 383387. González-Arnao M.T., Durán-Sánchez B., Jiménez-Francisco B., Lázaro-Vallejo C.E., Valdés- Rodríguez S.E., Guerrero A., 2009. Cryopreservation and proteomic analysis of vanilla (V. planifolia A.) apices treated with osmoprotectants. I International Symposium on Cryopreservation in Horticultural Species. Acta Hortic., Leuven, 6772. Halmagyi A., Fischer-Kluver G., Mix-Wagner G., Schumacher H.M., 2004. Cryopreservation of Chrysanthemum morifolium (Dendranthema grandiflora Ramat.) using different approaches. Plant Cell Rep., 22, 371375. Hao Y.J, You C.X., Deng X.X., 2002. Analysis of ploidy and the patterns of amplified fragment length polymorphism and methylation sensitive amplified polymorphism in strawberry plants recovered from cryopreservation. CryoLett., 23 (1), 3746. Häggman H.M., Krajnakova J., Ryynänen L.A., Aronen T.S., Jokipii S., Vousku J., 2007. Cryopreservation of Scots pine. COST Eur. Coop. Sci. Technol., Oviedo, 32. Häggman H.M., Ryynänen L.A., Aronen T.S., Krajnakova J., 1998. Cryopreservation of embryogenic cultures of Scots pine. Plant Cell Tis. Org. Cult., 54 (1), 4553. Hejnowicz Z., 2002. Anatomia i histogeneza roślin naczyniowych. PWN, Warszawa, 509533. Helliot B., Madur D., Dirlewanger E., De Boucaud M.T., 2002. Evaluation of genetic stability in cryopreserved Prunus. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 38(5), 493500. Hirano T., Godo T., Mii M., Ishikawa K., 2005. Cryopreservation of immature seeds of Bletilla striata by vitrification. Plant Cell Rep., 23 (8), 534539. Jeon M.S., Naing A.H., Park K.I., Kim C.K., 2015b. The effect of antifreeze protein on the cryopreservation of chrysanthemums. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 123 (3), 665671. Jeon S.M., Arun M., Lee S.-Y., Kim C.K., 2015a. Application of encapsulation-vitrification in combination with air dehydration enhances cryotolerance of Chrysanthemum morifolium shoots tips. Sci. Hortic., 194, 9199. Jitsopakul N., Thammasiri K., Ishikawa K., 2009. Cryopreservation of Vanda coerulea protocormlike bodies by droplet-vitrification. 1st International Symposium, Cryopreservation in Horticultural Species, ISHS, Leuven, 92. Johnston J.W., Benson E.E., Harding K., 2009. Cryopreservation induces temporal DNA methylation epigenetic changes and differential transcriptional activity in Ribes germplasm. Plant Physiol. Biochem., 47 (2), 12331. Kaity A., Ashmore S.E., Drew R.A., 2009. Field performance evaluation and genetic integrity assessment of cryopreserved papaya clones. Plant Cell. Rep., 28 (9), 14211430. Kaity A., Ashmore S.E., Drew R.A., Dulloo M.E., 2008. Assessment of genetic and epigenetic changes following cryopreservation in papaya. Plant Cell Rep., 27 (9), 15291539. Biotechnologia 16 (1) 2017

42 Dariusz Kulus, Anna Mikuła. Kaity A., Drew R.A., Ashmore S.E., 2013. Genetic and epigenetic integrity assessment of acclimatised papaya plants regenerated directly from shoot-tips following short- and long-term cryopreservation. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 112 (1), 7586. Kartha K.K. 1985. Meristem culture and germplasm preservation. Cryopreservation of Plant Cells and Organs. CRC Press Inc., Boca Raton, 116134. Kulus D., Mikuła A., 2016. Krioprezerwacja w zabezpieczaniu stabilności i aktywności fizjologicznej komórek roślinnych. Scient. Pol. Biotechnol., 15 (4), 2738. Kulus D., Zalewska M., 2014. Cryopreservation as a tool used in long-term storage of ornamental species a review. Sci. Hortic., 168: 88107. Kulus D., 2015. Zjawisko erozji genetycznej jako zagrożenie dla biobezpieczeństwa współczesnego świata, Bezpieczeństwo współczesnego świata: Historia, wyzwania, konflikty zbrojne. Maiuscula, Poznań, 215225. Larkin P.J., Scowroft W.R., 1981. Somaclonal variation a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theor. Appl. Genet., 60: 197214. Liu Y.X., Liu Z.C., Lin T., Li T.F., Cheng F.D., Lee I., Luo L.J., 2009. Study on cryopreservation of shoot tips of chrysanthemum through vitrification. J. Plant Genet. Resour., 10 (2), 249254. Maki S., Hirai Y., Niino T., Matsumoto T., 2015. Assessment of molecular genetic stability between long-term cryopreserved and tissue cultured wasabi (Wasabia japonica) plants. CryoLett., 36 (5), 318324. Mandal B.B., Ahuja-Ghosh S., Srivastava P.S., 2008. Cryopreservation of Dioscorea rotundata poir.: a comparative study with two cryogenic procedures and assessment of true-to-type of regenerants by RAPD analysis. CryoLett., 29 (5), 399408. Martín C., Cervera M.T., González-Benito M.E., 2011. Genetic stability analysis of chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium Ramat) after different stages of an encapsulation-dehydration cryopreservation protocol. J. Plant Physiol., 168, 158166. Martín C., García-Ginés I., González-Benito M.E., 2010. Epigenetic analysis of chrysanthemum shoots regenerated from cryopreservaed apices, employment of CRED-RA technique. CryoLett., 31 (1), 7694. Marum L., Rocheta M., Oliveira M.M., Miguel C., 2007. Genetic fidelity of Pinus pinaster somatic embryogenic cultures following cryopreservation. COST Europ. Coop. Sci. Technol., Oviedo, 4849. Masters M.T., 1869. Vegetable teratology. An account of the principal deviations from the usual construction of plants. The Ray Society, Londyn, 17. Matsumoto T., 2001. Cryopreservation of in vitro-cultured meristems of wasabi. Cryopreservation of Tropical Plant Germplasm current research progress and applications. JIRCAS/IPGRI, Tsukuba, 212216. Medina J.J., Clavero-Ramírez I., González-Benito M.E., Gálvez-Farfán J., López-Aranda J.M., Soria C., 2007. Field performance characterization of strawberry (Fragaria ananassa Duch.) plants derived from cryopreserved apices. Sci. Hortic., 113, 2832. Miao N.-H., Kaneko Y., Sugawara Y., 2005. Ultrastructural implications of pretreatment for successful cryopreservation of Oncidium protocorm-like body. CryoLett., 26 (5), 333340. Mikuła A., Niedzielski M., Rybczyński J.J., 2006. The use of TTC reduction assay for assessment of Gentiana spp. cell suspension viability after cryopreservation. Acta Physiol. Plant., 28 (4), 315324. Mikuła A., Olas M., Śliwińska E., Rybczyński J.J., 2008. Cryopreservation by encapsulation of Gentiana spp cell suspensions maintains regrowth, embryogenic competence and DNA content. CryoLett., 29 (5), 409418. Mikuła A., Tomiczak K., Rybczyński J.J., 2011a. Cryopreservation enhances embryogenic capacity of Gentiana cruciata (L.) suspension culture and maintains (epi)genetic uniformity of regenerants. Plant Cell Rep. 30 (4), 565574. Acta Sci. Pol.

Wpływ krioprezerwacji na ultrastrukturę komórek roślinnych... 43 Mikuła A., Tomiczak K., Wójcik A., Rybczyński J.J., 2011b. Encapsulation-dehydration method elevates embryogenic abilities of Gentiana kurroo cell suspension and carrying on genetic stability of its regenerants after cryopreservation. I International Symposium on Cryopreservation in Horticultural Species. ISHS Acta Horticulturae, Leuven, 143152. Mikuła A., Tykarska T., Kuraś M., 2005. Ultrastructure of Gentiana tibetica proembryogenic cells before and after cooling treatments. CryoLett., 26 (6), 367378. Nair D.S., Reghunath B.R., 2009. Cryoconservation and regeneration of axillary shoot meristems of Indigofera tinctoria (L.) by encapsulation-dehydration technique. In Vitro Cell. Dev. Biol.- -Plant, 45, 565573. Norgaard J.V., Baldursson S., Krogstrup P., 1993. Genotypic differences in the ability of embryogenic Abies nordmanniana cultures to survive cryopreservation. Silvae Genetica, 42, 9397. Pawłowska B., 2008. Employment of encapsulation-dehydration method for liquid nitrogen cryopreservation of ornamental plant explants propagated in vitro. Folia Hortic., 20 (1), 6171. Poobathy R., Xavieer R., Sinniah U.R., Subramaniam S., 2013. Molecular stability of protocorm like bodies of Dendrobium sonia-28 after encapsulation-dehydration and vitrification. Australian J. Crop Sci., 7 (2), 189195. Popova E.V., Lee E-J., Wu C-H., Hahn E-J., Pack K-Y., 2009. A simple method for cryopreservation of Ginko biloba callus. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 97, 337343. Rival A., Turquay P., Samosir Y., Adkins S.W., 2010. Cryopreservation of coconut (Cocos nucifera L.) zygotic embryos does not induce morphological, cytological or molecular changes in recovered seedlings. Planta, 232, 435447. Salaj T., Matusikova I., Fraterova L., Pirselova B., Salaj J., 2011. Regrowth of embryogenic tissues of Pinus nigra following cryopreservation. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 106, 5561. Seo M.J., Shin J.H., Sohn J.K., 2007. Cryopreservation of dormant herbaceous peony (Paeonia lactiflora Pall.) shoot-tips by desiccation. CryoLett., 28 (3), 207213. Sershen N., Berjak P., Pammenter N.W., Wesley-Smith J., 2011. The effects of various parameters during processing for cryopreservation on the ultrastructure and viability of recalcitrant zygotic embryos of Amaryllis belladonna. Protoplasma, 249 (1), 155169. Shibli R.A., 2000. Cryopreservation of black iris (Iris nigricans) somatic embryos by encapsulation-dehydration. CryoLett., 21 (1), 3946. Skyba M., Urbanová M., Kapchina-Toteva V., Kosuth J., Harding K., Cellárová E., 2010. Physiological, biochemical and molecular characteristics of cryopreserved Hypericum perforatum L. shoot tips. CryoLett., 31 (3), 24960. Sopalun K., Kanchit K., Ishikawa K., 2010. Vitrification-based cryopreservation of Grammatophyllum speciosum protocorm. CryoLett., 31 (4), 347357. Steinmacher D.A., Saldanha C.W., Clement R.W., Guerra M.P., 2007. Cryopreservation of peach palm zygotic embryos. CryoLett., 28 (1), 1322. Surenciski M.R., Dematteis M., Flachsland E., 2007. Chromosome stability in cryopreserved germplasm of Cyrtopodium hatschbachii (Orchidaceae). Ann. Bot. Fennici, 44, 287292. Wang R.-R., Gao X.-X., Chen L., Huo L.-Q., Li M.-F., Wang Q.-C., 2014. Shoot recovery and genetic integrity of Chrysanthemum morifolium shoot tips following cryopreservation by dropletvitrification. Sci Hortic., 176, 330339. Wilkinson T., Wetten A., Prychid C., Fay M.F., 2003. Suitability of cryopreservation for the longterm storage of rare and endangered plant species: a case history of Cosmos atrosanguineus. Ann. Bot., 91, 6574. Winkelmann T., Mubmann V., Serek M., 2004. Cryopreservation of embryogenic suspension cultures of Cyclamen persicum Mill. Plant Cell Rep., 23, 18. Xiao-biao X., Cai Z., Gu Q., Zhang Q., 2006. Cell ultrastructure of kiwifruit (Actinidia chinensis) shoot tips during cryopreservation. Agric. Sci. China, 5 (8), 587590. Biotechnologia 16 (1) 2017

44 Dariusz Kulus, Anna Mikuła. Yin M., Hong S., 2009. Cryopreservation of Dendrobium candidum Wall. ex Lindl. protocorm-like bodies by encapsulation-vitrification. Plant Cell, Tiss. Org. Cult., 98 (2), 179185. Zalewska M., Kulus D., 2013. Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of chrysanthemum by encapsulation-dehydration. Folia Hortic., 25 (2), 133140. Zarghami R., Pirseyedi M., Hasrak S., Pakdaman Sardrood B., 2008. Evaluation of genetic stability in cryopreserved Solanum tuberosum. Afr. J. Biotech., 7 (16), 27982802. Zeliang P.K., Pattanayak A., Iangrai B., Khongwir E.A., Sarma B.K., 2010. Fertile plant regeneration from cryopreserved calli of Oryza rufipogon Griff. And assessment of variation in the progeny of regenerated plants. Plant Cell Rep., 29, 14231433. Zhang Z., Skjeseth G., Elameen A., Haugslien S., Sivertsen A., Clarke J.L., Wang Q.-C., Blystad D.R., 2015. Field performance evaluation and genetic integrity assessment in Argyranthemum Yellow Empire plants recovered from cryopreserved shoot tips. In Vitro Cell. Dev. Biol.- -Plant, 51 (5), 505513. THE IMPACT OF CRYOPRESERVATION ON THE ULTRASTRUCTURE OF PLANT CELLS AND THEIR ABILITY TO FURTHER DEVELOPMENT Abstract. Nowadays cryopreservation is considered to be the most efficient method for the protection of plant genetic resources. The technology is attracting more and more attention among both research and commercial laboratories worldwide. However, it is a relatively new technique, which still requires a lot of exploration. The influence of cryopreservation on the plant material genetic stability is one of the most interesting aspects. Due to the high costs and complexity of specimens preparation, the histological and ultrastructural observations are performed infrequently. The contemporary research suggest, that meristematic cells with dense cytoplasm and low level of hydration are the most suitable for cryopreservation. More differentiated cells with larger vacuoles do not survive the storage in liquid nitrogen, although sometimes it is possible for the young parts of leaf primordia. Usually cryopreservation does not alter the cell structure. It is observed occasionally, however, that the pretreatment and dehydration steps may cause some more or less reversible changes (e.g. starch accumulation), which can affect the explant morphogenetic response/potential. Key words: cell organelles, microscopic analysis, regeneration, SEM, TEM Zaakceptowano do druku Accepted for print: 20.04.2017 Do cytowania For citation: Kulus D., Mikuła A., 2017. Wpływ krioprezerwacji na ultrastrukturę komórek roślinnych oraz ich zdolność do dalszego rozwoju. Acta Sci. Pol. Biotechnol., 16 (1), 3344. Acta Sci. Pol.