Wydział Farmaceutyczny Uniwersytet Medyczny w Łodzi Prof. dr hab. n. farm. Elżbieta Budzisz (elzbieta.budzisz@umed.lodz.pl) Łódź, dn. 02.11.2016 r. RECENZJA ROZPRAWY DOKTORSKIEJ zatytułowanej Synteza, właściwości fizykochemiczne i aktywność biologiczna fosfinowych pochodnych antybiotyków chinolonowych i ich związków kompleksowych złożonej przez mgr Aleksandrę Bykowską Wysokiej Radzie Wydziału Chemii Uniwersytetu Wrocławskiego w celu uzyskania stopnia naukowego doktora nauk chemicznych. Dysertacja obejmuje badania dotyczące poszukiwania związków o aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwnowotworowej. Praca ta wpisuje się w badania od wielu lat prowadzone przez promotora pracy prof. dr hab. Małgorzatę Jeżowską-Bojczuk, która zajmuje się syntezą i właściwościami biologicznymi związków kompleksowych. Promotorem pomocniczym jest Pan dr hab. Radosław Starosta. Praca obejmuje niezwykle aktualną tematykę badawczą dotyczącą poszukiwania związków o aktywności przeciwbakteryjnej i cytotoksycznej. Współczesna medycyna boryka się z poważnymi problemami jakimi są zakażenia bakteryjne, zakażenia śródszpitalne i lekooporność. Ciągle pojawiające się nowe patogeny a także szybko pojawiająca się lekooporność powoduje, że walka z nimi stanowi wyzwanie dla medycyny naszych czasów. Pani Magister zaproponowała i konsekwentnie zrealizowała pomysł polegający na modyfikacji dobrze znanych leków ugrupowaniem fosfinowym i jego analogami.
Praca napisana jest zgodnie z panującymi wymogami stawianymi pracom doktorskim. Zawiera typowe rozdziały: Wstęp (str. 13-54), Cel pracy (str. 55-56), Materiały i metody eksperymentalne (str. 57-82), Wyniki i dyskusję (str. 83-159), Podsumowanie (str. 60) oraz rozdział Najważniejsze osiągnięcia (str. 167-170). Dodatkowo praca poprzedzona jest streszczeniem w języku polskim i angielskim oraz spisem prac i wystąpień konferencyjnych, spisem literatury oraz źródeł finansowania. W części zatytułowanej Wstęp Doktorantka w bardzo zwięzły ale jednocześnie przejrzysty sposób opisała rolę wybranych antybiotyków chinolonowych we współczesnej farmacji, oraz wybranych jonów metali w biologii i medycynie. Ważnym rozdziałem w tej części jest mechanizm działania leków chinolonowych oraz zagadnień lekooporności. Jak wynika z przedstawionego w sposób syntetyczny wstępu literaturowego tematyka badawcza Pani Magister Bykowskiej jest niezwykle aktualna i ważna dla rozwoju prezentowanej przez Doktorantkę dziedziny. Pani Magister cytuje w pracy 274 pozycje literaturowe co wskazuje na kompleksowe i dogłębne podejście do tematu realizowanego w ramach niniejszej rozprawy. Po przedstawieniu danych literaturowych dotyczących zagadnienia pracy doktorskiej Pani Magister sformułowała w sposób jednoznaczny cele swej pracy doktorskiej ujmując je w sposób syntetyczny. Doktorantka postawiła sobie ambitny cel dotyczący zbadania wpływu zmian strukturalnych dwóch znanych antybiotyków: ciprofloksacyny i norfloksacyny na aktywność przeciwbakteryjną i przeciwnowotworową. Poszukiwanie związków o aktywności biologicznej może biec dwoma torami. Pierwszy polega na syntezie nowych, nieopisanych z literaturze związków i badanie ich aktywności biologicznych lub modyfikacji związków o udowodnionej aktywności poprzez wprowadzenie farmakoforów poprawiających ich właściwości. Pani Magister wybrała tę drugą metodę wprowadzając do znanych antybiotyków podstawnik fosfinowy. Doskonałym pomysłem było wprowadzenie do cząsteczki antybiotyku funkcji fosfinowej ze względu na udowodnione i ciągle badane właściwości biologiczne takich połączeń. Związki fosfinowe wprowadzone do cząsteczki znanych i stosowanych antybiotyków mogą wpływać na zmianę ich profilu działania. Spośród licznej grupy połączeń zawierających wiązanie C-P, wiele z nich znalazło zastosowanie jako regulatory wzrostu, inhibitory procesów metabolicznych oraz związki o działaniu przeciwbakteryjnym lub przeciwnowotworowym. Zakres badań obejmował również zablokowanie donorowej pary elektronowej jon fosforu jonami tlenu, siarki i selenu. Dotychczas modyfikacje tego typu nie były opisane. Modyfikowane cząsteczki antybiotyków chinolonowych posłużyły jako ligandy do syntezy
związków kompleksowych jonów miedzi(i) i miedzi(ii). Ciekawym pomysłem okazało się otrzymanie mieszanych związków kompleksowych wprowadzając dodatkowy ligand: 1,10-fenantrolinę lub 2,9-dimetylo-1,10-fenantrolonę. Związki tego typu mogą wykazywać odmienną aktywność niż związki kompleksowe zawierające tylko jeden rodzaj ligandu. Struktury wszystkich nowo zsyntezowanych połączeń ustalono w oparciu o metody fizykochemiczne w tym spektroskopowe. Kolejnym zadaniem badawczym była ocena właściwości biologicznych: przeciwbakteryjnych, przeciwnowotworowych, oddziaływania z biomolekułami czy indukcji apoptozy. Pani Magister dokonała również prezentacji z podziałem na badania, które osobiście przeprowadziła oraz badania, które zostały wykonane w ramach współpracy z innymi ośrodkami. W części zatytułowanej Materiały i metody eksperymentalne znajduje się opis otrzymanych związków organicznych i wybranych związków kompleksowych z dokładnym opisem parametrów spektroskopowych. Doktorantka zsyntezowała 8 pochodnych antybiotyków fluorochinolonowych II generacji, były to pochodne fosfinowe ich tlenki, siarczki oraz selenki oznakowane odpowiednio CPc, PNr, i odpowiednio SCPc, SCPC, SeCPc, OPNr, SPNr, SePNr co w znakomity sposób ułatwiło śledzenie poszczególnych etapów, którym poddano związki. Najważniejszą część rozprawy doktorskiej stanowi rozdział badań zatytułowany Wyniki i dyskusja, w którym Doktorantka przedstawiła wszystkie etapy pracy eksperymentalnej z dyskusją dotyczącą struktur i aktywnością biologiczną. Pochodne ciprofloksacyny dla których uzyskano odpowiednie kryształy, oznaczono za pomocą metod krystalograficznych. Pani Magister przeprowadziła badanie dotyczące aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwnowotworowej na wybranych liniach komórkowych. Najbardziej aktywna na wybrane szczepy bakteryjne była fosfinowa pochodna ciprofloksacyny, chociaż wszystkie związki wykazywały aktywność przeciwbakteryjną. W badaniach dotyczących aktywności przeciwnowotworowej najaktywniejsze okazały się związki kompleksowe, które kierowały komórki na drogę apoptozy, generując reaktywne formy tlenu. Ponadto związki kompleksowe były zdolne do uszkadzania DNA a równocześnie interkalowania pomiędzy komplementarne pary zasad. Udowodniono ponadto, że wszystkie związki zdolne są do oddziaływania z HSA, nie naruszając jednocześnie struktury tego białka. Na podstawie wyników obszernych badań Doktorantka sformułowała poprawne wnioski podsumowujące najważniejsze osiągnięcia, świadczące o innowacyjności badań, kompetencji Doktorantki oraz umiejętności rozwiązywaniu trudnych problemów badawczych.
Rozprawa napisana jest bardzo ładnym językiem z dbałością o poprawność merytoryczną prowadzonych eksperymentów i styl. Na zakończenie dysertacji umieszczone są odbitki prac wchodzących w skład rozprawy doktorskiej. Podjęcie przez Doktorantkę niniejszego tematu badawczego uważam za niezwykle ważne z punktu widzenia rozwoju nauki, gdzie od wielu lat zmagamy się z ciągle pojawiającymi się zakażeniami nowymi patogenami czy lekoopornością. Magister Bykowska jest współautorką 7 prac oryginalnych publikacji, w których w trzech jest pierwszym autorem a w pozostałych drugim, trzecim lub czwartym autorem. Łączny współczynnik oddziaływania, impact factor, prac wynosi IF=17.128 a dla prac obejmujących tematykę rozprawy IF=8,674. Ponadto Doktorantka jest współautorką dziesięciu doniesień zjazdowych na konferencjach krajowych i zagranicznych w postaci posterów lub prezentacji ustnych. Ważną częścią wskazującą na dojrzałość naukową Pani Magister jest indeks Hirscha, który wynosi 3 według bazy web of science a indeks cytowań 38. Kolejna praca obejmująca materiał z Doktoratu oznaczona jest jako w przygotowaniu. Praca Doktorska realizowana przez Panią Magister wymagała dobrego warsztatu naukowego, gdyż obejmowała dwa nurty badawcze: część chemiczną jak również biologiczną. Doktorantka musiała więc wykazać się nie tylko dobrymi podstawami z zakresu metod syntetycznych, spektroskopowych i analitycznych ale również dobrym przygotowaniem do prowadzenia eksperymentów biologicznych. Z uwagi na moją funkcję jako recenzenta muszę zwrócić Autorce uwagę na drobne błędy: Str. 84 Doktorantka podała, że dla wszystkich otrzymanych związków, struktury ustalono w oparciu o metody dyfrakcyjne a z części eksperymentalnej wynika, że tylko dla 6 Str. 69 i 77 wartość analizy pierwiastkowej odbiega od przyjętej 0,3%. Błędy te jednak nie wpływają na efekt merytoryczny dysertacji. Podsumowując po zapoznaniu się z przedstawioną mi do recenzji rozprawą doktorską stwierdzam, że Autorka wykazała się bardzo dobrą znajomością tematyki i umiejętnością posługiwania się nowoczesnymi narzędziami analitycznymi, spektroskopowymi i biologicznymi potrzebnymi do zrealizowania niniejszej pracy. Pani Magister przedstawiła obszerny i solidny materiał doświadczalny. Reasumując, stwierdzam, że przedstawiona do recenzji rozprawa doktorska w pełni spełnia wymagania stawiane rozprawom doktorskim zawarte w art. 13 Ustawy z dnia 14.03.2003 r. (Dz.U. 2003 r. numer 65, poz. 595 z późniejszymi zmianami) o tytułach
i stopniach naukowych i wnoszę do Wysokiej Rady Wydziału Chemii Uniwersytetu Wrocławskiego o dopuszczenie mgr Aleksandrę Bykowską do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Wniosek o wyróżnienie dysertacji znajduje się w osobnym dokumencie. Z wyrazami szacunku Prof. dr hab. Elżbieta Budzisz Wydział Farmaceutyczny Uniwersytet Medyczny w Łodzi 90-151 Łódź ul. Muszyńskiego 1 tel. (042) 272 55 95 e-mail: elzbieta.budzisz@umed.lodz.pl