2. OBRAZY CYFROWE. 2.1 Rodzaje obrazów cyfrowych Rastrowy obraz cyfrowy (mapa bitowa, bitmapa) zbudowany jest z kwadratowych (rzadziej prostokątnych lub sześciokątnych) elementów zwanych pikselami. Taki obraz można traktować jako tabelę (macierz) o liczbie kolumn i wierszy odpowiadających długości i szerokości obrazu w pikselach. Każdemu pikselowi obrazu przypisana jest określona wartość w komórce tablicy. Rys. 2.1. Obraz w programie ImageJ Maksymalny wymiar obrazu uzyskanego z kamery odpowiada liczbie sensorów w chipie CCD, dla większości obrazów wykorzystywanych na kursie będzie to nie więcej niż 2048 x 2048 pikseli. Liczba pikseli w obrazie określa jego rozdzielczość.
Rys. 2.2. Obraz cyfrowy i jego powiększony fragment, z widocznymi pikselami Głębia bitowa to pojęcie określające liczbę bitów użytych do definiowania właściwości pojedynczego piksela w obrazie. Najczęściej stosowane są obrazy 1, 8 i 24 bitowe. W monochromatycznym obrazie 8-bitowym (grayscale image) każdemu pikselowi przypisana jest wartość z przedziału 0-255, wartości te reprezentują poziomy szarości (jasności, gray level) obrazu. Zwykle 0 to poziom najniższy, czyli całkowita czerń, natomiast 255 reprezentuje maksymalną jasność. Jest to przypisanie umowne, w pewnych dziedzinach stosuje się odwrotne przypisanie poziomów jasności pikselom. Obrazy 8-bitowe są najczęściej monochromatyczne, choć istnieją pewne sposoby pozwalające na uzyskanie koloru na tego typu obrazach na przykład przeznaczając po 3 bity na zakodowanie koloru czerwonego i zielonego i dwa na kolor niebieski - uzyskuje się w ten sposób obrazy 256-kolorowe - tzw. kolor indeksowany. Ten rodzaj obrazów praktycznie nie jest używany w badaniach biologicznych, i większość procedur w ImageJ nie działa dobrze przy takich obrazach. 24-bitowe obrazy RGB pozwalają na zakodowanie ponad 16 milionów kolorów. Na monitorze barwa reprezentowana jest z reguły w standarcie RGB, czyli jest wynikiem dodawania trzech podstawowych kolorów: czerwonego (R), zielonego (G) i niebieskiego (B) - jest to tak zwane addytywne składanie barw. 24-bitowy obraz składa się w rzeczywistości z 3 obrazów 8-bitowych (kanałów), każdy z nich odpowiada jednej składowej barwnej. Wszelkie procedury przetwarzania obrazów są na ogół wykonywane oddzielnie na każdym kanale. Niektóre formaty zapisu pozwalają na tworzenie 32-bitowych obrazów RGB. Dodatkowe 8 bitów tworzy tzw. kanał alfa w którym mogą być na przykład zapamiętywane nałożone na obraz maski. Maska to binarny obraz nałożony na obraz oryginalny, który służy na przykład do wyodrębniania fragmentu obrazu (ROI region of interest) na których przeprowadzane będą operacje. Przy pomocy maski wyznaczamy też fragmenty obrazu które będą kopiowane, wycinane lub wypełniane jednolitą barwą (operacje copy, cut i fill). W obrazie 1-bitowym (binarnym) każdemu pikselowi przypisana jest wartość 0 lub 1. Jeden poziom służy do wyznaczania pikseli należących do obiektów, drugi wyznacza piksele należące do tła. ImageJ nie pracuje z prawdziwymi obrazami 1-bitowymi.
Jako obrazy binarne funkcjonują obrazy 8-bitowe, z dwoma wartościami - 0 i 255. Dla celów morfometrycznych sposób zapisu obrazu binarnego nie ma większego znaczenia, a sposób przyjęty w ImageJ pozwala na łatwe przeprowanianie pewnych procedur, takich jak EDM (Euclidean distance map). Nowe wersje ImageJ podczas tworzenia obrazów binarnych nakładają od razu tzw. inwertowany LUT, który przypisuje pikselom obiektów wartość 255, a pikselom tła wartość 0. Rys. 2.3 Obraz monochromatyczny i utworzony na jego podstawie obraz binarny, z nałożonym invertowanym LUT-em. Obraz jest nadal 8-bitowy, ale tylko dwa poziomy szarości, 0 i 255 są w nim wykorzystane. ImageJ potrafi tworzyć i pracować z obrazami 16-bitowymi (65365 poziomów szarości) oraz z 32-bitowymi monochromatycznymi obrazami zmiennoprzecinkowymi (floating-point grayscale images,), w których poziomy szarości zapisane są w postaci liczb rzeczywistych (dodatnich lub ujemnych). Ten drugi rodzaj obrazów nie może być prawidłowo wyświetlony na żadnym monitorze, ani zapamiętany w większości dostępnych formatów, jest jednak przydatny przy przeprowadzaniu operacji matematycznych na obrazach. 2.2 Formaty plików graficznych Obrazy rastrowe mogą być zapisywane w różnych formatach. BMP (Windows bitmap) najprostszy format, zapisuje obrazy bez kanału alfa i bez kompresji.
TIFF (Tag Image File Format) pozwala na zapisywanie obrazów z maskami, a także serii obrazów w jednym pliku (stos czyli stack). GIF, JPEG obrazy skompresowane, raczej unikamy ich w analizie, choć do pewnych zadań mogą być wystarczające, a zajmują zdecydowanie mniej miejsca na dysku. ImageJ może też otwierać wiele innych typów obrazów, a po zainstalowaniu odpowiedniego pluginu może otwierać także obrazy w formacie *.lsm, pochodzące z mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM Meta, znajdującego się w Zakładzie Biologii i Obrazowania Komórki. 2.3 Modele kolorów Najbardziej typowy model to RGB (od Red, Green, Blue), zbudowany z trzech nakładających się na siebie 8-bitowych obrazów (kanałów). W każdym z kanałów pikselowi odpowiada wartość z przedziału od 0 do 255. Barwa powstaje wówczas, gdy poziomy szarości w nakładających się na siebie pikselach w poszczególnych kanałach są różne. Do badań morfologicznych korzystne jest niekiedy wybranie tylko jednego kanału do analizy - na przykład w kanale zielonym kontury komórek są z reguły ostrzejsze niż w kanale niebieskim. Rys. 2.4 Obraz RGB i jego rozkład na kanały: R, G i B (red, green i blue) oraz H, S i B (hue, saturation, brightness, czyli barwa, wysycenie i jasność)
W ImageJ możemy rozbić obraz RGB na składowe korzystając z menu: Image Type RGB Stack. Poszczególne składowe wyświetlane są w kolejno w jednym oknie i przechodzimy między nimi korzystając z suwaków na dole obrazu. Przekształcenie odwrotne uzyskujemy poleceniem: Image Type RGB Color. Oprócz modelu RGB istnieją jeszcze inne modele obrazów barwnych. Do najpopularniejszych należy model HSB (HSI,HSV). Pierwszy kanał to barwa (hue) kolory kodowane są najczęściej według kolejności w widmie światła 0 to czerwony, 255 to fiolet. Drugi to nasycenie (saturation) kanał ten koduje głębię (czystość) koloru albo inaczej, udział bieli w kolorze. W tym standarcie np. czerwień i róż będą miały taką samą wartość dla kanału H, a różnić się będą nasyceniem maksymalna wartość będzie dla czystej czerwieni, minimalna dla różu. Trzeci kanał (brightness) określa intensywność (jaskrawość) barwy. Niekiedy przekodowanie obrazu z modelu RGB na HSB może być przydatne do wydobycie z obrazu pożądanych szczegółów. Obrazy HSB można przekodować z powrotem do RGB. W ImageJ obraz RGB konwertujemy korzystając z opcji: Image Type HSB Stack. Proces odwrotny przez: Image Type RGB Color. 2.4 Uzyskiwanie informacji o obrazie Podstawowe informacje o obrazie dotyczą jego rozmiaru, liczby bitów na piksel, formatu, etc. Po otwarciu okna z obrazem w ImageJ pod nazwą obrazu będą wyświetlone informacje o jego rozmiarach w pikselach (lub w innych jednostkach, jeśli do programu został wprowadzony przelicznik, określający zależność pikseli do danych jednostek (opcja Set scale, menu ANALYZE). Do celów analitycznych przydatna może być informacja o poziomach szarości w poszczególnych punktach obrazu lub wzdłuż zaznaczonej linii (funkcja Plot Profile) i o rozkładzie poziomów szarości wszystkich pikseli w obrazie lub jego części (Histogram). Wiedza ta może być przydatna też do określenia sposobu ewentualnego dalszego przetwarzania obrazu. Funkcje Histogram i Plot Profile znajdują się w menu ANALYZE. Histogram stanowi podstawowe źródło informacji o jakości obrazu - przy jego pomocy można lepiej niż gołym okiem ocenić czy obraz jest odpowiednio oświetlony i skontrastowany. Histogram pustego obrazu - tzn. bez preparatu mikroskopowego lub z czystym szkiełkiem, pozwala na odpowiednie ustawienie intensywności oświetlenia podczas robienia zdjęć.
Rys. 2.5 Obraz monochromatyczny, jego histogram i profil rozkładu jasności pikseli wzdłuż żółtej linii zaznaczonej na obrazie. Polecenie Live pozwala na obserwacje zmian w profilu lub histogramie podczas przesuwania linii lub ROI po obrazie, RGB pozwala na wyświetlenie oddzielnych histogramów dla każdego kanału (w przypadku obrazów RGB). Rys. 2.6 Polecenie List wyświetla listę z wynikami. Dla Plot Profile (po lewej) będzie to poziom szarości kolejnych pikseli wzdłuż narysowanej linii (Y), a dla histogramu pierwsza kolumna to poziom szarości a druga liczba pikseli o takim poziomie szarości w obrazie lub w ROI.
Rys. 2.7 Obrazy: niedoświetlony, prześwietlony, przekontrastowany i słabo skontrastowany oraz ich histogramy.
Rys. 2.8 Przy odpowiednim oświetleniu histogram pustego obrazu powinien tworzyć wąski, symetryczny pik położony blisko prawej krawędzi (dla preparatów fotografowanych w świetle przechodzącym). Przy fotografowaniu preparatów w świetle przechodzącym kluczowe znaczenie ma odpowiednie ustawienie światła (Rys. 2.7). Dla preparatów fluorescencyjnych należy tak ustawić parametry kamery (lub wmacniaczy w mikroskopie konfokalnym), aby histogram uzyskanego obrazu wypełniał cały zakres poziomów szarości. 2.5 Pseudokolor i kolor indeksowany W większości analiz posługujemy się obrazami monochromatycznymi, o różnej głębi bitowej, od 1-bitowych (1 2-2 poziomy szarości) - po 32-bitowe (4 294 967 296 poziomy szarości) i obrazami barwnymi zapisanymi w formacie RGB (3 x 8 bitów czyli 2 24 barw). Istnieje możliwość sztucznego pokolorowania obrazów monochromatycznych, korzystając z opcji LUT (menu Image - Lookup tables) i predefiniowanych tablic, można też samodzielnie taką tablicę utworzyć (Image - Color - Edit LUT). Polega to na przypisaniu kolejnym poziomom szarości określonej barwy. Edytor LUT pozwala na utworzenie własnego LUTu, zapamiętanie go, i przywołanie do otwartego obrazu monochromatycznego (Open). Głównym powodem takiej modyfikacji obrazu jest to, że na obrazach barwnych widoczność szczegółów może być lepsza. ImageJ może posługiwać się 8-bitowymi obrazami barwnymi, wykorzystującymi tak zwany kolor indeksowany. Takie obrazy wykorzystują od 2 do 256 kolorów. Pliki z takimi obrazami mają znacznie mniejsze rozmiary, odbywa się to jednak kosztem utraty informacji. ImageJ może przekształcać obraz RGB w 8-bitowe obrazy barwne, użytkownik może określić ile barw ma być w wynikowym obrazie. Większość funkcji ImageJ nie pracuje prawidłowo z takimi obrazami, więc staramy się unikać tego formatu. Może on być jednak wykorzystany do zwiększenia widoczności szczegółów obrazu (Rys. 2.10).
Rys. 2.9 Submenu LUT i edytor LUT Rys. 2.10 Pseudokolory nałożone na obraz monochromatyczny
2.6. Selekcja fragmentów obrazu Pierwsze ikony w pasku z ikonami służą do wybierania fragmentów obrazu (ROI - region of interest). Klikając na ikonkę prawym klawiszem można wywołać dodatkowe narzędzia. Dodatkowe możliwości powstają przy pomocy klawiszy Shift, Ctrl i Alt. Zaznaczony obszar może być wycięty i skopiowany w inne miejsce. Zastosowanie polecenia Duplicate powoduje powstanie nowego obrazu, zawierającego tylko wybrany fragment. Większość filtrów może działać wybiórczo w obrębie zaznaczenia. Także polecenie: Measure dokonuje pomiarów w obrębie zaznaczenia. Jeśli nic nie jest zaznaczone to Measure mierzy cały obraz. Oprócz ikon dodatkowe możliwości manipulowania stwarza submenu Selection. Istnieje również możliwość zapamiętania parametrów ROI i odtworzenia go w nowym obrazie (Shift-Ctrl-E). Rys. 2.11. Selekcja fragmentów obrazu
Rys. 2.12 Manipulacje na wyselekcjonowanych ROI Rys. 2.13 Działanie różdżki w zależności od sposobu zdefiniowania sąsiedztwa. Przy sąsiedztwie = 4 tylko brane pod uwagę są tylko piksele sąsiadujące w pionie i poziomie, zatem przy pomocy różdżki na obrazie będzie można zaznaczyć dwa oddzielne elementy. Przy sąsiedzwie = 8 także piksele sąsiadujące po przekątnej są brane pod uwagę, i w tym przypadku program uzna, że na obrazku znajduje się tylko jeden obiekt.
Rys. 2.14 Różdżka może być wykorzystana do selekcji obszarów o podobnym poziomie szarości. Zakres tego podobieństwa określa się przy pomocy narządzia Wand Tool i opcji Tolerance. 2.7 Praca na wielu obrazach ImageJ pozwala na jednoczesne przetwarzanie wielu obrazów. Najprostszy sposób to otwarcie wielu obrazów i połączenie ich w jeden stos: Image Stacks Images to Stack. Należy przy tym zaznaczyc opcję Use Titles as Labels Aby otworzyć wiele obrazów należy w Options, Input/Output zaznaczyć opcję Use JFileChooser... W przypadku stosów po każdej wywołanej funkcji lub makrze program pyta, czy operacja ma być wykonana na wszystkich obrazach ze stosu. Przy odpowiedzi OK wszystkie obrazy zostaną w odpowiedni sposób przetworzone. Aby zapamiętać przetworzone obrazy jako odrębne obrazy ze starymi nazwami należy wybrać polecenie Save As Image Sequence i zaznaczyć Use slice labels as file names (rys. 2.15). Można też zaimportować i otworzyć jako jeden stos zawartość całego foldera - służy do tego polecenie File Import Image sequence. Obrazy powinny być tego samego typu i mieć takie same rozmiary (rys. 2.16). W wielu przypadkach można wykorzystać tzw. przetwarzanie wsadowe (Process Batch). W takim przypadku wskazujemy programowi folder z obrazami do przetworzenia, folder do którego mają zostać zapisane wyniki oraz macro zawierające sekwencję poleceń które mają zostać wykonane (rys. 2.17)
Rys. 2.15 Rys. 2.16
Process: Batch Przetwarzanie wielu obrazów automatycznie, bez ich otwierania. Rys. 2.17 Opcja Batch (menu Process) pozwala na zastosowania makra do wszystkich obrazów w katalogu. Określamy folder w którym znajdują się obrazy do przetworzenia, folder do którego mają być zapisane przetworzone obrazy oraz makro, zgodnie z którym zostaną przetworzone obrazy. 2.8 Stosy Stos (stack) to kilka obrazów o takich samych parametrach połączonych w jedną całość. Przykładem stosu jest obraz RGB. Stosami są także obrazy pochodzące z mikroskopu konfokalnego. Jeśli obrazy takie były jednocześnie rejestrowane w kilku kanałach to mamy do czynieniania z hiperstosami. Submenu Stacks zawiera szereg opcji pozwalających na manipulowanie stosami. Rys. 2.18 Obraz z mikroskopu konfokalnego. Pod nazwą obrazu znajduje się informacja o liczbie skrawków optycznych w stosie, suwak na dole pozwala na przechodzenie między poszczególnymi skrawkami warstwami).
Rys. 2.19 Opcja Make Montage - montaż przedstawiający wszystkie skrawki optyczne ze stosu z Rys. 2.18 Rys. 2.20 Opcja Reslice pozwala na stworzenie nowego stosu, przedstawiającego obraz w płaaszczyźnie prostopadłej do płaszczyzny oryginalnego stosu.
Rys. 2.21 Efekt działania polecenia Reslice Rys. 2.22 Funkcja Ortogonal View pozwala na oglądanie stosu także w wymiarze XZ i YZ
Rys. 2.23 ZProjekt pozwala na zrobienie zrzutu obrazów w stosie na jeden obraz, działa podobnie jak Image Calculator Rys. 2.24 3D Project pozwala na trójwymiarową wizualizację stosu.