Politechnika Częstochowska we współpracy z Uniwersytetem Lille 1 we Francji Streszczenie rozprawy doktorskiej Mgr inż. Agnieszki Rorat Assessment of the vermicomposting process applied to sewage sludge by monitoring of the compost quality and immune responses of three earthworm species: Eisenia fetida, Eisenia andrei and Dendrobaena veneta Ocena procesu wermikompostowania osadów ściekowych poprzez monitorowanie jakości produktu i odpowiedzi immunologicznej trzech gatunków dżdżownic kompostowych: Eisenia fetida, Eisenia andrei oraz Dendrobaena veneta Promotor pracy: Profesor Małgorzata Kacprzak Opiekun naukowy: Profesor Franck Vandenbulcke Promotor pomocniczy: Dr hab. inż. Krzysztof Fijałkowski
1. Wstęp Obecnie, gospodarka osadami ściekowymi stanowi ogromne wyzwanie w dziedzinie inżynierii środowiska. Kolejne dyrektywy unijne wprowadziły konieczność dostosowania polskiego prawa do norm europejskich oraz poszukiwania nowych, skutecznych rozwiązań w zakresie zagospodarowania tych odpadów. Oceniono, iż objętość produkowanego osadu ściekowego zwiększy się z 540292 Mg s.m./rok w 2013 do 642400 Mg s.m./rok w 2015 [1]. Zgodnie z danymi GUS, głównymi kierunkami zagospodarowania osadów ściekowych w 2013 były wciąż składowanie (19%), rolnictwo i rekultywacja (25%), spalanie (13%) i inne (43%). Nowe, innowacyjne strategie powinny przede wszystkim usprawniać istniejące technologie oczyszczania ścieków, ale też minimalizować ilość powstających osadów. Ze względu na implementację jednej z dyrektyw Unii Europejskiej, zakazującej składowanie osadów od 2016 roku, konieczne jest poszukiwanie nowych metod ich zagospodarowania. Wermikompostowanie to stosunkowo nowa eko-biotechnologia, wykorzystująca dżdżownice jako naturalne bioreaktory w procesie dekompozycji materii organicznej [2]. W Europie z powodzeniem stosuje się trzy gatunki tych bezkręgowców: Eisenia fetida, Eisenia andrei oraz Dendorbaena veneta, które będąc detrytusożercami w naturze, przyspieszają rozkład złożonych substancji organicznych i obieg materii organicznej. Pierścienice te pełnią istotną rolę organizmów modelowych w badaniach ekotoksykologicznych, biologicznych i genetycznych. Wybrane gatunki charakteryzują się dużą odpornością na zmieniające się warunki atmosferyczne i obecne w podłożu zanieczyszczenia, wysokim wskaźnikiem rozrodczości i niskim czasem koniecznym do osiągnięcia dojrzałości płciowej. Cechy te powodują, iż możliwym jest wprowadzenie dżdżownic do procesu kompostowania osadów ściekowych, których zagospodarowanie staje się wyzwaniem dla inżynierii i ochrony środowiska ze względu na konieczność spełnienia norm stawianych przez dyrektywy unijne. Ze względu na dużą zawartość szeregu zanieczyszczeń, w tym metali ciężkich, chemikaliów oraz mikroorganizmów patogennych, osady ściekowe nie mogą być bezpośrednio stosowane w rolnictwie. Wermikompostowanie, jako niedroga i skuteczna technika biodegradacji odpadów prowadzi do powstania kompostu o wysokiej jakości, jednak duża zawartość zanieczyszczeń substratu stanowi problem z punktu widzenia ekotoksykologii. Wybrane parametry fizyczno-chemiczne służą ocenie jakości uzyskanego produktu, podczas gdy biologiczne parametry układu odpornościowego dżdżownic mogą posłużyć jako narzędzia biomonitorowania procesu. 2
2. Hipotezy A) Modyfikacje procesu wermikompostowania wpływają na jakość uzyskanego produktu W ninijeszej pracy uwględniono parametry biotyczne i abiotyczne, które mogą wpływać na jakość produktu uzyskanego w procesie wermikompostowania. W serii eksperymentów zastosowano różne gatunki dżdżownic kompostowych (Eisenia fetida, Eisenia andrei oraz Dendrobaena veneta) w różnych gęstościach hodowlanych, substrat (osady ściekowe) pochodzące z różnych oczyszczalni ścieków na terenie Polski oraz Francji charakteryzujące się różną zawartością metali ciężkich, wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych oraz różnymi właściwościami fizyczno-chemicznymi. Zaproponowano kilka strategii procesu z wykorzystaniem różnych substancji jako materiałów strukturotwórczych. B) Jakość mieszaniny kompostowej wpływa na układ immunologiczny dżdżownic Zanieczyszczenia obecne w osadach ściekowych, takie jak metale ciężkie oraz wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne mogą wpływać na układ immunologiczny dżdżownic kompostowych na poziomie tkankowym, komórkowym oraz transkrypcji genów. Poszczególne parametry mogą zostać wykorzystane w procesie jako biomarkery stanu fizjologicznego dżdżownic. C) Dżdżownice kompostowe wpływają na jakość i ilość zanieczyszczeń w mieszaninie kompostowej 3. Cel pracy A) Cel główny: Określenie wpływu dżdżownic gatunku Eisenia fetida, Eisenia andrei oraz Dendrobaena veneta na jakość produktu powstałego w procesie wermikompostowania osadów ściekowych B) Cel naukowy: Zbadanie molekularnych i immunologicznych mechanizmów zaangażowanych w interakcje między dżdżownicami a zanieczyszczeniami obecnymi w osadach ściekowych C) Cel utylitarny: Opracowanie technologii połączonego procesu kompostowania wermikompostowania osadów ściekowych z uwzględnieniem parametrów fizycznochemicznych i biologicznych limitujących prawidłowy przebieg procesu 3
4. Część badawcza A) Detekcja mikroorganizmów w osadach ściekowych metodą real-time PCR. Spośród ponad tysiąca różnych gatunków bakterii, znajdujących się w 1 g gleby, mniej niż 1% może być hodowanych metodami tradycyjnymi. Metody te są limitowane nie tylko odpowiednim składem pożywki, ale również koniecznością odtworzenia warunków naturalnych. Gatunki szybciej rosnące lub szczepy mikroorganizmów lepiej zaadaptowane do zadanych warunków hodowli mogą zaburzyć istniejący obraz składu mikrobiologicznego. Metody tradycyjne oparte na technikach hodowlanych lub mikroskopijnych, pozwoliły na sklasyfikowanie wielu organizmów obecnych w ściekach i osadach ściekowych. Mimo tego, wciąż pozostaje wiele niesklasyfikowanych gatunków i powstają nowe szczepy gatunków już istniejących. Jedną z metod biologii molekularnej, omijającą konieczność hodowli mikrobiologicznej, jest real-time PCR. Jej ogromną zaletą jest możliwość izolacji DNA bezpośrednio ze środowiska [3], co zapewnia analizę w naturalnych warunkach. Wysoce precyzyjna metoda real-time PCR stanowi obiecujące narzędzie biologii molekularnej, dzięki któremu możliwa jest szybka i dokładna diagnostyka mikrobiologiczna Celem badań było zoptymalizowanie metody real-time PCR jako narzędzia pozwalającego na monitorowanie wybranych patogenów w procesie technologicznym oczyszczania ścieków. W pracy uwzględniono zarówno gatunki uważane a organizmy wskaźnikowe (jak Escherichia coli) oraz poszczególne organizmy patogenne, takie jak Escherichia coli O157:H7. Ponadto, w celu wyeliminowania problemu fałszywie dodatnich wyników, wynikającego z izolacji materiału genetycznego z żywych i martwych komórek, zastosowano barwnik EMA (monazydek bromku etydyny). Dwa artykuły stanowią podrozdziały pracy: a) Fijałkowski F., Kacprzak M., Rorat A. 2014. Occurrence changes of Escherichia coli (including O157:H7 serotype) in wastewater and sewage sludge by quantitation method of (EMA) Real Time PCR. Desalination and Water Treatment.(52: 46-52) b) Kacprzak M., Fijałkowski K, Grobelak A., Rosikoń K., Rorat A. 2014. Escherichia coli and Salmonella spp. early diagnosis and seasonal monitoring in the sewage treatment process by the EMA-qPCR method. Polish Journal of Microbiology (2:143-148) 4
B) Wplyw zanieczyszczeń zawartych w osadach ściekowych na układ odpornościowy dżdżownic kompostowych Wiele zanieczyszczeń znajdujących się w glebie może wpływać na funkcjonowanie całych ekosystemów, a w konsekwencji stanowić zagrożenie dla ludzkiego zdrowia. W związku z rosnącym rozwojem cywilizacyjnym, poziom stężenia metali ciężkich, pestycydów i antybiotyków w glebie ciągle rośnie. Spośród organizmów żyjących w glebie, dżdżownice uważane są za organizmy modelowe w badaniach ekotoksykologicznych, fizjologicznych i genetycznych ze względu na krótki cykl życiowy i szeroki zakres tolerancji w stosunku do zmieniających się warunków. Biomarkery, czyli indykatory stresu wywołanego u dżdżownic, mogą posłużyć jako wskaźniki dysfunkcji całych ekosystemów. Spośród wielu dobrze poznanych gatunków dżdżownic, w pracy skupiono szczególną uwagę nad trzema gatunkami kompostowców stosowanych z powodzeniem w Europie: Eisenia fetida, Eisenia andrei i Dendrobaena veneta. Gatunki te wykazują umiejętność przetwarzania materii organicznej w cenny produkt, wemikompost, mogący posłużyć jako nawóz. Substratami w reakcji wermikompostowania mogą być nie tylko odpady komunalne, ale też osady ściekowe. Ze względu na dużą zawartość szeregu zanieczyszczeń, w tym metali ciężkich, wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych czy mikroorganizmów, koniecznym jest biomonitorowanie procesu poprzez określenie wpływu wymienionych zanieczyszczeń na poszczególne parametry układu odpornościowego dżdżownic. Poszczególne biomarkery reakcji odpornościowej u dżdżownic mogą posłużyć jako bioindykatory dysfunkcji ekosystemów oraz jako narzędzia do biomonitorowania procesu wermikompostowania. Układ odpornościowy dżdżownic opiera się na aktywności komórek immunologicznych (celomocytów), które podzielone są na dwie grupy. Amebocyty, które wykazują aktywność fagocytarną, wykryte zostały u wszystkich poznanych gatunków, podczas gdy obecność autofluorescencyjnych eleocytów jest charakterystyczna dla wybranych gatunków. Źródłem wspomnianej fluorescencji jest częściowo ryboflawina, zaangażowana w procesy odpornościowe. Liczba komórek odpornościowych, zawartość ryboflawiny oraz zmiany ekspresji poszczególnych genów zaangażowanych w reakcję stresową ulega zmianom pod wpływem zanieczyszczeń obecnych w substracie [4, 5]. W pracy odnaleziono specyficzne biomarkery umożliwiające przyżyciową identyfikację podobnych morfologicznie gatunków, określono wpływ metali ciężkich na przeżywalność, rozrodczość, poszczególne parametry układu odpornościowego u dżdżownic oraz ekspresję genu metaliotioneiny. Uzyskane wyniki pozwoliły na stworzenie profilu odpowiedzi 5
immunologicznej dżdżownic kompostowych w zetknięciu z zanieczyszczeniami zawartymi w osadach ściekowych i zostały opisane w kolejnych artykułach stanowiących podrozdziały pracy: a) Rorat A, Kachamakova-Trojanowska N, Jozkowicz A, Kruk J, Cocquerelle C, Vandenbulcke F, Santocki M, Plytycz B. 2014. Coelomocyte-derived fluorescence and DNA markers of composting earthworm species. Journal of experimental zoology Part A, Ecological genetics and physiology 321:28-40 b) Homa J., Rorat A., Kruk J., Cocquerelle C., Plytycz B., Vandenbulcke F., 2015. Dermal exposure of Eisenia andrei earthworms: Effects of heavy metals on metallothionein and phytochelatin synthase gene expressions in coelomocytes. Environmental Toxicology and Chemistry 34, 1397-1404 c) Rorat A, Kacprzak M, Vandenbulcke F, Płytycz B. 2013. Soil amendment with municipal sewage sludge affects the immune system of earthworms Dendrobaena veneta. Applied Soil Ecology 64:237-244. C) Wermikompostowanie Charles Darwin okrzyknął dżdżownice w 1881 roku inżynieriami ziemi, jednocześnie zwracając po raz pierwszy uwagę naukowców na te bezkręgowce. Prawie sto lat później, doceniono wysoki potencjał dżdżownic kompostowych w procesie przetwarzania materii organicznej w wermikompost. Kompostowanie i wermikompostowanie to metody biologicznego rozkładu odpadów w obecności tlenu, które doskonale wpasowują się w strategię recyklingu wartościowych makro i mikroskładników z osadów ściekowych. Wermikompostowanie to stosunkowa nowa, niedroga i przyjazna środowisku biotechnologia, w której dżdżownice zatrudnione są jako naturalne bioreaktory w procesie dekompozycji materii organicznej. Spośród wielu zalet metody wyróżnić należy redukcję objętości, zwiększenie biodostępności związków odżywczych dla roślin, redukcję ilorazu C/N oraz akumulację niektórych niebezpiecznych zanieczyszczeń. Pierwsze próby wykorzystania dżdżownic gatunku Eisenia fetida do biokonwersji odpadów podjęła grupa amerykańskich naukowców w 1977 roku, a niedługo później jako substrat w procesie zastosowano z powodzeniem osady ściekowe [6, 7]. W skład rozdziału wchodzą trzy artykuły naukowe opisujące serię doświadczeń mających na celu opracowanie propozycji rozwiązania technologicznego poprzez określenie modyfikacji procesu wermikompostowania wpływających na jakość uzyskanego produktu: 6
a) Rorat A., Suleiman S., Grobelak A., Grosser A., Vandenbulcke F., Plytycz B., Kacprzak M. Mutual interactions between sewage sludge-amended soil and earthworms comparison between Eisenia fetida and Eisenia andrei composting species. Environmental Science and Pollution Research. In press b) Suleiman H., Rorat A., Grobelak A., Grosser A., Milczarek M., Plytycz B., Kacprzak M., Vandenbulcke F., Determining the performance of vermicomposting process according to sewage sludge characteristics and earthworm species Submitted c) Rorat A., Włóka D.,Grobelak A., Grosser A., Sosnecka A., Milczarek M., Vandenbulcke F., Kacprzak M. Vermiremediation of PAHs and heavy metals in sewage sludge composting proces. Submitted 5. Wnioski a) Modyfikacje procesu wermikompostowania: różne gatunki dżdżownic, czas kompostowania, gęstość hodowli dżdżownic, różne materiały strukturotwórcze, różne czynniki biotyczne i abiotyczne, wpływają na jakość uzyskanego produktu. b) Poszczególne fizyczne i chemiczne parametry kompostu determinują odpowiedź immunologiczną dżdżownic c) Dżdżownice przyspieszają rozkład wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych i akumulują niektóre metale ciężkie 7
6. Literatura 1. Bień, J., et al., Kierunki zagospodarowania osadów w Polsce po roku 2013. Inżynieria i Ochrona Środowiska, 2011. 14: p. 375-384. 2. Wang, L., Y.-T. Hung, and K. Li, Vermicomposting Process, in Biological Treatment Processes, L. Wang, N. Pereira, and Y.-T. Hung, Editors. 2009, Humana Press. p. 715-732. 3. Shannon, K.E., et al., Application of real-time quantitative PCR for the detection of selected bacterial pathogens during municipal wastewater treatment. Sci Total Environ, 2007. 382(1): p. 121-9. 4. Homa, J., et al., Metal-specific effects on metallothionein gene induction and riboflavin content in coelomocytes of Allolobophora chlorotica. Ecotoxicol Environ Saf, 2010. 73(8): p. 1937-43. 5. Plytycz, B., et al., Riboflavin content of coelomocytes in earthworm (Dendrodrilus rubidus) field populations as a molecular biomarker of soil metal pollution. Environ Pollut, 2009. 157(11): p. 3042-50. 6. Mitchell, M.J., et al., Conversion of sludges into topsoils by earthworms. Compost Sci, 1977. 18(4): p. 28-32. 7. Mitchell, M.J., S.G. Hornor, and B.I. Abrams, Decomposition of Sewage Sludge in Drying Beds and the Potential Role of the Earthworm, Eisenia foetida1. J. Environ. Qual., 1980. 9(3): p. 373-378. 8