Genotypy i antybiotykooporność izolatów Staphylococcus aureus wyosobnionych od świń, kur oraz z mięsa wieprzowego i drobiowego

UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU WYDZIAŁ MEDYCYNY WETERYNARYJNEJ Mgr inż. Paweł Krupa Genotypy i antybiotykooporność izolatów Staphylococcus aureus wyosobnionych od świń, kur oraz z mięsa wieprzowego i drobiowego Praca doktorska wykonana pod kierunkiem: dr hab. Jarosława Bystronia, prof. nadzw. w Katedrze Higieny Żywności i Ochrony Zdrowia Konsumenta Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu Wrocław 2015

STRESZCZENIE Staphylococcus aureus jest szeroko rozpowszechnionym w przyrodzie, oportunistycznym patogenem zdolnym do wywoływania poważnych zakażeń u ludzi i zwierząt. Antybiotykooporność S. aureus stanowi coraz istotniejszy problem w ochronie zdrowia publicznego. Do niedawna występowanie szczepów S. aureus niewrażliwych na antybiotyki β-laktamowe, będącymi lekami z wyboru stosowanymi w leczeniu infekcji gronkowcowych, ograniczało się do środowiska opieki zdrowotnej (ang. healthcare-associated methicillinresistant S. aureus, HA-MRSA) oraz środowiska pozaszpitalnego (ang. communityassociated methicillin-resistant S. aureus, CA-MRSA). W ostatnim czasie odkryto nowy rezerwuar MRSA, którym są zwierzęta gospodarskie (ang. livestock-associated methicillinresistant S. aureus, LA-MRSA). Kolonizacja zwierząt szczepami S. aureus, wykazującymi oporność na β-laktamy, stanowi niebezpieczeństwo dla zdrowia publicznego, wynikające z możliwości ich transferu na ludzi w następstwie kontaktu ze zwierzętami lub poprzez żywność pochodzenia zwierzęcego. W Polsce dane na temat częstości występowania i zróżnicowania genetycznego MRSA, BORSA (ang. borderline oxacillin-resistant S. aureus) i MSSA (ang. methicillin-susceptible S. aureus) u zwierząt rzeźnych oraz w żywności pochodzenia zwierzęcego są mocno ograniczone. W ramach niniejszej pracy doktorskiej przebadano genotypy i oporność na oksacylinę 420 izolatów S. aureus od świń (l = 203) i z wieprzowiny (l = 217) oraz 263 od kur (l = 138) i z mięsa drobiowego (l = 125). Spośród 18 wykrytych typów spa S. aureus od świń genotypy t011, t021, t034, t091, t318, t337 i t1334 występowały najczęściej. Z kolei wśród 30 zidentyfikowanych spa izolatów z wieprzowiny dominowały genotypy t084, t091, t499, t4309, t12954 i t13074. Jedynie pięć genotypów S. aureus, tj. t034, t084, t091, t337 i t4309, wyizolowanych z wymazów równocześnie stwierdzono w żywności, przy czym tylko genotyp t091 występował z wysoką częstotliwością w obu populacjach gronkowców. Pozostałe typy konsekwentnie przeważały u świń (t034, t337) lub w próbkach mięsa (t084, t4309). Wyizolowane od świń S. aureus zgrupowano w kompleksy klonalne MLST CC7, CC9, CC15, CC30 i CC398, natomiast z mięsa w CC1, CC7 i CC15. Występowania S. aureus t091 zaliczanego do CC7 u tych zwierząt nie odnotowano wcześniej. Trzydzieści sześć izolatów S. aureus od świń zaklasyfikowano jako MRSA. Wszystkie izolaty należały do jednego typu spa t011 oraz posiadały V typ kasety SCCmec. Nie stwierdzono obecności MRSA w próbkach wieprzowiny. Fenotyp BORSA wykazywało 14% izolatów S. aureus od trzody chlewnej 9

i 10% izolatów z wieprzowiny. Spa t034, należący do CC398, dominował wśród BORSA od trzody chlewnej, natomiast t091 (CC7) wśród BORSA pozyskanych z mięsa. Izolaty S. aureus pozyskane od kur i z mięsa drobiowego zaklasyfikowano do 15 różnych typów spa. Spośród 5 wykrytych typów spa S. aureus od kur genotypy t002, t3478 i t13620 występowały najczęściej. Izolaty z mięsa zaklasyfikowano do 14 typów spa, wśród których dominowały genotypy t002, t056, t091, t3478 i t13620. Wszystkie izolaty od kur, z wyjątkiem czterech należących do CC398, zgrupowano w kompleks klonalny MLST CC5 (l = 134). Większość S. aureus z mięsa przydzielono do CC5, CC7 i CC15. Wszystkie genotypy spa, z wyjątkiem t011 (CC398), zidentyfikowane wśród izolatów pochodzących od kur, wykryto również w izolatach z mięsa. Cztery izolaty od kur o typie spa t011 (SCCmecV) i jeden z mięsa drobiowego o genotypie t899 (SCCmecIV), oba należące do CC398, zaklasyfikowano jako MRSA. Graniczną oporność na oksacylinę wykazywały trzy izolaty od kur i 19 z mięsa. Spa t091 i t084 przeważały wśród BORSA z mięsa drobiowego, podczas gdy BORSA od zwierząt reprezentowały typy t548 i t002. Podsumowując, w badanej grupie świń i kur oraz w żywności metycylinooporne izolaty S. aureus występowały z niską częstością. Występowanie MRSA ograniczało się do zwierząt pochodzących z jednej fermy trzody chlewnej i jednej fermy kur. Niska częstość występowania LA-MRSA CC398 u świń i kur oraz ich śladowa obecność w mięsie wskazują na ograniczone ryzyko transmisji odzwierzęcych MRSA do łańcucha żywnościowego. Wśród izolatów MSSA, MRSA i BORSA od świń, obok powszechnie identyfikowanych w innych krajach kompleksów CC9, CC30 i CC398, po raz pierwszy wykazano występowanie u tych zwierząt metycylinowrażliwych izolatów S. aureus o genotypie spa t091 należącym do kompleksu CC7. Większość izolatów MSSA od kur i z mięsa drobiowego należała do kompleksu CC5 z dominacją genotypu spa t002, potwierdzając powszechność występowania kompleksu CC5 u drobiu. Obecność izolatów BORSA stwierdzono w 1/10 populacji S. aureus. Większość izolatów z opornością graniczną od świń zaliczono do CC398, a od kur i z mięsa drobiowego do CC5 i CC7. Po raz pierwszy wykazano obecność izolatów BORSA CC398 u świń i w mięsie wieprzowym. Obecność BORSA CC398 w wieprzowinie oraz niewykazujących ekspresji białka A BORSA CC5 w mięsie drobiowym, wskazuje na możliwość transmisji odzwierzęcych klonów S. aureus o oporności granicznej na oksacylinę do żywności. 10

ABSTRACT Staphylococcus aureus is a ubiquitous, opportunistic pathogen that can cause serious infections in humans and animals. Antibiotic resistance in S. aureus is becoming more serious concern to public health protection. Until recently, the occurrence of S. aureus strains resistant to β-lactam antibiotics, considered as the medicines of choice for Staphylococcal infection, was limited to healthcare setting (healthcare-associated methicillin-resistant S. aureus, HA-MRSA) and community setting (community-associated methicillin-resistant S. aureus, CA-MRSA). Recently, MRSA has been found to be emerging in livestock (livestock-associated methicillin-resistant S. aureus, LA-MRSA). Animal colonization by resistant to β-lactam antibiotics S. aureus strains poses a threat to public health, because they can spread from animals to humans by direct contact or through the food of animal origin. Data on the occurrence and genetic diversity of MRSA, BORSA (borderline oxacillinresistant S. aureus) and MSSA (methicillin-susceptible S. aureus) in livestock and animal food in Poland is scarce. In this dissertation genotypes and oxacillin resistance of 420 S. aureus isolates from pigs (n = 203) and from pork (n = 217) and 263 from chickens (n = 138) and from chicken meat (n = 125) were analyzed. Among 18 spa types detected in S. aureus from pig t011, t021, t034, t091, t318, t337, and t1334 were the most frequent. S. aureus isolates from pork meat were assigned to 30 spa types. Among them genotypes t084, t091, t499, t4309, t12954 and t13074 were dominant. Only five genotypes, i.e., t034, t084, t091, t337, and t4309 were isolated both from animals and meat. From these, only t091 was identified with high frequency in both populations, while other genotypes consistently predominated in pigs (t034, t337) or meat (t084, t4309). The animal S. aureus isolates were clustered into MLST clonal complexes CC7, CC9, CC15, CC30, and CC398. Majority of meat-derived isolates were assigned to CC1, CC7, and CC15. Thirty six S. aureus, isolated exclusively from pigs, were MRSA. All MRSA were classified to spa t011 SCCmecV. BORSA phenotype was found in 14% S. aureus isolates from pigs and 10% isolates from pork meat. spa t034 belonging to CC398 dominated among BORSA from pigs and t091 (CC7) among meat-derived BORSA. Fifteen spa types were determined in studied S. aureus populations from chickens and chicken meat. Among 5 spa types detected in S. aureus from chicken t002, t3478 and t13620 were the most frequent. S. aureus isolates from meat were assigned to 14 spa types. Among them the genotypes t002, t056, t091, t3478 and t13620 were dominant. Except four chicken 11

S. aureus isolates belonging to CC398, remaining 134 isolates were clustered into MLST clonal complex CC5. Most of meat-derived isolates were assigned to CC5, CC7, and CC15. Except t011 (CC398), all other spa types found among chicken isolates were also present in isolates from meat. Four S. aureus isolated from chicken and one from meat were identified as MRSA. All MRSA were assigned to spa types belonging to CC398, and included four animal spa t011 SCCmecV isolates, and one meat-derived spa t899, SCCmecIV isolate. BORSA isolates were found within S. aureus isolates from chicken (3 isolates) and from meat (19 isolates). spa t091 and t084 dominated among BORSA from chicken meat, while t548 and t002 were found within animal BORSA. To sum up, methicillin-resistant S. aureus isolates occurred in low numbers in the investigated group of pigs, chickens and food. MRSA occurrence was restricted to animals derived from a single pig farm and chicken farm. This low prevalence of LA-MRSA CC398 in animals and their rare occurrence in meat suggest that at the moment there is only a limited risk of MRSA transmission from livestock to food of animal origin. Among MSSA, MRSA and BORSA isolates from pigs, besides CC9, CC30 and CC398 known to be widely disseminated in pigs, the occurrence of spa t091, belonging to CC7, methicillin-susceptible S. aureus isolates in this species was reported for the first time. The majority of chicken- and chicken meat-derived MSSA isolates belonged to CC5, represented primarily by spa t002 genotype, supporting the predominance of CC5 in poultry. BORSA isolates constituted one-tenth of the studied S. aureus population. Most of isolates with borderline oxacillin-resistance from pigs were assigned to CC398, and from chickens and chicken meat to CC5 and CC7. This is the first report on the occurrence of CC398 BORSA isolates in pigs and pork meat. The presence of BORSA CC5 in chicken meat, with no expression of staphylococcal protein A, and BORSA CC398 in pork meat, indicates the possibility of transmission of animal-associated borderline oxacillin-resistant S. aureus clones to food. 12