Udział IFN-gamma i TNF-alfa w etiopatogenezie polipów nosa badania wstępne*

Transkrypt

1 Udział IFN-gamma i TNF-alfa w etiopatogenezie polipów nosa badania wstępne* Role of IFN-gamma and TNF-alpha in etiology of nasal polyps initial studies Wioletta Pietruszewska 1, Izabela Olejniczak 2, Tomasz Durko 1, Wojciech Młynarski 3 1Katedra i Klinika Otolaryngologii UM w Łodzi, Szpital Uniwersytecki im. N. Barlickiego Kierownik: prof. dr hab. med. T. Durko 2Klinika Onkologii Laryngologicznej Katedry Otolaryngologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik: prof. dr hab. med. M. Łukomski 3Zakład Immunopatologii i Genetyki, Klinika Chorób Dzieci I Katedry Pediatrii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik: prof. dr hab. med. W. Młynarski Summary Objective. Nasal polyposis is a chronic inflammatory disease of the nasal mucosa. The pathogenesis of nasal polyps is still not entirely known and has been debated for many years. The aim of the present study was to evaluate the expression of interferon gamma and TNF-alpha secreted by Th1 lymphocytes and to analyze their role in the etiology of nasal polyps. Methods. 12 patients with nasal polyposis were selected 6 of them allergic and 6 non-allergic. Patients with allergy were distinguished from those without allergy on the basis of positive allergy skin tests to dust and serum levels of IgE. Blood sample was obtained from patients and examined for the expression of IFN-gamma and TNF-alpha by intracellular staining procedure after stimulation with PMA/ionomycin and allergen. Results. Negative correlation was found between expression of IFN-gamma and TNF-alpha after PMA/ionomycin stimulation and allergen stimulation (p > 0,05). Statistical analysis of two groups of patients demonstrated that no significant differences in the cytokine expression in allergic versus non-allergic patients were observed although mean value of IFN-gamma and TNF-alpha were lower in allergic patients in comparison to non-allergic (p > 0,05). We didn t observed any correlation between expression of INF-gamma and TNF-alpha and: coexistence of bronchial asthma, allergy to aspirin and local corticosteroid treatment. In patients with recurrent polyposis the expression of INF-gamma was significantly lower (p = 0,05). Conclusion. This research suggests that IFN-gamma and TNF-alpha play a role in the pathogenesis of nasal polyps but the allergic mechanism may not play a fundamental role in this process. It needs further investigations. Hasła indeksowe: IFN-gamma, TNF-alfa, cytokiny, polipy nosa Key words: IFN-gamma, TNF-alfa, cytokines, nasal polyps Otolaryngol Pol 2008; LXII (1): by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów Chirurgów Głowy i Szyi WSTĘP Dane dotyczące polipów nosa i ich leczenia pojawiają się już w historii starożytnego Egiptu, a także w zapisach sprzed trzech tysięcy lat z Indii. Jednak nazwę polipy najprawdopodobniej wprowadzili Grecy. Pierwszym, który dokładnie opisał tę jednostkę chorobową oraz zaproponował metody leczenia, zarówno zachowawczego, jak i chirurgicznego, stosowane do XIX wieku, był Hipokrates z Kos. Patomechanizm powstawania polipów nosa nadal pozostaje kwestią sporną i istnieje wiele na *Praca finansowana z prac własnych Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów. 54 Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1

2 IFN-gamma i TNF-alfa w etiopatogenezie polipów nosa ten temat teorii. W ostatnich latach uważa się, że polipy nosa są wynikiem wielu czynników, w tym: uszkodzenia nabłonka, odczynów komórkowych i uszkodzenia autonomicznego układu nerwowego. Stwierdzono częstsze występowanie polipów nosa u chorych z całorocznym alergicznym nieżytem nosa, w tym z uczuleniem na antygeny roztocza. W patomechanizmie polipów nosa istotną rolę odgrywa proces zapalny i udział komórek immunologicznych oraz produkowanych przez nie cytokin [11, 12]. U większości chorych z polipami nosa znamienne jest mnogie występowanie eozynofilów, jednak w niektórych przypadkach są one pojedyncze [1]. Eozynofilia związana jest z nadmierną aktywacją limfocytów subpopulacji Th2 i wydzielania przez nie charakterystycznych cytokin: Il-3, Il-4, Il-5, Il-13 i GM-CSF. Rola wspominanych cytokin u chorych z polipami nosa była niejednokrotnie badana. Podkreśla się również istotny udział w patogenezie zmian przerostowych w nosie cytokin należących do subpopulacji Th1: Il-2, Il-12, Il-18, IFNgamma, TNF-alfa, badania ich dotyczące stanowią jednak pojedyncze doniesienia. Produkowane przez limfocyty Th1 interferony (IFN) stanowią grupę białek wytwarzanych przez komórki w odpowiedzi na zakażenia wirusowe lub stymulację antygenową i wykazujących różnorodną aktywność biologiczną. Naturalne interferony można uzyskać z krwinek białych (IFN-alfa), fibroblastów (IFN-beta) lub aktywowanych limfocytów (IFN-gamma). W warunkach fizjologicznych interferony wpływają na funkcję różnych komórek i mogą regulować ekspresję niektórych genów. Z tego względu mają one istotny wpływ na utrzymanie homeostazy komórkowej. Cytokiny te w największym stopniu oddziałują na procesy immunologiczne, hematopoezę i rozwój tkanek embrionalnych. Biorą one udział we wczesnej reakcji obronnej organizmu, zwłaszcza w zakażeniach wirusowych, bakteryjnych i pierwotniakowych. Interferony wykazują ponadto aktywność przeciwnowotworową, oddziałując pośrednio i bezpośrednio na komórki nowotworowe. Hamują one aktywność syntetazy 2 5 -oligoadenylowej i modulują onkogeny komórkowe, zwłaszcza C-myc, c- fos i c-h ras, a w konsekwencji wydłużają cykl komórkowy. Ponadto wywołują usunięcie metabolitów niezbędnych dla podziałów komórkowych i hamują aktywację dekarboksylazy ornitynowej [3, 7]. Interferon gamma (IFN-gamma) wywiera działanie immunomodulujące, przeciwnowotworowe, przeciwwirusowe i antyproliferacyjne. Ma on istotne znaczenie w regulacji procesów immunologicznych, gdyż zmienia fenotyp limfocytów B i stymuluje ich różnicowanie do komórek plazmatycznych wydzielających immunoglobuliny. IFNgamma indukuje powstawanie cytotoksycznych limfocytów T, aktywuje makrofagi, wywierając tym samym podobny wpływ do IL-2. Badania wykazały, że istotny w mechanizmie tworzenia polipów nosa IFN-gamma jest najczęstszym produktem komórek zapalnych: limfocytów Th i Tc. Nasila on chemotaksję i aktywację eozynofilów u chorych z polipami nosa oraz indukuje syntezę kolagenu przez fibroblasty (4). IFN-gamma uznawany jest za jeden z czynników przyczynowych i nasilających proces zapalny. Wykazuje on działanie immunomodulacyjne, hamuje syntezę przeciwciał IgE oraz proliferację i aktywność limfocytów Th2. Istnieje udowodniona doświadczalnie, odwrotna korelacja między produkcją Interleukiny-4 a IFN-gamma: obydwie te cytokiny wywierają przeciwstawne działanie na powstawanie IgE oraz inne cechy zapalenia alergicznego [6, 16]. Badania nad etiologią polipów nosa obejmują również udział czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-alfa) syntetyzowanego przez komórki Th1. TNF-alfa jest cytokiną o właściwościach immunomodulujących i przeciwnowotworowych, odgrywa również istotną rolę we wstrząsie toksycznym. Może być on wytwarzany przez neutrofile, makrofagi, limfocyty T i B, komórki Kupffera, komórki mikrogleju i astrocyty. Tym samym uczestniczy w zasadniczym ciągu zdarzeń odpowiedzialnych za kolejne etapy zapalenia, w którym cząsteczka ta o plejotropowym działaniu i właściwościach autoregulacyjnych odgrywa główną rolę indukującą. Syntezę i wydzielanie TNF-alfa stymulują głównie toksyny bakteryjne w wyniku aktywacji receptorów CD14 i CD11/18. Inhibitorem biosyntezy są natomiast glikokortykosteroidy, które mogą zapobiegać uwalnianiu TNF-alfa w następstwie zakażenia. Celem pracy była ocena ekspresji cytokin należących do subpopulacji Th1, tj. IFN-gamma i TNF-alfa oraz ich udziału w etiopatogenezie polipów nosa. MATERIAŁ I METODY Badaniami objęto 12 chorych z polipami nosa (6 kobiet i 6 mężczyzn) w wieku od 31 do 78 lat (średnia wieku: 53,08), których zakwalifikowano do leczenia operacyjnego usunięcia polipów nosa. Do badania wyodrębniono chorych z polipowatością nosa uczulonych na antygeny roztocza, ponieważ Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1 55

3 Tabela I. Charakterystyka badanej grupy chorych z polipami nosa (n = 12) Lp. IgE całk. IU/ml IgE całk. (±) Roztocza: testy skórne Astma (±) Uczulenie na NLPZ (±) Polipektomia Steroidoterapia donosowa (±) 1 14, , , , , , , , , , , , polipy w przeważającej części występują u chorych z całorocznym alergicznym nieżytem nosa. Chorych podzielono na podstawie przeprowadzonych testów skórnych i pomiaru wartości całkowitej IgE w surowicy metodą immunoenzymatyczną ELISA (zestawem Allergopharma) na 2 grupy. Pierwszą grupę stanowili chorzy z alergią, tj. z dodatnimi testami skórnymi na roztocza i wartością całkowitej IgE w surowicy przekraczającą 100 IU/ml. Drugą grupę tworzyli chorzy bez potwierdzonej alergii, wykazujący ujemne testy skórne i IgE poniżej 20 IU/ml. Cztery osoby wśród badanych stosowały przez minimum kilka miesięcy przed operacją kortykosteroidoterapię donosowo (tab. I.). Zdolność sekrecyjną limfocytów i syntezę cytokin oceniano metodą intracellular staining przez oznaczenie wewnątrzkomórkowej sekrecji IFNgamma i TNF-alfa. Komórki jednojądrzaste izolowano z krwi obwodowej przy zastosowaniu gradientu gęstości (Histo-Paque 1077) i przechowywano w warunkach głębokiego zamrożenia w ciekłym azocie (temperatura -200 st. C) w mieszaninie RPMI-1640 z dodatkiem 10% FCS i 2% DMSO. Przed przystąpieniem do badań komórki odmrażano, określano leukocytozę oraz przeżywalność limfocytów (50 70%) przy użyciu błękitu trypanu. Zawiesinę komórek limfocytów (1,5 3,5 x 10^6/ ml) badano w następujących układach: próbka niestymulowana; próbka aktywowana nieswoiście PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) i jonomycyną; próbka aktywowana swoiście antygenem roztocza. Do poszczególnych układów dodano odpowiednich przeciwciał: INF-gamma FITC lub TNF-alfa-FITC/CD69 PE/CD4 PerCp-Cy5,5 (mieszanina). Analizę wyników przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej. Ocenę statystyczną przeprowadzono testem t-studenta oraz Manna- Whitney a przy poziomie istotności p < 0,05. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetyki Uniwersytetu Medycznego w Łodzi (nr RNN/202/03/KE z dnia r.). WYNIKI W grupie chorych z polipami nosa bez alergii i z alergią na roztocza średnie stężenie IgE wynosiło odpowiednio: 31,068 i 371,556. Stwierdzono wysoce istotną zależność między wyższym stężeniem IgE u chorych z alergią w porównaniu z chorymi bez alergii (p < 0,001). W analizowanych grupach nie stwierdzono różnic między ekspresją cytokin IFN-gamma i TNF-alfa po stymulacji limfocytów: swoistej (antygenem roztoczy) i nieswoistej (PMA), a rozkład był podobny (p > 0,05). Średnie wartości syntezy IFN gamma i TNF alfa zarówno bez stymulacji, jak i po stymulacji limfocytów nieswoistej PMA i swoistej antygenem roztoczy u chorych z polipami nosa były jednak niższe w grupie z potwierdzoną alergią na roztocza w porównaniu z grupą bez alergii. Nie były to jednak zależności istotne statystycznie (p > 0,05) (tab. II). Nie obserwowano istotnych zależności między ekspresją IFN-gamma i TNF-alfa a występowaniem astmy oskrzelowej, uczuleniem na niesteroidowe leki przeciwzapalne czy stosowaniem glikokortykosteroidoterapii miejscowej. U chorych z nawrotowymi polipami nosa i koniecznością powtarzania ich usuwania poziom IFN-gamma był istotnie niższy (p = 0,05). Podobne obserwacje poczyniono w przypadku TNF-alfa, jednak zależności te nie były już znamienne (p > 0,05). 56 Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1

4 IFN-gamma i TNF-alfa w etiopatogenezie polipów nosa Tabela II. Średnie wartości syntezy IFN-gamma i TNF-alfa po stymulacji limfocytów nieswoistej PMA (1) i swoistej antygenem roztoczy (2) u chorych z polipami nosa (n = 12) 1 IFN-gamma TNF-alfa PMA(%) 1 PMA (IL) 2 PMA(%) 1 PMA (IL) 2 Kwalifikacja 34,63 2,02 21,99 2,29 Bez alergii 25,52 1,36 14,71 1,71 Alergia P = 0,585 P = 0,818 P = 0,699 P = 0,937 Porównanie między grupami bez i z alergią przy p < 0,05 2 IFN-gamma TNF-alfa Roztocza (%) 1 Roztocza (IL) 2 Roztocza(%) 1 Roztocza (IL) 2 Kwalifikacja 2,36 1,64 2,12 1,2 Bez alergii 1,67 1,32 1,94 0,87 Alergia P = 0,818 P = 0,425 P = 0,763 P = 0,310 Porównanie między grupami bez i z alergią przy p <0,05 1 % komórek, które uległy aktywowaniu 2 % komórek aktywowanych, syntetyzujących badaną cytokinę DYSKUSJA Mechanizm powstawania polipów nosa wydaje się być bardzo zróżnicowany immunologicznie, co potwierdzono w badaniach obserwując jednocześnie zwiększoną ekspresję Interleukiny-5 i IFN-gamma, tj. cytokin syntetyzowanych zarówno przez subpopulację limfocytów Th1, jak i Th2 [16]. Podobne obserwacje poczyniono we wcześniejszych badaniach własnych, w których zmiany ekspresji dotyczyły zarówno cytokin należących do subpopulacji Th1 (Il-2, IFN-gamma, TNF-alfa), jak i Th2 (Il-4, Il-13). W badaniach własnych nie stwierdzono istotnych różnic między ekspresją IFN-gamma wśród chorych bez i z alergią, mimo że IFN-gamma jest cytokiną, która wpływa na odpowiedź alergiczną. Podobne obserwacje poczyniono w przypadku TNF-alfa. Nie wykazując związku poziomu ekspresji IFN-gamma i TNF-alfa z występowaniem alergii, mechanizm alergiczny w rozwoju polipów nosa wydaje się być wątpliwy. Zbliżone wyniki uzyskali Lezcano-Meza i wsp., którzy obserwowali podobną ekspresję IFN-gamma w dwóch badanych grupach chorych, tj. bez i z alergią. Potwierdzili oni także istotny udział tej cytokiny w patogenezie polipów nosa przez syntezę eotaxyny 2/CCL24, będącej chemoatraktantem dla eozynofilów [9]. Wzmożoną ekspresję IFN-gamma, zarówno u alergików, jak i chorych bez alergii, stwierdzili Lee i wsp. Badanie wskazuje na udział IFN-gamma w patogenezie polipów nosa, jednak jednoznacznie nie podkreśla tła alergicznego [8]. Podobne wyniki uzyskali Bernstein i wsp., którzy u chorych z polipami nosa stwierdzili ekspresję cytokin należących do subpopulacji Th1 i Th2, bez istotnych różnic u chorych bez i z alergią [2]. Z drugiej strony istnieją badania wskazujące na podłoże alergiczne polipów nosa i udział IFN-gamma w tym mechanizmie. Przebadano 17 chorych z alergicznym nieżytem nosa, stwierdzając istotnie zmniejszoną ekspresję IFN-gamma u chorych z alergią w porównaniu z chorymi z ujemnymi testami skórnymi i prawidłowym poziomem IgE w surowicy krwi [2]. Podobne wyniki uzyskali Hamilos i wsp., którzy także stwierdzili różnicę w ekspresji IFNgamma, porównując grupę chorych bez i z alergią [5]. W polipach nosa stwierdzono wyższą ekspresję IFN-gamma w porównaniu z Il-4 i Il-5, co wskazuje na istotną rolę tej cytokiny w rozwoju tworów polipowatych w jamach nosa i zatok [10]. W badaniach własnych nie obserwowano takiej zależności. Działanie IFN-gamma okazuje się jednak znacznie bardziej złożone, o czym może świadczyć jego udział w zaostrzeniu astmy lub jej inicjacji po zakażeniu wirusowym [6]. IFN-gamma przez aktywację eozynofilów i makrofagów w odpowiedzi immunologicznej wydaje się regulować proces zapalny. W badaniach Dellacono i wsp. wzrost ekspresji IFN-gamma w polipach nosa korelował z nasileniem objawów klinicznych u tych chorych oraz częstszą liczbą polipektomii w wywiadzie [4]. W badaniach własnych oraz Scavuzzo i wsp. [13] otrzymano wyniki przeciwstawne. Wskazuje to jedynie na udział IFN-gamma w przewlekłej fazie zapalenia, ale nie pomaga w jednoznacznym wyjaśnieniu, jaką rolę odgrywa tu IFN-gamma. TNF-alfa działa na komórki efektorowe przez swoiste, dokładnie scharakteryzowane receptory, które określa się ze względu na ich ciężar czą- Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1 57

5 steczkowy jako p55 i p75 TNF. Mechanizm bezpośredniego działania cytotoksycznego TNF-alfa na wrażliwe komórki nie został w pełni wyjaśniony; sądzi się, że przez fosfolipazę A2 uruchamia on przemiany kwasu arachidonowego w komórce i produkcję wewnątrzkomórkowych rodników hydroksylowych. Równocześnie wzmaga ekspresję na komórkach śródbłonka cząsteczek adhezyjnych, które są odpowiedzialne za interakcje krwinek białych z odpowiednimi komórkami śródbłonka, umożliwiając ich przyleganie, a następnie diapedezę [7, 12]. TNF-alfa, podobnie jak IFN-gamma, aktywuje komórki eozynofilowe. Wykazano obecność receptorów dla TNF-alfa na eozynofilach i atywację przez TNF-alfa procesu, którego efektem jest synteza GM-CSF, działającego na eozynofile w sposób autokrynny i wydłużającego czas ich przeżycia [15]. W przeprowadzonym badaniu stwierdzono ekspresję TNF-alfa nie wykazując istotnej różnicy między grupą chorych bez i z alergią. Udział TNF-alfa w patogenezie polipów nosa stwierdzili Silvestri i wsp., dodatkowo opisując wpływ TNFalfa na zwiększoną ekspresję ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) na fibroblastach [14]. Wykazano udział IFN-gamma i TNF-alfa w patomechanizmie powstawania polipów nosa. Jednak wyniki badań własnych i innych autorów nie pozwalają na jednoznaczne stwierdzenie, który z czynników w patogenezie powstawania polipów nosa ma większe znaczenie. Wydaje się, że wieloczynnikowa przyczyna jest najbardziej prawdopodobna, a związane z nią złożone mechanizmy immunologiczne, warunki mikrośrodowiskowe do rozwoju polipów nosa oraz indywidualna predyspozycja chorego utrudnia wysunięcie jednoznacznych wniosków. PIŚMIENNICTWO 01. Bateman N, Fahy C, Woolford T. Nasal polyps: still more questions than answers. The J Laryngol Otol 2003; 117(1): Bernstein JM, Ballow M, Rich G, i wsp. Lymphocyte subpopulations and cytokines in nasal polyps: is there a local immune system in the nasal polyp? Otolaryngol Head Neck Surg 2004; 130(5): Bufe A, Gehlhar K, Grage-Griebenow E., i wsp. Atopic phenotype in children is associated with decreased virusinduced interferon-alpha release. Int Arch Allergy Immunol 2002; 127(1): Dellacono FR, Eisma R, Lafreniere D, i wsp. Interferon gamma expression in human nasal polyps. Laryngoscope 1997; 107(5): Hamilos DL, Leung DY, Wood R, i wsp. Evidence for distinct cytokine expression in allergic versus non-allergic chronic sinusitis. J Allergy Clin Immunol 1995; 96(4): Krasnowska M, Mędrala W. Wpływ IFN-gamma na produkcję leukotrienu C4 przez leukocyty krwi obwodowej chorych na przewlekły alergiczny nieżyt nosa badania in vitro. Pneumonol Alergol Pol 2003; 71(5/6): Kowalski ML. Odpowiedź immunologiczna; Kliniczne postacie alergii atopowej. W: Immunologia kliniczna PWN 2000; 1(32), Lee CH, Rhee CS, Min YG. Cytokine gene expression in nasal polyps. Ann Otol Rhinol Laryngol 1998; 107(8): Lezcano-Meza D, Davila-Davila B, Vega-Miranda A, i wsp. Interleukin-4 and to a lesser extent either Il-13 or interferongamma regulate the production of eotaxin-2/ccl24 in nasal polyps. Allergy 2003; 58(10): Min YG, Lee CH, Rhee CS, i wsp. Inflammatory cytokine ekspression on nasal polyps developed in allergic and infectious rhinitis. Acta Otolaryngol 1997; 117(2): Pawliczak R, Lewandowska-Polak A, Kowalski ML. Pathogenesis of nasal polyps: an update. Curr Allergy Asthma Rep 2005; 5(6): Sanchez-Segura A, Brieva JA, Rodriguez C. T lymphocytes that infiltrate nasal polyps have a specialized phenotype and produce a mixed Th1/Th2 pattern of cytokines. J Allergy and Clin Immunol 1998; 102(6): Scavuzzo MC, Fattori B, Ruffoli R, Giannessi F. Inflammatory mediators and eosinophilia in atopic and non-atopic patients with nasal polyposis. Biomed Pharmacother 2005; 59(6): Silvestri M, Sabatini F, Scarso L, i wsp.: Fluticasone propionate downregulates nasal fibroblast functions involved in airway inflammation and remodeling. Int Arch Allergy Immunol 2002; 128(1): Temkin V, Levi-Schaffer F. Mechanism of Tumour Necrosis Factor Alpha mediated eosinophil survival. Cytokine 2001; 15(1): Wosińska-Becler K, Plewako H, Hakansson L, i wsp. Cytokine production in peripheral blood cells during and outside the pollen season in birch-allergic patients and non-allergic controls. Clin Exp Allergy 2004; 34(1): Adres autora: ul. Kopcińskiego Łódź Pracę nadesłano: r. 58 Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1