Gorczyca biała (Sinapis alba L.) w kulturach in vitro

Tom XXVIII ROŚLINY OLEISTE OILSEED CROPS 2007 Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy w Bydgoszczy Gorczyca biała (Sinapis alba L.) w kulturach in vitro In vitro culture of white mustard (Sinapis alba L.) Słowa kluczowe: Sinapis alba L., gorczyca biała, regeneracja, transformacja, hybrydyzacja, kultury in vitro, androgeneza Gorczyca biała (Sinapis alba L. syn. Brassica hirta, Brassica alba), znana także pod nazwą gorczycy żółtej, należy do rodziny Brassicaceae, do której zalicza się wiele rolniczo ważnych gatunków, np. rzepak. Jest to jara roślina oleista, która ma w Polsce coraz większe znaczenie gospodarcze, ze względu na wielostronne użytkowanie. Posiada znakomite właściwości biologiczne odporności na suszę, odporność na wiele chorób. Odmiany tradycyjne (np. Nakielska) wydają jednakże niski plon nasion o dużej zawartości glukozynolanów i kwasu erukowego, przez co zastosowanie jej w dużej mierze ograniczone jest głównie do celów przyprawowych. W Polsce tylko Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Poznaniu prowadzi badania nad uszlachetnieniem odmian gorczycy. W 2006 r., ośrodek ten zarejestrował nową odmianę Bamberka o obniżonej zawartości kwasu erukowego. Jednakże konieczne są dalsze prace nad doskonaleniem gatunku. Tradycyjne metody hodowli oparte są na czasochłonnym chowie wsobnym, który ponadto w przypadku gorczycy białej jest trudny do prowadzenia ze względu na dużą samoniezgodność. Duży postęp prac można osiągnąć poprzez zastosowanie metod biotechnologicznych i kultur in vitro. Gorczyca biała nie jest rośliną, która łatwo poddaje się zabiegom biotechnologicznym. W pracy zostały zebrane dostępne wyniki badań nad opracowaniem metod różnych kultur in vitro gorczycy białej. Jak wynika z tego przeglądu wydajność regeneracji, transformacji, androgenezy in vitro, czy tworzenia mieszańców międzygatunkowych jest niska. Wydaje się, że znalezienie genotypów bardziej podatnych na takie manipulacje oraz dostosowanie składów pożywek przyspieszy opracowanie metod uzyskiwania roślin z różnych eksplantatów. Key words: Sinapis alba L., white mustard, yellow mustard, regeneration, transformation, hybridization, in vitro culture, androgenesis White mustard (Sinapis alba L. syn. Brassica hirta, Brassica alba), known as a yellow mustard, belongs to the family Brassicaceae, which encompasses several important agricultural plants, for example oilseed rape. White mustard is a spring oilseed plant, with great value in Poland due to its broad utilization for economic purposes. The plant is characterized by excellent biological properties resistance to drought and resistance to several diseases. The yield of traditional cultivars (e.g. Nakielska) is low and the seeds are characterized by high level of glucosinolates and erucic acid. Therefore they are used mainly for condiment purposes. In Poland only Plant Breeding and Acclimatization Institute carries out studies to improve mustard varieties. In 2006, a new Polish variety of white mustard, Bamberka, with low level of erucic acid content was registered However, further works on improvement of this variety are needed. Traditional breeding methods based on inbreeding are difficult because of plant high self-incompatibility. Greater progress may be possible if biotechnological methods and in vitro cultures are used, but white mustard is a plant which does not undergo biotechnological treatment easily. As follows from the review of available works on white

160 mustard, the efficiency of regeneration, transformation and hybridization is very low. Finding out genotypes more prone to such manipulations and adjusting medium composition may foster the advancement of methods suitable for obtaining plants from various explants. Wstęp Gorczyca biała (Sinapis alba L.) jest jarą rośliną oleistą. Jej znaczenie gospodarcze rośnie ze względu na możliwość wszechstronnego wykorzystania. Jest uprawiana na nasiona, jako roślina poplonowa. Ze względu na właściwości akumulacji metali ciężkich (Hawieńczyk i in. 2005, Fargasova i in. 1998) oraz właściwości mątwikobójcze (Nowakowski i in. 1999) jest cenną rośliną fitosanitarną. Gorczyca biała jest obecnie najwierniej plonującą rośliną wśród gatunków jarych oleistych. Charakteryzuje się najniższym współczynnikiem zmienności plonu w latach oraz wysokim potencjałem plonotwórczym (Piętka i in. 2004). Gorczyca jest niewrażliwa na przymrozki wiosenne i mniej wrażliwa na susze wiosenne niż rzepak jary (Muśnicki i in. 1997, Wałkowski 1997). Ponadto nasiona gorczycy cechuje duża zawartość białka o korzystnym składzie aminokwasowym oraz niższa zawartość włókna w okrywie nasiennej w stosunku do rzepaku jarego (Olsson 1974, Katepa-Mupondwa i in. 2005). Obecnie tradycyjne odmiany gorczycy białej, np. Nakielska, uprawiane są głównie jako rośliny poplonowe oraz przyprawowe i cechują się wysoką zawartością kwasu erukowego (około 40%), a także wysoką zawartością glukozynolanów (około 140 µmol g -1 nasion), ( Piętka i in. 1998, Piętka i in. 2004). Gorczyca biała może być alternatywną jarą rośliną oleistą oraz wartościową rośliną białkową. Warunkiem jest jednak wyhodowanie odmian podwójnie ulepszonych ( 00 ) bez kwasu erukowego i o niskiej zawartości glukozynolanów. Przełomem było wyhodowanie i zarejestrowanie w 2006 roku, w ramach prowadzonych prac w Instytucie Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Poznaniu, niskoerukowej odmiany Bamberka (Piętka i Krzymański 2007). Również od czasu pierwszego doniesienia w 1991 r. o gorczycy charakteryzującej się zmniejszoną zawartością glukozynolanów (Krzymański i in. 1991) prowadzone są badania nad uzyskaniem gorczycy białej o obniżonej zawartości tych związków w śrucie. Obecnie kontynuowane są dalsze prace badawcze i selekcyjne zarówno nad obniżaniem zawartości kwasu erukowego, jak i glukozynolanów. Podstawową rośliną oleistą w Polsce jest rzepak ozimy. Rzepak jary wysiewany zwyczajowo w przypadku znacznych strat pozimowych rzepaku ozimego jest zbyt podatny na susze wiosenne, przez to jego plon jest zbyt zmienny. Dlatego poszukuje się rośliny lepiej dostosowanej do warunków naszego klimatu (Piętka i in. 2004, Wałkowski 1997). Gorczyca biała wśród roślin krzyżowych jest najbardziej odporna na występujące u nas susze letnie (Dembiński 1975, Muśnicki i in. 1997).

Gorczyca biała (Sinapis alba L.) w kulturach in vitro 161 Tradycyjna hodowla Sinapis alba jest bardzo czasochłonna (wymagająca wielu pokoleń do ustabilizowania pożądanego genotypu), ponadto gorczyca biała jest rośliną obcopylną o dużej samoniezgodności. Selekcja linii o pożądanych cechach jest trudna, ponieważ nie jest możliwe zastosowanie chowu wsobnego. Metody biotechnologiczne pozwalają przyspieszyć postęp prac hodowlanych. Niestety w przypadku gorczycy białej prowadzi się niewiele badań z tego zakresu. Sporo dostępnych doniesień jest sprzed ponad dziesięciu lat. Regeneracja pędów in vitro Opracowanie systemu regeneracji pędów z różnych eksplantatów Sinapis alba jest podstawą do dalszych biotechnologicznych udoskonaleń tej rośliny. Prowadzone dotychczas badania nad regeneracją gorczycy w kulturach in vitro wskazują na niski potencjał regeneracyjny (Jain i in. 1989). Podobnie jak inne gatunki z rodziny Brassica również gorczyca wykazuje duże zróżnicowanie zdolności do regeneracji w zależności od genotypu (Cardoza i in. 2004). W badaniach Jain a wykazano, że tylko 4 z 9 odmian gorczycy białej tworzyło pędy. Tylko jedna odmiana (Arda) dobrze reagowała na warunki kultury in vitro (16,1% eksplantatów tworzyło pędy). Najlepsze wyniki uzyskiwano na pożywce MS zawierającej ZEA (1,0 mg/l) i NAA (0,1 mg/l). Zmiana regulatorów wzrostu lub ich stężeń powodowała tworzenie się kalusa. Ważnym czynnikiem był również fotoperiod. Korzystnie na rozwój pędów oddziaływało oświetlenie ciągłe. Stymulowało ono również regenerację pędów odmian, które przy 16 h fotoperiodzie nie reagowały tworzeniem pędów (Jain i in. 1989). Transformacja genetyczna Mimo niskiej wydajności regeneracji roślin z różnych eksplantatów w kulturach in vitro, w 1994 roku Hadafi i Batschauer podjęli badania nad transformacją gorczycy białej za pomocą Agrobacterium tumefaciens. Zastosowany szczep C58C1 posiadał gen reporterowy uida i selekcyjny nptii. Transformowano hipokotyle 7 9 dniowych siewek. Kokulturę prowadzono przez 5 dni na pożywce płynnej MS wzbogaconej o 0,1 mg/l NAA i 1 mg/l BAP. Po tym czasie hipokotyle opłukiwano i przekładano na pożywkę stałą o takim samym składzie regulatorów oraz wzbogaconą o antybiotyki: betabactyl (500 mg/l) w celu eliminacji bakterii Agrobacterium oraz kanamycynę. Po 3 4 tygodniach uzyskany kalus z zawiązkami pędów przenoszono na pożywkę stałą z BAP o stężeniu 0,0025 mg/l oraz 250 mg/l betabactylu. Uzyskane pędy izolowano i przenoszono na pożywkę ukorzeniającą (0,1 mg/l IBA). Otrzymane wyniki dowodzą, że transformacja gorczycy białej przy pomocy Agrobacterium jest możliwa. Pierwsze objawy ekspresji uida zaobserwowano po 48 h od kokultury. Wydajność tworzenia pędów na eksplantatach transformowanych w stosunku do kontrolnych była 15 razy mniejsza. Histochemiczne testy wykazały, że 70% eksplantatów było stransformowane. Po dwóch do

162 trzech infekcjach 1/3 hypokotyli tworzyła zarodki somatyczne i/lub inne struktury (nodule-like structures). Po selekcji 10% eksplantatów tworzyło embryogenny kalus, z którego rozwijały się pędy. Po trzech miesiącach od transformacji uzyskiwano pierwsze kwitnące rośliny. Nasiona dziedziczyły T-DNA zgodnie z prawami Mendla (Hadif i Batschauer 1994). Uzyskane wyniki wskazują na możliwość otrzymania transformowanych roślin Sinapis alba o stabilnym dziedziczeniu trans-genu. Otwiera to drogę do dalszych badań z zakresu inżynierii genetycznej oraz dostarcza metody dla badań nad udoskonalaniem gorczycy białej. Androgeneza in vitro Podwojone haploidy (DH ang. doubled haploid) z powodzeniem znalazły zastosowanie w różnych programach hodowlanych takich roślin jak pszenica, pszenżyto, jęczmień oraz rzepak. Niewiele jest prac dotyczących wykorzystania linii DH w cyklu hodowlanym roślin obcopylnych, do których należy gorczyca biała. Chociaż naturą tych roślin jest heterozygotyczność, wydaje się, że zastosowanie podwojonych haploidów ułatwi ujawnienie zmienności genetycznej u gorczycy białej i otrzymanie linii ustabilizowanych pod względem pożądanych cech, np. jakości nasion. Pierwsze doniesienia o uzyskiwaniu haploidów w kulturze pylników Sinapis alba wskazywały na duży wpływ temperatury oraz stresu zmniejszonego ciśnienia atmosferycznego na tworzenie zarodków mikrosporowych w kulturze pylników (Klimaszewska i Keller 1983). Uzyskano wówczas 14 androgenicznych roślin. Jedynie 16,95% pylników wytwarzało zarodki mikrosporowe. O wiele większą wydajność stymulacji do androgenezy w kulturze pylników uzyskali Leelavathi i in. (1983). Prawie 93,75 % pylników gorczycy białej reagowało na pobudzanie do androgenezy in vitro. Autorzy ci uzyskali rośliny drogą bezpośredniej embriogenezy mikrospor. Prawie 87% otrzymanych roślin było haploidalnych. Późniejsze literaturowe doniesienia dotyczące wydajności kultur pylnikowych Sinapis alba wykazywały znacznie mniejszą wydajność. Np. Brune i in. (1989) obserwowali stymulację mikrospor do podziałów u 5,6% prowadzonych w kulturze pylników. Natomiast Jain i in. (1989) pośród wielu odmian, testowanych dla opracowania metody uzyskiwania linii DH w kulturze pylników, stwierdzili duże różnice genotypowe w podatności do stymulacji androgenezy in vitro. Jedynie odmiana Arda dość dobrze reagowała na indukcję do podziałów mikrospor. Wykazano także, że embriogeneza mikrospor była obserwowana tylko w kulturach prowadzonych w temperaturze 30 o C przez trzy tygodnie. Działanie wyższą temperaturą (32,5 o C) na kultury pylnikowe było nieskuteczne. Wykonane badania cytologiczno-histologiczne pylników gorczycy białej prowadzonych na różnych pożywkach, z wieloma rodzajami substancji wzrostowych, wykazały duże zamieranie mikrospor w trakcie prowadzenia kultury, spowodo-

Gorczyca biała (Sinapis alba L.) w kulturach in vitro 163 wane degradacją silnie zwakuolizowanych komórek tapetum ( Zachyrta i in. 2006). Może to być przyczyną tak niskiej wydajności androgenezy in vitro Sinapis alba w kulturze pylników. Kultury izolowanych mikrospor są ważną techniką uzyskiwania homozygot dla badań podstawowych i praktycznej hodowli. Dotychczas nie opracowano jeszcze wydajnej metody stymulacji do androgenezy in vitro izolowanych mikrospor Sinapis alba. Pierwsze doniesienie Bundrock i in. (1991) opisywało uzyskanie jedynie kilku roślin, z kultur izolowanych mikrospor gorczycy białej. Androgeniczne rośliny okazały się wysoce samopylne, W wyniku dalszych badań Bundrock (1998) uzyskała 43 rośliny ze 110 eksperymentalnych kombinacji związanych z traktowaniem chłodem zarówno roślin dawców mikrospor jak i kultur mikrospor oraz stymulacją temperaturą 32,5 o C samej kultury izolowanych mikrospor. W tych doświadczeniach mikrospory gorczycy białej izolowano i oczyszczano według metodyki opracowanej dla rzepaku z wyjątkiem stosowania odmiennych stężeń sacharozy, a mianowicie od 13 do 16%. Nie ustalono jednak skutecznego czynnika stymulującego podziały izolowanych mikrospor w kulturze, odpowiedniego stężenia sacharozy w pożywce oraz sposobu regeneracji roślin. Wydajność embriogenezy mikrospor wydawała się raczej przypadkowa. Także próby zastąpienia wysokiego stężenia sacharozy (13%) w pożywce częściowo PEG-4000, który to zabieg wydawał się korzystny dla innych trudnych do stymulacji androgenezy gatunków roślin, w przypadku Sinapis alba okazały się nieskuteczne (Ferrie i Keller 2007). Natomiast wstępne wyniki własnych badań nad pobudzaniem izolowanych mikrospor do podziałów stwarzają nadzieję na pozytywne rezultaty uzyskiwania homozygotycznych linii gorczycy białej tą drogą (Klóska i in. 2006). Hybrydyzacja W literaturze spotyka się liczne prace dotyczące hybrydyzacji gorczycy białej z innymi gatunkami. Gorczyca biała posiada korzystne cechy, np. tolerancję na wysoką temperaturę i suszę, oraz jest odporna na czerń krzyżowych (Alternaria brassicae), mątwika buraczanego (Heterodera schachtii Schm.) i kiłę kapusty (Plasmodiophora Brassicae Wor.). Wprowadzenie tych cech do bardzo cennego gospodarczo rzepaku ozimego jest bardzo pożądane. Istnieją doniesienia o udanych hybrydyzacjach poprzez izolację zarodka (Ripley i in. 1990) lub zalążni (Brown i in. 1997), a także fuzję protoplastów (Wang i in. 2005). W dwóch pierwszych przypadkach rośliny uzyskano tylko w krzyżowaniach, kiedy gorczyca była zapylana pyłkiem rzepaku, krzyżowania z zapylaniem rzepaku pyłkiem gorczycy kończyły się niepowodzeniem. Niezależnie od zastosowanej metody krzyżowania uzyskane rośliny zawiązywały niewiele nasion. Często miały zredukowany kwiat, pylniki zawierały małe ilości pyłku. Pokrój i cechy morfologicznie oraz zawartość kwasu erukowego i glukozynolanów były pośrednie w stosunku do cech roślin

164 rodzicielskich. Mieszańce uzyskane na drodze zapłodnienia międzygatunkowego posiadały 43 lub 31 chromosomów, natomiast uzyskane poprzez fuzję protoplastów 62 chromosomy. Napotkano również problemy z krzyżowaniem wstecznym uzyskanych roślin (Ripley i in. 1990, Brown i in. 1997, Hansen i in. 1997, Wang i in. 2005). Prace Hansena opublikowane w 1997 r. dowodzą, że fuzja protoplastów z różnych gatunków może być skuteczną metodą przenoszenia odporności na choroby do innych gatunków. Mieszańce gorczycy i kapusty głowiastej wykazywały odporność na Alternaria brassicae charakterystyczną dla gorczycy białej. Podsumowanie Gorczyca biała jest rośliną, która trudno poddaje się zabiegom biotechnologicznym, jak i tradycyjnej hodowli. Wydajność regeneracji, transformacji, androgenezy in vitro czy tworzenia mieszańców międzygatunkowych jest niska. Znalezienie genotypów bardziej podatnych na takie manipulacje oraz dostosowanie składów pożywek i innych warunków prowadzenia kultur tkankowych z pewnością poprawi wydajność tych technik i opracowanie metod uzyskiwania roślin z różnych eksplantatów, co przyspieszy postęp prac hodowlanych gorczycy białej. Literatura Brown J., Brown A.P., Davis J.B., Erickson D. 1994. Intergenic hybridization between Sinapis alba and Brassica napus. Euphytica, 93: 163-168. Brune U., Hahn V., Friedt W. 1989. Application of anther culture in breeding mustard species (Sinapis alba, Brassica juncea). XII Eucarpia Congress, 15: 25. Bundrock T., Seguin-Swartz G., Rakow G., Raney P. 1991. Double haploidy in yellow mustard (Sinapis alba L.). Agriculture and Agri-Food Canada, Research Centre Information. Cardoza V., Stewart C.N. 2004. Invited review: Brassica biotechnology: Progress in cellular and molecular biotechnology. In Vitro Cell. Dev. Plant Section, 40: 542-551. Dembiński F. 1975. Rośliny Oleiste. PWRiL, Warszawa. Fargasova A., Beinrohr E. 1998. Metal-metal interactions in accumulation of V 5+, Ni 2+, Mo 6+, Mn 2+ and Cu 2+ in under- and above-ground parts of Sinapis alba. Chemosphere, 36: 1305-1317. Ferrie A.M.R., Keller W.A. 2007. Optimization of methods for using polyethylene glycol as a nonpermeating osmoticum for the induction of microspore embryogenesis in the Brassicaceae. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant Section, 43: 348-355. Hadif K., Batschauer A. 1994. Agrobacterium mediated transformation of white mustard (Sinapis alba L.) and regeneration of transgenic plants. Plant Cell Reports, 13: 130-134. Hansen L.N., Earle E.D. 1997. Somatic hybrids between Brassica oleracea L. and Sinapis alba L. with resistance to Alternaria brasicae. Theoretical and Applied Genetics, 94: 1078-1085.

Gorczyca biała (Sinapis alba L.) w kulturach in vitro 165 Hawieńczyk M., Bystrzejewska-Piotrowska G., Kowalska J., Asztemborska M. 2005. Platinum bioaccumulation by mustard plants (Sinapis alba L.). Nukleonika, 50 (Suplement 1): 59-61. Jain R.K., Brune U., Frieid W. 1989. Plant regeneration from in vitro cultures of cotyledon explants and anthers of Sinapis alba and its implications on breeding of crucifers. Euphytica, 43: 153-163. Katepa-Mupondwa F., Raney P.J., Rakow G. 2005. Recurrent selection for increased protein content in yellow mustard (Sinapis alba L.). Plant Breeding, 124: 382-387. Klimaszewska K., Keller W.A. 1983. The production of haploids from Brassica hirta Moench (Sinapis alba L.) anther cultures. Pflanzenphysiol Bd., 109: 235-241. Klóska Ł., Cegielska-Taras T., Piętka T. 2006. Androgeneza w kulturze izolowanych mikrospor Sinapis alba. Kultury in vitro podstawą biotechnologii roślin, XI Ogólnopolska Konferencja Kultur In Vitro i Biotechnologii Roślin, Międzyzdroje: 112. Krzymański J., Piętka T., Ratajska I., Byczyńska B., Krótka K. 1991. Development of low glucosinolate white mustard (Sinapis alba syn Brassica hirta). Proceedings 8th International Rapeseed Congress, 9-11.07.1991, Canada 5: 1545-1548. Leelavathi S., Reddy V.S., Sen S.K. 1984. Somatic cell genetic studies in Brassica species, High frequency production of haploid plants in Brassica alba (L.) H. f. & T. Plant Cell Reports 3: 102-105. Nowakowski M., Szymczak-Nowak J. 1999. Wpływ uprawy rzodkwi oleistej, gorczycy białej i facelii błękitnej w międzyplonie ścierniskowym na populację mątwika burakowego (Heterodera schachtii Schmidt). Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XX: 259-265. Muśnicki Cz., Toboła P., Muśnicka B. 1997. Produkcyjność alternatywnych roślin oleistych w warunkach Wielkopolski oraz zmienność ich plonowania. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XVIII (2): 269-278. Olsson G. 1974. Continuos selection for seed number per pod and oil content in white mustard. Hereditas, 77: 197-204. Piętka T., Krzymański J., Michalski K., Krótka K. 1998. Postępy prac nad tworzeniem gorczycy białej podwójnie ulepszonej. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XVIII (2): 511-524. Piętka T., Krótka K., Krzymański J., 2004. Gorczyca biała podwójnie ulepszona alternatywna jara roślina oleista. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XXV (2): 403-413. Piętka T., Krzymański J. 2007. Bamberka zeroerukowa gorczyca biała. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XXVIII (1): 119-124. Riplay V.L., Arnison P.G. 1990. Hybridization of Sinapis alba L. and Brassica napus L. via Embryo Rescue. Plant Breeding, 104: 26-33. Wałkowski T. 1997. Gorczyce. IHAR Poznań. Wang Y-P. Sonntag K., Rudloff E., Chen J-M. 2005. Intergenic somatic hybridization between Brassica napus L. and Sinapis alba L. Journal of Integrative Plan Biology, (dawniej: Acta Botanica Sinica), 45 (1): 84-91. Zarychta Ł., Zenkteler M., Zenkteler E., Cegielska-Taras T. 2006. Analiza mikrosporowa kultur pylników lnu (Linum usitatissimum L.) i gorczycy białej (Sinapis alba L.). Kultury In vitro podstawą biotechnologii roślin, XI Ogólnopolska Konferencja Kultur In Vitro i Biotechnologii Roślin, Międzyzdroje: 126.