PL B1. INSTYTUT MEDYCYNY DOŚWIADCZALNEJ I KLINICZNEJ IM. MIROSŁAWA MOSSAKOWSKIEGO POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Warszawa, PL

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 5/079 ( ) C12N 5/074 ( ) C07K 14/76 ( ) C12N 11/04 ( ) C12M 3/06 ( ) A61K 35/12 ( ) A61P 25/00 ( ) (54) Trójwymiarowy agregat komórkowy, sposób jego otrzymywania i zastosowania (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT MEDYCYNY DOŚWIADCZALNEJ I KLINICZNEJ IM. MIROSŁAWA MOSSAKOWSKIEGO POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Warszawa, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 18/08 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/14 (72) Twórca(y) wynalazku: ANDRZEJ W. LIPKOWSKI, Warszawa, PL MARCIN JURGA, Włodawa, PL KRYSTYNA DOMAŃSKA-JANIK, Warszawa, PL BARBARA ŁUKOMSKA, Warszawa, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Rafał Witek

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiot wynalazku stanowią trójwymiarowe agregaty komórek macierzystych hodowane in vitro na bazie szkieletów białkowych, w zdefiniowanych pożywkach, pozbawionych czynników pochodzenia zwierzęcego, które tworzą in vitro oraz in vivo trójwymiarowe zespoły w pełni dojrzałych, funkcjonalnych, oddziałujących ze sobą komórek, odpowiadających fragmentom tkanki izolowanej z organizmu. Komórki macierzyste są niezwykle obiecujące w perspektywie ich zastosowania do regeneracji uszkodzonych tkanek ze szczególnym uwzględnieniem mózgu. Uszkodzenia te mogą być wynikiem udarów, chorób neurodegeneracyjnych (choroba Alzheimera, Parkinsona) oraz urazów wielu tkanek, w tym mózgu i rdzenia kręgowego. Nie ma jak dotąd dowodów na przywrócenie funkcji uszkodzonego ośrodkowego układu nerwowego przez transplantowane ludzkie komórki macierzyste zarówno w modelach zwierzęcych jak również po transplantacji do organizmu człowieka. Nie opisano jak dotąd badań, których wynikiem byłoby otrzymanie funkcjonalnych neuronów z ludzkich komórek macierzystych niepochodzących z neurogennych rejonów mózgu (włączając w to ludzkie embrionalne komórki macierzyste) zarówno in vitro jak i po ich transplantacji. W badaniach nad ludzkimi komórkami macierzystymi szczególny nacisk kładzie się obecnie na inżynierię tkankową i w perspektywie klinicznej, poszukuje się sposobów uzyskiwania in vitro z komórek macierzystych trójwymiarowych agregatów odpowiadających funkcjonalnie fragmentowi uszkodzonej tkanki a nastąpienie ich przeszczepieniu (Ref 5). Agregaty takie powinny być wytwarzane w warunkach pozwalających zminimalizować zanieczyszczenie obcymi antygenami i wirusami w celu zredukowania ryzyka wywołania niepożądanej odpowiedzi immunologicznej organizmu biorcy oraz zminimalizowania zagrożenia infekcją (Ref. 1). Celem wynalazku jest dostarczenie agregatów komórkowych, które mogą być wykorzystane jako funkcjonalne zamienniki naturalnych tkanek różnego typu oraz sposobu otrzymywania takich agregatów. Pożądane jest, aby uzyskiwane agregaty mogły być stosowane do przeszczepów. Wcześniejsze zgłoszenie patentowe P tych samych twórców ujawnia nowe szkieletowe preparaty białkowe, ich zastosowania jako szkieletowy mikromateriał do hodowli komórek macierzystych oraz sposób otrzymywania tych preparatów oraz ich zastosowanie w hodowli komórek macierzystych. Badania wykazały, że preparaty białkowe są dobrym nośnikiem dla komórek macierzystych. Dla celów niniejszego zgłoszenia nośnikowe preparaty białkowe zostały określone jako keratynowy materiał szkieletowy. Dalsze badania wykazały nieoczekiwanie, że agregaty powstałe z komórek macierzystych hodowane w pożywkach zdefiniowanych na opisanych szkieletach białkowych charakteryzują się ściśle określoną budową komórkową odzwierciedlającą warunki panujące w niszach komórek macierzystych np. neurogennych rejonach mózgu - tzw. niszach neuralnych komórek macierzystych okolicy hipokampa i strefy okołokomorowej. Ponadto w dalszych badaniach wykazano, że opisane agregaty komórkowe posiadają zdolność do wytworzenia in vitro funkcjonalnego zespołu komórek przypominających tkankę, przykładowo funkcjonalnej sieci neuronów generujących spontanicznie elektryczny potencjał czynnościowy. Funkcjonalne sieci zbudowane z ludzkich neuronów są obecnie dostępne jedynie w oparciu o tkanki pozyskiwane z mózgów płodów. Agregaty komórek macierzystych ujawnione w wynalazku hodowane są w zdefiniowanych pożywkach pozbawionych surowicy i produktów pochodzenia zwierzęcego. Dzięki temu zredukowane zostało ryzyko odpowiedzi immunologicznej organizmu biorcy oraz zminimalizowano zagrożenia infekcją wirusową. Jako komórki macierzyste rozumie się ludzkie komórki zdolne do odtwarzania samych siebie na drodze podziałów symetrycznych oraz różnicowania w funkcjonalne komórki identyczne z tymi znajdującymi się w dorosłych tkankach, oraz komórki macierzyste jako komórki znajdujące się na dowolnym etapie rozwoju poprzedzającym wytworzenie terminalnie zróżnicowanej komórki (np. neuronu generującego potencjał czynnościowy). Ujawniono również agregaty/zespoły ostatecznie zróżnicowanych funkcjonalnych czynnościowo komórek powstałe w wyniku procesu różnicowania komórek macierzystych hodowanych na białkach szkieletowych. Ujawniono również agregaty/zespoły komórek znajdujących się na różnych etapach zróżnicowania a więc zawierających zarówno terminalnie zróżnicowane funkcjonalne komórki oraz niezróżnicowane komórki macierzyste wzajemnie oddziałujące na siebie. Odpowiada to budowie nisz komórek macierzystych in vivo. Agregaty komórek macierzystych hodowane na białkach szkieletowych zbudo-

3 PL B1 3 wane są z heterogennej frakcji komórek znajdujących się na różnych stopniach rozwoju. Swoją budową i składem komórkowym przypominają nisze komórek macierzystych. Struktury te mogą służyć, zatem do badań nad proliferacją, migracją i różnicowaniem komórek macierzystych in vitro. Agregaty te mogą służyć również jako materiał transplantacyjny bardziej korzystny względem zawiesiny pojedynczych komórek z uwagi na to, że jak wykazano w badaniach agregat połączonych ze sobą (połączeniami szczelinowymi) komórek spełnia funkcję ochronną względem znajdujących się wewnątrz agregatu komórek i zwiększa tym samym przeżywalność komórek po transplantacji. Z cytowanego już powyżej wcześniejszego zgłoszenia patentowego P wiadomo, że opisane szkielety białkowe mogą być wykorzystane jako nośniki substancji modyfikujących wzrost i różnicowanie agregatu komórkowego. Substancje te mogą być modulatorami wzrostu, różnicowania, migracji oraz sekrecji białek produkowanych przez komórki agregatu. W efekcie może to korzystnie wpływać na regenerację uszkodzonej tkanki biorcy po przeszczepie agregatu. Zastosowane szkielety białkowe modyfikują różnicowanie agregatu komórek macierzystych i znacząco stymulują różnicowanie się tych komórek a w efekcie wytworzenie się funkcjonalnych połączeń komórkowych przypominających strukturę tkanki. Istota wynalazku Przedmiotem wynalazku jest trójwymiarowy agregat komórkowy zawierający neuralne komórki macierzyste z krwi pępowinowej lub komórki powstałe w wyniku ich różnicowania oraz keratynowy materiał szkieletowy, przy czym rzeczony agregat komórkowy zawiera sieć funkcjonalnych neronów zdolnych do komunikowania się. Korzystnie trójwymiarowy agregat komórkowy według wynalazku zawiera dodatkowo co najmniej jedną substancję wybraną spośród substancji modyfikujących wzrost i różnicowanie komórek. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania trójwymiarowego agregatu komórkowego charakteryzujący się tym, że izoluje się komórki macierzyste z krwi pępowinowej lub komórki powstałe w wyniku ich różnicowania, a następnie uzyskane komórki macierzyste hoduje się w pożywce płynnej pozbawionej składników pochodzenia zwierzęcego w obecności keratynowego materiału szkieletowego, przy czym do izolowania komórek macierzystych nie stosuje się embrionów ludzkich. Korzystnie, jako pożywkę płynną stosuje się pożywkę pozbawioną surowicy, korzystnie zawierającą także mitogeny. Szczególnie korzystnie, komórki macierzyste izoluje się z krwi pępowinowej. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie trójwymiarowego agregatu komórkowego określonego powyżej do otrzymywania funkcjonalnych zamienników tkanek. Korzystnie, uzyskiwany materiał jest wykorzystywany do otrzymywania układów bioelektronicznych. Korzystnie, uzyskiwany materiał jest wykorzystywany do przeszczepów. Dla lepszego zilustrowania przedmiotowego wynalazku zastosowanie nowych agregatów komórek macierzystych przedstawiono w przykładach. Nie należy jednak ograniczać zakresu wynalazku jedynie do treści poniższych przykładów. P r z y k ł a d I. Krew pępowinowa jest źródłem komórek macierzystych o niewielkim stopniu immunogenności przy transplantacjach allogenicznych w porównaniu do somatycznych komórek macierzystych izolowanych z dorosłego organizmu. Możliwe jest również zastosowanie tego źródła komórek macierzystych do transplantacji autologicznych w przypadku, gdy krew pępowinowa została zabezpieczona bezpośrednio po porodzie. Dowiedziono, że krew pępowinowa może być źródłem neuralnych komórek macierzystych (Ref. 2, 3). Agregaty linii neuralnych komórek macierzystych z krwi pępowinowej (HUCB-NSC) (Ref. 2) rosnące na szkieletach białkowych w pożywkach zdefiniowanych, umieszczane były na płytkach hodowlanych pokrytych elektrodami (The multielectrode array chips [MEA chips] - (silicon MEA - Bionas measurement system; glass MEA - University of Texas - Center for Network Neuroscience) na obrzeżach pola zawierającego elektrody. Hodowla prowadzona była w pożywce różnicującej: DMEM/F12 + ITS (1:100; Gibco) + FBS (2%; Gibco) + camp (w postaci dwumaślanu camp [dbcamp] umożliwiającego przedostanie się związku do komórki; Sigma) ( μμ) + kwas retinowy (RA) (0,5 μμ; Sigma) + fibronektyna (10-50 μg/ml; Sigma). Podczas 3 tygodni hodowli komórki macierzyste migrowały na zewnątrz osiadłych agregatów i różnicowały się na obszarze pokrytym elektrodami tworząc sieć neuronów. Pod koniec trzeciego tygodnia hodowli badanie elektrofizjologiczne potencjału pola wykazało spontaniczną aktywność elektryczną 16% (9 z 55) zbadanych MEA chips (średnio 11 aktywnych neuronów na każdej płytce pomiarowej). Potencjał elektryczny mógł być hamowany za pomocą TTX lub obniżonej temperatury. Neurony zorganizowane były w funkcjonalną sieć komunikujących się ze sobą komórek. Możliwość uzy-

4 4 PL B1 skiwania funkcjonalnych sieci neuronowych z ludzkiej krwi pępowinowej stwarza niezwykle cenny materiał do badań in vitro (modelowanie i uczenie się sieci neuronowych, związki toksyczne wpływające na funkcjonalne ludzkie sieci neuronowe, działanie leków), jak również do transplantacji uszkodzonego mózgu bądź rdzenia kręgowego. P r z y k ł a d II. Komórki linii HUCB-NSC (Ref. 2) hodowane były w gęstości 0,1-0,5 miliona/ml w butelkach plastikowych (25 cm 2 ; Nunc) w pożywce pozbawionej surowicy z dodatkiem mitogenów: DMEM/F12 (Gibco), B27 (1:50; Gibco), EGF (20 ng/ml; Sigma). Do hodowli dodawano ludzkie cytoszkielety keratynowe (ok. 50 sztuk/butelkę). W ciągu pierwszego tygodnia hodowli w pożywce bez surowicy pojedyncze komórki HUCB-NSC osiadały równomiernie na całej długości pływającego cytoszkieletu. W przeciągu kolejnych 7 dni komórki tworzyły lokalne, wielowarstwowe skupiska wokół centralnego rdzenia cytoszkieletu. Podczas trzeciego i czwartego tygodnia hodowli lokalne skupiska komórek zlewały się, tworząc jednolity wielowarstwowy agregat zbudowany wokół centralnie położonego cytoszkieletu. Komórki wewnątrz agregatu wytwarzają pomiędzy sobą połączenia szczelinowe (na podstawie skanowania konfokalnego immunocytochemi anty-koneksyna43 i zdjęć w mikroskopie elektronowym). Po osiągnięciu maksymalnych rozmiarów (warstwa komórek do 300 µm od rdzenia) wzrost agregatu ustawał. Dorosłe, pływające agregaty 3D-NSC można utrzymywać w hodowli, co najmniej przez kolejny miesiąc bez widocznych zmian morfologicznych. Jakkolwiek, wraz z upływem czasu wewnętrzny cytoszkielet zostaje trawiony przez otaczające i wnikające weń komórki (na podstawie skanowania konfokalnego i zdjęć w mikroskopie elektronowym). Badania agregatów HUCB-NSC na szkieletach białkowych przeprowadzone za pomocą mikroskopu konfokalnego ujawniły, że w przeciągu pierwszego tygodnia hodowli w pożywce różnicującej: DMEM/F12 + ITS (1:100; Gibco) + FBS (2%; Gibco) + dbcamp ( μμ; Sigma) + RA (0,5 μμ; Sigma) + fibronektyna (10-50 µg/ml; Sigma), jedynie komórki zewnętrznej warstwy agregatu oraz komórki opuszczające agregat i migrujące po podłożu ulegają zróżnicowaniu, preferencyjnie w komórki nerwowe i ekspresjonują białka tj MAP2, TUJ, GABAAR1. Śledzenie ruchu komórek na zewnątrz agregatu w badaniach time-lapse ujawniło aktywną przebudowę połączeń neuronalnych w tworzącej się sieci. Komórki zasiedlające wewnętrzne rejony agregatu pozostają niezróżnicowane i produkują białka charakterystyczne dla neuralnych komórek macierzystych (Nestyna, NF200, GFAP), jak również utrzymują potencjał do proliferacji, co przejawia się produkcją białka Ki67. To zjawisko odpowiada ochronnemu działaniu niszy neuralnych komórek macierzystych w mózgu i może być wykorzystane zarówno do badania procesów neurogenezy jak również stwarza możliwość transplantacji gotowego fragmentu tkanki zdolnego zarówno do neurogenezy jak i regeneracji lokalnych połączeń nerwowych. P r z y k ł a d III. Świeżo izolowana frakcja komórek jednojądrzastych (CD34-) ludzkiej krwi pępowinowej (HUCB-NP) umieszczone była w pożywce pozbawionej surowicy z dodatkiem mitogenów i białka macierzy zewnątrzkomórkowej: DMEM/F12 (Gibco), B27 (1:50; Gibco), EGF (40 ng/ml; Sigma), bfgf (20 ng/ml; Sigma), heparyna (5 mg/ml; Sigma), fibronektyna (10-50 µg/ml; Sigma). Hodowle prowadzono w butelkach plastikowych (25 cm 2 ; Nunc). Do hodowli dodawano cytoszkielety keratynowe (ok. 50 sztuk/butelkę). W ciągu pierwszego dnia hodowli komórki HUCB-NP osiadają równomiernie, wielowarstwowo na całej długości cytoszkieletów. Aby zapobiec spontanicznemu osiadaniu agregatów komórki hodowano w cyklach: 12h wytrząsania na wytrząsarce orbitalnej (80RPM) - 36h hodowli statycznej. Wytrząsarka orbitalna umieszczona była w inkubatorze zapewniającym standardowe warunki hodowli (powietrze o wilgotności 95%, 5% zawartości CO 2 oraz temperaturze 37 C). Połowę pożywki hodowlanej wymieniano, co 48h. Agregaty pozostają w toni pożywki do 1 miesiąca hodowli a następnie osiadają, komórki z obrzeży agregatu różnicują się morfologicznie i rozchodzą po dnie naczynia hodowlanego. Badanie RT- PCR ekspresji genów wykazało obecność w komórkach agregatów zarówno mrna dla genów charakteryzujących komórki macierzyste na wczesnych etapach różnicowanie (Oct4, Sox2) jak również genów progenitorów neuralnych (GFAP, Nesyna). Barwienie immunocytochemiczne potwierdziło obecność białek charakterystycznych dla komórek neuralnych (Nestyna, GFAP, NF200) wewnątrz agregatu. Zastosowanie komórek macierzystych bezpośrednio po izolacji stwarza możliwość wykorzystania tej metody hodowli do wymagań indywidualnego pacjenta i transplantacji autologicznych. Referencje 1. Martin MJ, Muotri A, Gage F, Varki A Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11: Habich A, Jurga M, Markiewicz I, Lukomska B 1 Bany-Laszewicz U, Domanska-Janik K Early Appearance of Neural Progenitors in Human Cord Blood Mononuclear Cells Cultured In Vitro. Exp Hematology

5 PL B Buzanska L, Machaj EK, Zabłocka B, Pojda Z, Domanska-Janik Κ Human cord bloodderived cells attain neuronal and glial features in vitro. J Cell Sci. 15: Jurga M, Markiewicz I, Sarnowska A, Habich A, Kozłowska H, Lukomska B, Buzanska L, Domanska-Janik K Neurogenic Potential of Human Umbilical Cord Blood - Neural-like Stem Cells Depends on Their Previous Long-Term Culture Conditions. Journal of Neurosci Res 83: Griffith LG, Swartz MA. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol : Zastrzeżenia patentowe 1. Trójwymiarowy agregat komórkowy zawierający neuralne komórki macierzyste z krwi pępowinowej lub komórki powstałe w wyniku ich różnicowania oraz keratynowy materiał szkieletowy, przy czym rzeczony agregat komórkowy zawiera sieć funkcjonalnych neuronów zdolnych do komunikowania się. 2. Agregat komórkowy według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera dodatkowo co najmniej jedną substancję wybraną spośród substancji modyfikujących wzrost i różnicowanie komórek. 3. Sposób otrzymywania trójwymiarowego agregatu komórkowego, znamienny tym, że izoluje się komórki macierzyste z krwi pępowinowej lub komórki powstałe w wyniku ich różnicowania, a następnie uzyskane komórki macierzyste hoduje się w pożywce płynnej pozbawionej składników pochodzenia zwierzęcego w obecności keratynowego materiału szkieletowego, przy czym do izolowania komórek macierzystych nie stosuje się embrionów ludzkich. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako pożywkę płynną stosuje się pożywkę pozbawioną surowicy, korzystnie zawierającą także mitogeny. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że komórki macierzyste izoluje się z krwi pępowinowej. 6. Zastosowanie trójwymiarowego agregatu komórkowego określonego w zastrz. od 1 do 2 do otrzymywania funkcjonalnych zamienników tkanek. 7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że uzyskiwany materiał jest wykorzystywany do otrzymywania układów bioelektronicznych. 8. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że uzyskiwany materiał jest wykorzystywany do przeszczepów.

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)