Załącznik 2 Autoreferat w języku polskim

Transkrypt

1 Załącznik 2 Autoreferat w języku polskim

2 dr Rafał Sądej Zakład Enzymologii Molekularnej Katedra Biotechnologii Medycznej Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii Uniwersytet Gdański i Gdański Uniwersytet Medyczny Gdańsk 2015

3 1. Imię i nazwisko: Rafał Sądej 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej doktor nauk biologicznych w dyscyplinie biochemia, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego w Gdańsku, tytuł rozprawy doktorskiej: Rola ekto-5`-nukleotydazy w procesach adhezji i migracji komórek czerniaka 2001 magister biotechnologii, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego w Gdańsku, tytuł pracy magisterskiej: Nadprodukcja i oczyszczanie czynnika martwicy nowotworu oraz jego wpływ na wzrost linii komórkowej czerniaka Ma 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/artystycznych. od (aktualnie), adiunkt, Zakład Enzymologii Molekularnej, Katedra Biotechnologii Medycznej, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG-GUMed , postdoctoral research fellow, University of Birmingham, Institute for Cancer Studies, Birmingham, Wielka Brytania , asystent, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG-GUMed, Katedra Biotechnologii Medycznej (1 lutego 2007 do 31 grudnia 2009 bezpłatny urlop naukowy) , assistant scientist, Lineberger Comprehensive Cancer Centre, University of North Carolina, Chapel Hill, USA , doktorant Studium Doktoranckiego Chemii i Biochemii, Wydział Chemii UG 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) Osiągnięcie naukowe wynikające z art. 16 ust 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki stanowi cykl 5 powiązanych tematycznie publikacji dotyczących znaczenia białka CD151 w progresji nowotworowej. Cykl zawiera 4 prace oryginalne i 1 przeglądową. Prace te zostały opublikowane w latach Sumaryczna wartość współczynnika IF prac składających się na osiągnięcie wynosi 26,428 a łączna liczba punktów MNiSW wynosi

4 a) tytuł osiągnięcia naukowego/artystycznego: ANALIZA ROLI TETRASPANINY CD151 W PROGRESJI NOWOTWOROWEJ OPIS MOLEKULARNEGO MECHANIZMU DZIAŁANIA I ZNACZENIA PROGNOSTYCZNEGO U CHORYCH NA RAKA PIERSI b) publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego (autorzy, tytuły publikacji, nazwa wydawnictwa, rok wydania): 4.1. Baldwin G, Novitskaya V, Sadej R, Pochec E, Litynska A, Hartmann C, Williams J, Ashman L, Eble JA, Berditchevski F. Tetraspanin CD151 regulates glycosylation of alpha3 beta1 integrin. J Biol Chem 2008; 283: IF 5,52, MNiSW 24, Q1, liczba cytowań: 35. Udział w pracy: 20% Sadej R, Romanska H, Baldwin G, Gkirtzimanaki K, Novitskaya V, Filer AD, Krcova Z, Kusinska R, Ehrmann J, Buckley CD, Kordek R, Potemski P, Eliopoulos AG, Lalani E, Berditchevski F. CD151 regulates tumourigenesis by modulating the communication between tumour cells and endothelium. Mol Cancer Res 2009; 7: IF 4,162, MNiSW 32, Q1, liczba cytowań: 53. Udział w pracy: 60% Sadej R, Romanska H, Kavanagh D, Baldwin G, Takahashi T, Kalia N, Berditchevski F. Tetraspanin CD151 regulates transforming growth factor signaling: implication in tumour metastasis. Cancer Res 2010; 70: IF 8,234, MNiSW 32, Q1, liczba cytowań: 37. Udział w pracy: 75% Sadej R, Grudowska A, Turczyk L, Kordek R, Romanska HM. CD151 in cancer progression and metastasis a complex scenario. Lab Invest 2014; 94: IF 3,676, MNiSW 40, Q1, liczba cytowań: 12. Udział w pracy: 40%. autor korespondencyjny 4.5. Romanska HM, Potemski P, Krakowska M, Mieszkowska M, Chaudhri S, Kordek R, Kubiak R, Speirs V, Hanby AM, Sadej R, Berditchevski F. Lack of CD151/integrin complex is predictive of poor outcome in node negative lobular breast carcinoma: opposing roles of CD151 in invasive lobular and ductal breast cancers. Brit J Cancer 2015;113: IF* 4,836, MNiSW 35, Q1, liczba cytowań: 0. Udział w pracy: 20%. autor korespondencyjny Sumaryczny IF wszystkich prac: 26,428 Łączna liczba punktów MNiSW: 163 Łączna liczba cytowań: 137 (10 grudnia 2015) Q1 pierwszy kwartyl w JCR * ze względu na jeszcze nie określoną wartość IF dla roku 2015 podano wartość współczynnika za rok

5 Oświadczenia współautorów publikacji określające ich indywidualny wkład w powstanie poszczególnych publikacji zamieszczono w załączniku nr 7. Oświadczenia habilitanta dotyczące wykonanych prac oraz procentowego w nich udziału znajdują się w załączniku nr 4. W pracach zawarto wyniki uzyskane podczas realizacji 4 projektów badawczych: a) Cancer Research UK (C1322/A5705), CD151 in breast cancer progression grant dla dr. F. Berditchevskiego b) FNP (HOMING PLUS/2010-2/12), projekt Homing Plus, The role of tetraspanin CD151 in cancer cells migration and invasion implications for tumour prognostication grant dla dr. R. Sądeja c) NCN (2013/09/B/NZ4/02512), projekt Opus, Analiza profilu morfologicznego i molekularnego cech inwazyjności raków przewodowych - znaczenie prognostyczne grant dla dr Hanny Romańskiej d) NCN (2012/06/M/NZ3/00023), projekt Harmonia, Udział tetraspaniny CD151 w regulacji funkcji FGFR2 w progresji raka piersi - analiza in vitro, w modelu mysim oraz materiale klinicznym grant dla dr. Rafała Sądeja W projektach a i c pełniłem rolę wykonawcy, w projektach b i d pełniłem funkcję kierownika grantu. c) Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania: Rodzina tetraspanin (TM4SF, ang. Transmembrane-4 Superfamily) to grupa 33 białek błonowych o masie molekularnej kda i unikalnej strukturze. Zbudowane są one z dwóch krótkich fragmentów cytoplazmatycznych oraz dwóch domen zewnątrzkomórkowych, tj. pętli większej (LEL, ang. Large Extracellular Loop) i pętli mniejszej (SEL, ang. Small Extracellular Loop), oflankowanych czterema hydrofobowymi fragmentami przezbłonowymi. W obrębie pętli większej znajduje się, występująca u wszystkich tetraspanin, konserwatywna sekwencja aminokwasów cysteina-cysteina-glicyna z mostkami dwusiarczkowymi pomiędzy resztami cysteiny [1, 2]. We fragmencie C- terminalnym zlokalizowane są natomiast ulegające palmitylacji reszty cysteinowe. Efektem tego procesu jest stosunkowo wysoka hydrofobowości tetraspanin, a w konsekwencji ich grupowanie w obrębie błony komórkowej i wzrost powinowactwa do innych białek [1]. Tetraspaniny mają zdolność do interakcji o charakterze homotypowym (tetraspanina - tetraspanina) i heterotypowym (tetraspanina - inne białko). W efekcie, w obrębie błony powstają bogate w cholesterol ugrupowania tetraspanin i oddziałujących z nimi białek 4

6 5 Autoreferat określane jako mikrodomeny bogate w tetraspaniny (TEM, ang. Tetraspanin-Enriched Microdomains). Uważa się, że poprzez miejscowe zagęszczanie receptorów komórkowych i ich efektorów w obrębie tych struktur błony komórkowej, tetraspaniny regulują i wzmacniają efektywność sygnalizacji komórkowej [1, 3, 4]. Tetraspaniny eksprymowane są prawie we wszystkich typach komórek zwierzęcych. Niektóre występują głównie w błonie plazmatycznej komórki (np. CD151, CD9, CD81) inne natomiast w dużym stopniu zlokalizowane są w wewnątrzkomórkowych pęcherzykach endo- i egzosomów (np. CD63) [3, 5]. Tetraspaniny biorą udział w wielu procesach fizjologicznych (fuzja gamet, morfogeneza, różnicowanie tkanek), a także przyczyniają się do rozwoju stanów patologicznych (np. karcynogenezy) [6]. CD151 (PETA-3, SFA-3) to chronologicznie pierwsza tetraspanina, której funkcja została powiązana z procesem nowotworowym [7]. Cykl publikacji prezentowanych jako osiągnięcie habilitacyjne to wynik blisko siedmioletnich badań skupiających się na analizie roli CD151 w progresji nowotworowej. Szczególny nacisk położono na sprecyzowanie mechanizmu molekularnego udziału CD151 w rozwoju choroby i znaczenia prognostycznego tej tetraspaniny u chorych na raka gruczołu piersiowego (BCa, ang. Breast Carcinoma). CD151 posiada unikalną, nie występującą pośród innych tetraspanin cechę zdolność do tworzenia silnych i trwałych kompleksów ze wszystkimi integrynami wiążącymi lamininę (tj. α3β1, α6β4, α6β1 oraz α7β1). Uważa się, że CD151 poprzez regulację funkcji tych receptorów wpływa na zachowania post-adhezyjne komórek (rozpłaszczanie, migrację) [8]. W pracy otwierającej cykl habilitacyjny (4.1) badano udział CD151 w glikozylacji integryny α3β1 oraz konsekwencje tego procesu dla zachowania komórek. W tym celu wyprowadzono warianty linii komórkowych MDA-MB-231 (rak piersi) i HeLa (rak szyjki macicy) z wyciszoną (przy pomocy letiwirusowego transferu odpowiedniego shrna) ekspresją CD151. Wysoka efektywność knock-down u została potwierdzona przy pomocy analizy western-blotting i cytometrii przepływowej. Jednocześnie nie zaobserwowano CD151-zależnych zmian w poziomie ekspresji genów integryn α3, α6 i β1 (analizowanych poprzez obecność w błonie plazmatycznej jak i całkowitej puli komórkowej danego białka). Stwierdzono natomiast, że integryna α3, a szczególnie jej łańcuch lekki, migruje wolniej w trakcie rozdziału elektroforetycznego lizatu komórek CD151-negatywnych. Dzięki zastosowaniu szeregu inhibitorów poszczególnych etapów glikozylacji (N-glikonazy, endoglikozydazy H, swainsoniny) wykazano, że CD151 reguluje glikozylację integryny α3β1 na relatywnie wczesnych etapach wiązania jednostek cukrowych z cząsteczką białka. Udział CD151 w procesie glikozylacji wydaje się być bardzo specyficzny wobec wspomnianej

7 6 Autoreferat integryny. Wyciszenie ekspresji genu CD151 nie zmienia bowiem profilu glikozylacji innych składników TEM np. CD63, CD82 i integryny α6 (partnerów molekularnych CD151). Z drugiej strony knock-down innych tetraspanin CD9, CD81 i CD63 nie wpływał na glikozylację integryny α3. Immunoprecypitacja integryny α3 z lizatów CD151-pozytywnych vs. CD151-negatywnych komórek raka piersi, a następnie analiza interakcji tej integryny z panelem różnych lektyn (wiążących się z konkretnymi resztami cukrowymi) wykazała, że CD151 reguluje fukozylację i rozbudowę łańcuchów bocznych począwszy od N- acetyloglukozoaminy. Do dalszych badań wyprowadzono szereg wariantów linii komórkowej MDA-MB-231: i) z mutantami CD151 w obrębie fragmentu C-terminalnego i ii) N- terminalnego, iii) CD151 nieulegającym palmitylacji, iv) CD151 nieulegającym glikozylacji i v) CD151 ze zmienioną sekwencją QRD (odpowiedzialną za interakcję z integrynami). Stwierdzono, że do regulacji glikozylacji integryny α3 niezbędna jest nie tylko funkcjonalna większa pętla CD151 ale również właściwa palmitylacja i glikozylacja samej tetraspaniny (odpowiedzialne za kompartmentalizację i lokalizację CD151 w obrębie TEM). Wcześniejsze dane wykazały, że palmitylacja CD151 nie jest konieczna dla formowania kompleksu CD151- α3β1 (powstającego na stosunkowo wczesnych etapach dojrzewania tych białek), aczkolwiek proces ten umożliwia zachodzące już w aparacie Golgiego włączenie CD151-α3β1 do TEM [9]. Można więc przypuszczać, że CD151 rekrutuje integrynę α3β1 do domen bogatych w tetraspaniny, funkcjonujących w tym przypadku jako pewnego rodzaju platformy, w obrębie których regulowany jest proces glikozylacji. Dokładny CD151-zależny mechanizm regulacji glikozylacji integryny α3 nie jest jednak do końca zbadany. Z pewnością należałoby sprawdzić czy CD151 wpływa na funkcjonowanie bądź lokalizację glikozylotraferaz specyficznych dla integryny α3. Modyfikacje cukrowe receptorów adhezyjnych (np. integryn) odgrywają znaczącą rolę w przyjęciu konformacji niezbędnej dla prawidłowego rozpoznania liganda. Obserwowane w trakcie progresji nowotworowej zmiany w profilu glikozylacji integryn istotnie wpływają na procesy adhezji i migracji komórki [10]. Znaczenie CD151 dla ruchu komórki było wcześniej badane głównie pod kątem CD151-zależnej regulacji sygnalizacji przez integryny wiążące lamininę lub ich endocytozy i sortowania [11, 12]. W omawianej pracy (4.1) po raz pierwszy wykazano, że CD151 bierze udział w migracji komórkowej poprzez regulację glikozylacji integryny α3β1. Wyciszenie ekspresji CD151, a w konsekwencji zaburzona glikozylacja integryny α3 miały drastyczny wpływ na potencjał migracyjny komórek (redukcja o blisko 90%) na podłożu opłaszczonym specyficznym ligandem dla tej integryny - lamininą-332. Wspomnieć należy, że laminina-332 jest jednym ze składników błony podstawnej naczyń

8 7 Autoreferat krwionośnych. Możliwe jest więc, że CD151 poprzez regulację glikozylacji integryny α3, a w konsekwencji migracji komórek, wpływa na proces inwazji ściany naczyń krwionośnych i metastazę. Hipotezę tę potwierdza opublikowana w tym samym roku praca prezentująca udział CD151 w intrawazacji in vivo [13]. W kolejnej publikacji cyklu (4.2) skupiono się bezpośrednio na znaczeniu tetraspaniny CD151 w progresji raka piersi. Przeprowadzone analizy kliniczne wykazały, że CD151 jest negatywnym czynnikiem prognostycznym dla chorych z BCa. W badanej grupie, pacjenci z guzami CD151-pozytywnymi mieli ok. 3,44 razy większe ryzyko śmierci niż pacjenci CD151-negatywni. Ponadto występowanie CD151 korelowało z obecnością przerzutów do węzłów chłonnych. Aby wyjaśnić mechanizm udziału CD151 w rozwoju raka piersi przeprowadzono szereg doświadczeń in vivo i in vitro. Obserwacje wzrostu linii komórkowych MDA-MB-231 CD151(+) vs. CD151(-) ( knock-down CD151) w modelu mysim wykazały blisko dwukrotną redukcję wielkości guza w przypadku komórek CD151-negatywnych. Analizy immunohistochemiczne uwidoczniły intensywny stan zapalny i wyższy indeks proliferacyjny (Ki67) guzów powstałych w wyniku iniekcji komórek CD151(+). Mimo braku różnic w całkowitej gęstości unaczynienia pomiędzy dwoma typami ksenograftów, guzy eksprymujące CD151 posiadały wyraźnie gęstszą siatkę naczyń krwionośnych na granicy z sąsiadującą tkanką podskórną myszy. W celu wyjaśnienia w jaki sposób CD151 promuje rozwój guza, komórki MDA-MB- 231 CD151(+) vs. CD151(-) hodowano w trójwymiarowym kolagenie typu I i matrigelu. Kolagen typu I jest najpowszechniejszym białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM, ang. Extracellular Matrix) eksprymowanym w gruczole piersiowym [14]. Z kolei matrigel to mieszanina białek imitująca błonę podstawną guza i stanowiąca bardzo dobre środowisko do badania inwazji komórek. Trójwymiarowe hodowle w tego typu układach stosunkowo dobrze odzwierciedlają więc warunki panujące in vivo. W związku z tym, pewną niespodzianką okazał się zaobserwowany brak CD151-zależnych różnic w wielkości formowanych kolonii i charakterze ich wzrostu w hodowlach 3D. Zdecydowano się więc spojrzeć na układ eksperymentalny nieco szerzej. Guz nie jest przecież środowiskiem homogennym składającym się jedynie z komórek nowotworowych i białek ECM. Powszechnie obecne są w nim fibroblasty, komórki endotelialne czy makrofagi. Pod uwagę wzięto możliwość udziału CD151 w komunikacji komórki nowotworowej z mikrośrodowiskiem guza, co w konsekwencji promowałoby jego wzrost. Komórki raka piersi hodowano więc w obecności pierwotnych fibroblastów lub komórek endotelialnych (HUVEC, ang. Human Umbilical Vein

9 8 Autoreferat Endothelial Cells). Okazało się, że obecność CD151 promuje wzrost i inwazję komórek MDA- MB-231 w odpowiedzi na sygnał pochodzący jedynie ze śródbłonka. Prawdopodobnie CD151 reguluje funkcje receptora dla niezidentyfikowanego w tej pracy czynnika wzrostu produkowanego przez endotelium. Analiza sygnalizacji komórkowej inicjowanej przez medium kondycjonowane przez komórki śródbłonka wykazała, że wyciszenie ekspresji genu CD151 skutkowało mniej dynamiczną aktywacją kinaz Erk1/2 i Src. Zastosowanie specyficznych inhibitorów wymienionych kinaz skutkowało zahamowaniem CD151-zależnego wzrostu w odpowiedzi na potencjalny/e czynnik/i wzrostu produkowane przez HUVEC. W omawianej pracy podjęto również próbę sprecyzowania udziału integryn wiążących lamininę (partnerzy molekularni CD151) w komunikacji z komórkami śródbłonka. Ko-kultury komórek endotelialnych z wariantami komórek nowotworowych z CD151 zmutowanym w obrębie sekwencji QRD (a w konsekwencji brak interakcji CD151 z integrynami), wyciszoną ekspresją integryny α3 lub β4 wykazały, że każda z tych manipulacji znosiła pro-wzrostowy i pro-inwazyjny wpływ komórek HUVEC. Można więc wnioskować, że CD151 jedynie w kompleksie z α3β1 i α6β4 integrynami pośredniczy w komunikacji z komórkami śródbłonka. Powyższe obserwacje z doświadczeń in vitro z dużym prawdopodobieństwem wyjaśniają CD151-zależne różnice w wielkości i unaczynieniu guzów w doświadczeniach in vivo. Kolejna praca cyklu (4.3) była kontynuacją wcześniejszych pionierskich badań nad udziałem CD151 w komunikacji z mikrośrodowiskiem guza. Podjęto próbę identyfikacji promującego progresję BCa czynnika wzrostu, którego odpowiedź regulowana jest przez CD151 w komórkach nowotworowych. Przeanalizowano wpływ 10 czynników wzrostu/chemokin powiązanych uprzednio z rozwojem choroby (PDGF, hb-egf, EGF, bfgf, SDF-1, TGFα, HGF, TGFβ1, IGF-1, IL-1) na CD151-regulowany typ wzrostu komórek MDA-MB-231 w matrigelu. Zaobserwowano, że suplementacja pożywki TGFβ1 (ang. Transforming Growth Factor-β1) silnie promowała proliferację komórek i inwazję otaczającego ECM. Efekt ten był prawie całkowicie znoszony w wyniku knock-down -u genu CD151. Zastosowanie linii komórkowych z wyciszoną ekspresją poszczególnych integryn wiążących lamininę lub linii eksprymującej nieulegające palmitylacji CD151 pozwoliło stwierdzić, że w pośredniczeniu sygnału inicjowanego przez TGFβ1 niezbędny jest kompleks CD151/integryny wiążące lamininę (a nie sama tetraspanina CD151). Z drugiej strony warunkowana przez palmitylację lokalizacja CD151 w obrębie TEM (a więc oddziaływanie z innymi tetraspaninami) nie jest niezbędna dla obserwowanych efektów TGFβ1.

10 9 Autoreferat Transformujący czynnik wzrostu wiążąc się do swoistego receptora (TGFβ1R) inicjuje dwa typy kaskad sygnalizacyjnych: zależną i niezależną (obejmującą ścieżki PI3K/AKT i MAPK) od białek SMAD. Analiza aktywacji poszczególnych mediatorów sygnalizacji od TGFβ1 w komórkach CD151(+) vs. CD151(-) nie wykazała żadnych regulowanych przez CD151 różnic obejmujących fosforylację białek SMAD. Zaobserwowano natomiast, że wyciszenie ekspresji CD151 zmieniało kinetykę TGFβ1-inicjowanej aktywacji kinazy p38. Efekt ten widoczny był zarówno w przypadku krótkich (do 60 min) jak i długich (1-48h) stymulacji przez TGFβ1. Można więc sądzić, że CD151 uczestniczy zarówno w szybkich (np. migracji) jak i odległych w czasie (np. regulacji ekspresji genów) efektach komórkowych promowanych przez TGFβ1 obejmujących aktywność p38. Progresja raka piersi związana jest z powstawaniem przerzutów głównie w obrębie płuc i układu kostno-szkieletowego. Naturalnym, w toku badań nad rolą CD151 w BCa, wydawało się więc określenie udziału tej tetraspaniny w procesie metastazy. Co ważne, we wcześniejszych pracach udokumentowano kluczowy udział TGFβ1 w eksperymentalnym modelu powstawania przerzutów raka piersi do płuc [15]. W wykonanych przez nas doświadczeniach myszom bezgrasiczym podano poprzez żyłę ogonową komórki MDA-MB- 231 CD151(+) vs. CD151(-). Osiem tygodni po iniekcji, płuca zwierząt poddano analizie oceniającej powstałe przerzuty. Okazało się, że zarówno liczba jak i wielkość przerzutów pochodzących od linii CD151-negatywnej są znacznie zredukowane (o ok. 75%). Dzięki zastosowaniu mikroskopii przeżyciowej w czasie rzeczywistym, możliwa była obserwacja zachowania badanych komórek w płucach bezpośrednio po iniekcji. Stwierdzono, że brak CD151 zmniejsza (o ok. 25%) liczbę komórek zatrzymujących się w naczyniach włosowatych płuc (ang. cells homing). Obserwacja ta prawdopodobnie tłumaczy zaobserwowane różnice w liczbie przerzutów w doświadczeniach in vivo. Wydaje się, że CD151 faktycznie odgrywa rolę w zagnieżdżaniu się komórek nowotworowych specyficznie w płucach. Kontrolna analiza tego procesu w wątrobie nie wykazała bowiem żadnych różnic CD151-zależnych. Aby wyjaśnić mechanizm udziału CD151 w metastazie raka piersi do płuc, podjęto próbę odtworzenia mikrośrodowiska tego organu. Prowadzono więc ko-hodowle komórek MDA-MB-231 CD151(+) vs. CD151(-) z ludzkimi pneumocytami w trójwymiarowym matrigelu. Zauważono, że obecność pneumocytów intensywnie promuje fenotyp inwazyjny ale tylko w komórkach eksprymujących CD151. Ponadto efekt ten był niemal całkowicie znoszony poprzez wprowadzenie do układu eksperymentalnego specyficznego inhibitora receptora TGFβ1 (SB431542). Wydaje się więc, że pneumocyty produkując TGFβ1 promują CD151-zależne zachowania inwazyjne komórek raka piersi.

11 10 Autoreferat W latach ukazało się kilka prac (włączając publikację 4.2) jednoznacznie prezentujących CD151 jako negatywny czynnik rokowniczy u chorych z BCa [16-19]. Należy zaznaczyć, że CD151 i jego kompleks z integryną α3β1 w zdecydowanej większości badanych nowotworów odrywa rolę promującą rozwój choroby. Istnieją jednak doniesienia wskazujące na odmienną hamującą progresję nowotworową rolę CD151 i integryny α3β1 [20-22]. W zasadzie wszystkie dostępne dane dotyczące udziału CD151 w progresji raka piersi uzyskane były z doświadczeń in vitro, in vivo i badań klinicznych skupiających się na inwazyjnym przewodowym raku piersi (IDC, ang. Invasive Ductal Carcinoma). Szacuje się jednak, że ok % ogółu nowotworów gruczołu piersiowego stanowi tzw. rak zrazikowy (ILC, ang. Invasive Lobular Carcinoma). Badania profilu transkryptomicznego dla białek związanych z adhezją, sygnalizacją komórka-komórka i procesem metastazy sugerują, że rak przewodowy i rak zrazikowy to dwie niezależne i różne od siebie choroby [23]. Znaczenie prognostyczne i udział CD151 w rozwoju i progresji ILC nie były jak dotąd badane. W związku z tym w ostatniej eksperymentalnej pracy cyklu (4.5) podjęto próbę porównania oceny ekspresji CD151, integryny α3β1 oraz kompleksu CD151/α3β1 na tle innych parametrów patologicznych pomiędzy zrazikowym (117 pacjentów) a przewodowym rakiem piersi (182 pacjentów). Zaobserwowano, że w ILC (w przeciwieństwie do IDC) ekspresja genu integryny α3β1 nie korelowała z żadnym z klasycznych parametrów klinicznych (rozmiarem i zróżnicowaniem guza, występowaniem przerzutów w obrębie węzłów chłonnych, zaawansowaniem choroby, ekspresją ERBB2 i ER/PR). Z drugiej strony ekspresja CD151 korelowała odwrotnie z wielkością guza i stopniem zaawansowana choroby (w IDC CD151 korelował pozytywnie z niskim zróżnicowaniem guza, zaawansowaniem choroby i ekspresją ERBB2) sugerując, że w przypadku raka zrazikowego CD151 raczej hamuje niż promuje proliferację komórek nowotworowych i rozwój choroby. Analiza ekspresji kompleksu CD151/α3β1 wykazała z kolei, że współobecność obu białek sprzyja odróżnicowaniu się tkanki nowotworowej, co pozwala przypuszczać że CD151 działając tylko wspólnie z integryną α3β1 sprzyja pojawieniu się cech anaplastycznych. Wspomnieć należy, że w przypadku IDC występowanie kompleksu CD151/α3β1 nie korelowało z żadną z rutynowo określanych cech kliniko-patologicznych. Powyższe dane w zasadzie jednoznacznie wskazują na odrębną rolę CD151 i jego kompleksu z integryną α3β1 w patologii tych dwóch histologicznie odrębnych raków piersi. Wykazano również, że CD151, α3β1 integryna i kompleks tych białek nie mają istotnej statystycznie wartości prognostycznej (HR, ang. Hazard Ratio) dla chorych ze zrazikowym rakiem piersi. Co ciekawe, nie posiadał jej również

12 11 Autoreferat żaden z rutynowo stosowanych rokowniczych parametrów klinicznych (wielkość guza, status węzłów chłonnych czy ekspresja HER2). W analizowanej grupie porównawczej raka przewodowego, pacjenci CD151-pozytywni charakteryzowali się natomiast 1,88 razy większym ryzykiem śmierci niż pacjenci CD151-negatywni. Ponieważ kompleks CD151/integryna α3β1 bierze udział w inwazji komórek raka piersi [17, 19, 24], dalszą analizę jego roli w ILC prowadzono porównując pacjentów z różnym statusem węzłów chłonnych. Pomimo braku istotnego statystycznie znaczenia prognostycznego badanych białek (zarówno indywidualnie jak i w kompleksie) obserwowany był pewien trend. Niezależna ekspresja CD151 i integryny α3 wydawała się być wyznacznikiem dobrego rokowania choroby u pacjentów N(-), tj. bez przerzutów do węzłów chłonnych. Co ciekawe, występowanie kompleksu CD151/α3 nie przyczyniało się do wzrostu siły i istotności statystycznej odnotowanej tendencji. W związku z tym dalsze analizy zawężono skupiając się na grupie pacjentów N(-). Okazało się, że w tym przypadku zaobserwowano istotne statystycznie korelacje pomiędzy: i) ekspresją CD151 i α3β1, ii) CD151 i wielkością guza, iii) ekspresją kompleksu CD151/α3β1 a zróżnicowaniem guza. Co istotne, brak ekspresji CD151/α3β1 w przypadku pacjentów N(-) okazał się stosunkowo silnym (HR=3,12, p=0,034) negatywnym czynnikiem rokowniczym. Okres 5-cio letniego przeżycia dla pacjentów CD151/α3β1-negatywnych vs. reszta grupy wynosił odpowiednio 64% i 91%. Należy również podkreślić, że żaden z analizowanych, rutynowo stosowanych w diagnostyce/prognozie raka piersi parametrów nie miał wartości prognostycznych dla tej podgrupy ILC. Podsumowując, praca ta jednoznacznie potwierdza różnice w biologii inwazyjnego przewodowego i zrazikowego raka piersi. Wyraźnie widoczna jest również odrębna rola CD151 i jego kompleksu z integryną α3β1 pomiędzy dwoma badanymi podtypami BCa. Wydaje się, że ocena poziomu występowania kompleksu CD151/α3β1 może dostarczyć istotnych informacji prognostycznych dla pacjentów z rakiem zrazikowym piersi, identyfikując grupę z potencjalnie większym prawdopodobieństwem do powstawania przerzutów. Obserwacja wskazująca na fakt, iż utrata kompleksu CD151/α3β1 w teoretycznie lepiej rokującej grupie pacjentów ILC bez przerzutów do węzłów chłonnych, może mieć ważne implikacje terapeutyczne (terapia adjuwantowa). Niezbędne wydają się dalsze badania nad mechanizmem udziału CD151/α3β1 w progresji nowotworowej. Ostatnią zaliczaną do osiągnięcia habilitacyjnego publikacją jest praca przeglądowa (4.4) opisująca i analizująca udział CD151 w rozwoju choroby nowotworowej i formowaniu przerzutów. Jak sam tytuł sugeruje rola tej tetraspaniny w omawianych procesach wydaje się dość skomplikowana. Nieco zaskakującym może być fakt, że stosunkowo niewielkie białko

13 błonowe o raczej nieskomplikowanej budowie, nie posiadające aktywności enzymatycznej czy zdolności wiązania liganda reguluje proces nowotworowy w zasadzie na każdym z jego etapów. Przykładowo, CD151 promuje kancerogenezę de novo w mysim modelu indukowanego raka płaskonabłonkowego (SCC, ang. Squamous Cell Carcinoma). Dowiedziono również udziału CD151 w kontroli proliferacji komórek przedinwazyjnego raka piersi in situ (DCIS, ang. Ductal Carcinoma In Situ) [25]. CD151 odgrywa także rolę we wzroście guza pierwotnego i tworzeniu przerzutów BCa [19, 24]. Ten kompleksowy opis udziału tetraspaniny CD151 w procesie nowotworowym jest pierwszą monografią dotyczącą tych zagadnień. Publikacja (4.4) podzielona jest na kilka rozdziałów. Po wstępie nakreślającym złożoność funkcji CD151 oraz budowę CD151 skupiono się na udziale tej tetraspaniny w regulacji aktywności integryn wiążących lamininę. Pokrótce opisano CD151-zależne: i) modulację oddziaływania integryn z ich ligandami, ii) modyfikacje potranslacyjne integryn, iii) sortowanie integryn w komórce, iv) dystrybucję integryn w błonie komórkowej, i v) sygnalizację poprzez integryny. W dalszej części pracy omówiono znaczenie CD151 w regulacji ekspresji i funkcji metaloproteinaz macierzy (MMPs, ang. Matrix Metalloproteinases) oraz jego rolę w komunikacji z mikrośrodowiskiem guza opartej o receptory dla czynników wzrostu. W publikacji umieszczono trzy niezależne ryciny prezentujące schematy oddziaływań pomiędzy CD151 a: integrynami, MMPs i receptorami dla czynników wzrostu, a także zależną sygnalizację i efekty komórkowe tych zależności. Istotne miejsce w pracy znajduje również rozdział poświęcony znaczeniu prognostycznemu CD151 w chorobach nowotworowych. Zebrano, syntetycznie opisano i przedstawiono w tabeli wszystkie dostępne do 2013 dane związane z ekspresją CD151 w różnych typach nowotworów, jego korelacją z parametrami kliniko-patologicznymi i innymi markerami. Chciałbym nadmienić, że praca spotkała się z bardzo przychylnymi recenzjami, podkreślającymi krytyczne (a nie tylko opisowe) podejście autorów do zagadnienia. Prezentowany cykl publikacji opisuje stosunkowo wąskie skupiające się na roli jednego białka w procesie progresji nowotworowej zagadnienie. Wydaje mi się jednak, że ujęcie problemu jest bardzo kompleksowe. Poczynając od zaprezentowania nowego CD151- zależnego mechanizmu regulacji funkcji integryn wiążących lamininę związanego z wpływem na ich glikozylację (a w konsekwencji migrację), poprzez nowatorskie prace dokumentujące udział CD151 w komunikacji komórek raka piersi z mikrośrodowiskiem guza i jego rolę zarówno we wzroście zarówno guza pierwotnego jak i formowaniu przerzutów, aż 12

14 do znaczenia klinicznego CD151 w raku przewodowym i zrazikowym gruczołu piersiowego. W publikacjach wykorzystano zarówno relatywnie zaawansowane techniki in vitro (np. hodowle w 3D, ko-hodowle z komórkami pierwotnymi), doświadczenia in vivo (ksenografty, obrazowanie na żywo ) jak i analizy kliniczne oparte o próbki tkanek od chorych z rakiem piersi. Prace powstały dzięki współpracy kilku ośrodków europejskich. Podkreślić należy udział zespołu dr. Fedora Berditchevskiego (Institute for Cancer Studies, University of Birmingham, UK) współodkrywcy tetraspanin oraz dr n. med. Hanny Romańskiej (Katedra Patologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi) koordynatora badań klinicznych. 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych Dorobek naukowy (szczegółowo w załączniku nr 4) Łączna liczba prac z wyłączeniem cyklu habilitacyjnego: 10 (w tym pierwszy autor w 5 pracach, autor korespondencyjny w 3 pracach) IF = 26,428, MNiSW = 163 w tym: przed doktoratem: 3 publikacje o IF = 2,375, MNiSW = 34 po doktoracie: 7 publikacji o IF = 23,933, MNiSW = 164 Cykl habilitacyjny to 5 publikacji (w tym pierwszy autor w 3 pracach, autor korespondencyjny w 2 pracach) o IF = 26,428, MNiSW = 163 Sumaryczna liczba publikacji pełnotekstowych (z pracami należącymi do cyklu habilitacyjnego): 15 (w tym pierwszy autor w 8 artykułach, autor korespondencyjny w 5 artykułach), suma IF = 52,736, MNiSW = 361. Łączna liczba streszczeń zjazdowych 19 (2 przed uzyskaniem stopnia doktora, 17 po uzyskaniu), 6 na konferencjach zagranicznych, 11 na konferencjach krajowych). Prace były cytowane 258 razy, wyłączając autocytowania 241 razy. Indeks Hirsha wynosi 8 (dane z Web of Science z dnia 10 grudnia 2015). Udział w projektach i grantach badawczych Udział w krajowych projektach badawczych: Opiekun naukowy projektu Preludium, NCN (nr rej. 2014/15/N/NZ3/04305) Współzależność FGFR2/RSK2 w progresji raka piersi - analizy in vitro, w modelu mysim oraz materiale klinicznym, Wykonawca projektu Opus, NCN (nr rej. 2013/09/B/NZ4/02512) Analiza profilu morfologicznego i molekularnego cech inwazyjności raków przewodowych in situ (DCIS) - 13

15 znaczenie prognostyczne, projekt realizowany we współpracy z Uniwersytetem Medycznym w Łodzi, Opiekun naukowy projektu Preludium, NCN (nr rej. 2012/05/N/NZ3/00290) Tetraspanina CD151 w komunikacji z mikrośrodowiskiem guza - znaczenie w progresji raka gruczołu krokowego, Kierownik projektu - Iuventus Plus - MNiSW (IP ), Rola kompleksu tetraspaniny CD151/integryny wiążące lamininę w migracji i inwazji komórek raka gruczołu krokowego oraz ocena jego przydatności w prognozowaniu nowotworu, Wykonawca projektu - projekt badawczy NCN, Nr rej 2011/01/B/NZ4/04910 Rola oddziaływań pomiędzy ErbB2/ErbB3 i kompleksem tetraspanina CD151/integryny wiążące lamininę w raku sutka: Implikacje dla prognozowania i terapii, projekt realizowany we współpracy z Uniwersytetem Medycznym w Łodzi, Uczestnictwo w projektach międzynarodowych: Kierownik projektu - Harmonia, NCN (2012/06/M/NZ3/00023), Udział tetraspaniny CD151 w regulacji funkcji FGFR2 w progresji raka piersi - analiza in vitro, w modelu mysim oraz materiale klinicznym, Kierownik projektu - HOMING PLUS, FNP (HOMING PLUS/2010-2/12), The role of tetraspanin CD151 in cancer cells migration and invasion implications for tumour prognostication, projekt realizowany we współpracy z Institute for Cancer Studies, Birmingham, Wielka Brytania, Wykonawca projektu Cancer Research UK (C1322/A5705), CD151 in breast cancer progression, projekt realizowany na Uniwersytecie w Birmingham, Wielka Brytania, Wykonawca projektu - National Institutes of Health (NIH, RO1-CA34085), Ecto-5`nucleotidase (CD73) in human malignancies, projekt realizowany na Uniwersytecie w Północnej Karolinie, Chapel Hill, USA Nagrody i wyróżnienia Laureat subsydium `HOMING PLUS` Fundacji na Rzecz Nauki Polskiej (2011) Nagroda Rektora GUMed, za rok 2008, grupowa, za badania nad rolą biologiczną tenascyny C i ekto-5`-nukleotydazy w adhezji i migracji komórek nowotworowych Nagroda Rektora AMG, za rok 2006, grupowa, za badania nad rolą biologiczną różnych form 5`-nukleotydazy w tkance zdrowej i nowotworowej 14

16 Staże zagraniczne , Postdoctoral Research Fellow, University of Birmingham, Institute for Cancer Studies, Birmingham, Wielka Brytania , Assistant Scientist, Lineberger Comprehensive Cancer Centre, University of North Carolina, Chapel Hill, USA Przebieg pracy przed uzyskaniem stopnia doktora Działalność naukową rozpocząłem podczas badań związanych z pracą magisterską realizowaną w Zakładzie Biologii Komórki, Międzyuczelnianego Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego (MWB UG-GUMed) pod opieką prof. dr hab. Jacka Bigdy. Tematem pracy była nadekspresja i oczyszczenie czynnika martwicy nowotworu α (TNFα, ang. Tumour Necrosis Factor) oraz ocena jego aktywności w modelu mysiego czerniaka Ma. Bezpośrednio po obronie pracy magisterskiej w 2001 roku rozpocząłem studia doktoranckie na MWB UG-GUMed. Rozprawę doktorską zatytułowaną Rola ekto-5`nukleotydazy w procesach adhezji i migracji komórek czerniaka przygotowaną pod kierownictwem prof. dr hab. Andrzeja Składanowskiego obroniłem w kwietniu 2006 roku uzyskując stopień doktora nauk biologicznych w zakresie biochemii. Przedmiotem badań w pracy doktorskiej była kompleksowa analiza funkcji ekto-5`-nukleotydazy (CD73) w procesach adhezji i migracji komórek czerniaka. Zaobserwowano, że CD73 koeksprymowane jest z innymi markerami rozwoju czerniaka. Wykazano, że CD73 może regulować asocjację innych białek w obrębie tratw lipidowych błony komórkowej. Ponadto ekto-5`-nukleotydaza posiada najwyższą aktywność enzymatyczną w liniach komórkowych czerniaka wyprowadzonych z przerzutów (a nie guza pierwotnego). Po raz pierwszy wykazaliśmy również, że CD73 może wchodzić w interakcję z jednym ze składników macierzy zewnątrzkomórkowej tenascyną C i regulować adhezję komórek czerniaka do tego białka. Rezultatem prac prowadzonych w ramach doktoratu są następujące publikacje: Sadej R, Spychała J, Skladanowski AC. Ecto-5-nucleotidase (en, CD73) is coexpressed with metastasis promoting antigens in human melanoma cells. Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids 2006; 25: IF = 0,671, MNiSW = 10 Sadej R, Spychala J, Skladanowski AC. Expression of ecto-5-nucleotidase (en, CD73) in cells from various stages of human melanoma. Melanoma Research 2006; 16: IF = 1,704, MNiSW = 24 15

17 Sadej R, Skladanowski A.C. Adhesion and invasion-modulating ecto-enzymes on cancer cell membrane: a chance or regularity? FinMed 2006: Proceedings of the 2 nd International Conference on Bioreactor Technology in Cell, Tissue Culture and Biomedical Applications with an additional theme: Molecular Farming, Saariselkä, Finland, 2006, March 27-31/ed. S. Sorvari and O. Toldi. IF brak, MNiSW - brak Przebieg pracy po uzyskaniu stopnia doktora Po obronie pracy doktorskiej rozpocząłem pracę w Zakładzie Enzymologii Molekularnej Międzyuczelnianego Wydziału Biotechnologii UG-GUMed. Początkowo kontynuowałem tematykę pokrewną z projektem doktoranckim a rozpoczętą w trakcie ośmiomiesięcznego stażu w Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina (USA). Dalsze analizy funkcji CD73 w komórkach nowotworowych potwierdziły bezpośrednią interakcję CD73 i tenascyny C. Zaobserwowano, że ekto-5`-nukleotydaza odgrywa podwójną rolę w procesach adhezji i migracji komórek nowotworowych: enzymatyczną (produkcja adenozyny) i receptorową (wiązanie się do białka ECM tenascyny C). Wyniki tych prac zostały opublikowane: Sadej R, Inai K, Rajfur Z, Ostapkowicz A, Kohler J, Skladanowski AC, Mitchell BS, Spychala J. Tenascin C interacts with ecto-5`-nucleotidase (en) and regulates adenosine generation in cancer cells. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis of Disease 2008; 1782: IF = 4,579, MNiSW = 24 Sadej R, Skladanowski AC. Dual, enzymatic and non-enzymatic, function of ecto-5'-nucleotidase (en, CD73) in migration and invasion of A375 melanoma cells. Acta Biochim Pol. 2012;59: IF = 1.185, MNiSW = 15 W lutym 2007 roku rozpocząłem blisko 4-letni staż podoktorski w Institute for Cancer Studies, University of Birmingham, UK. Przez klika lat moja praca skupiała się na roli tetraspaniny CD151 w progresji raka gruczołu piersiowego. Trzy spośród czterech prac opublikowanych w trakcie stażu wchodzą w skład mojego osiągnięcia habilitacyjnego. Praca czwarta jest efektem współpracy dotyczącej analizy funkcji integryny α3β1 w regulacji funkcji cyklooksygenazy 2 (COX-2). Mitchell K, Svenson KB, Longmate WM, Gkirtzimanaki K, Sadej R, Eliopoulos AG, Berditchevski F, DiPersio CM. Integrin alpha3beta1-dependent regulation of COX-2 gene expression controls breast cancer tumourigenesis, invasion and crosstalk to endothelial cells. Cancer Res 2010; 70: IF = 8,234, MNiSW = 32 16

18 Po powrocie do Polski, we wrześniu 2010 roku, zostałem zatrudniony na etacie adiunkta w Zakładzie Enzymologii Molekularnej, MWB UG-GUMed. Kontynuując prace związane z rolą CD151 w BCa w ramach współpracy z zespołem z Katedry Patologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi opublikowano pracę kliniczną skupiającą na roli CD151 w przedinwazyjnym przewodowym raku piersi (DCIS). Romanska H, Potemski P, Kusinska R, Kopczynski J, Sadej R, Kordek R. Expression of CD151/Tspan24 and Integrin alpha 3 complex in aid of prognostication of HER2-negative high grade DCIS. Int J Clin Exp Pathol 2015;8: IF = 1,891, MNiSW = 25 W roku 2012 otrzymałem grant badawczy (Harmonia, NCN) dotyczący analiz i znaczenia współzależności CD151 FGFR2 (ang. Fibroblast Growth Factor 2) w progresji raka piersi. Praca dotycząca bezpośrednio tego zagadnienia jest na ukończeniu. W międzyczasie zidentyfikowaliśmy nowe białko - RSK2 (ang. Ribosomal S6 Kinase 2) aktywowane w ścieżce sygnalizacyjnej od FGFR2. Ponadto wykazaliśmy istnienie dwóch niezależnych mechanizmów fosforylacji RSK2 opartych o białka ERK1/2 i p38. Udokumentowaliśmy również udział RSK2 w FGFR2-zależnym wzroście, adhezji i migracji komórek. Wyniki te zostały opublikowane w: Czaplinska D, Turczyk L, Grudowska A, Mieszkowska M, Lipinska AD, Skladanowski AC, Zaczek AJ, Romanska HM, Sadej R. Phosphorylation of RSK2 at Tyr529 by FGFR2-p38 enhances human mammary epithelial cells migration. BBA Mol Cell Res 2014;11: IF = 5,019, MNiSW = 35 Tematyka ta jest nadal kontynuowana, a w recenzji znajduje się praca dotycząca znaczenia prognostycznego współzależności FGFR2/RSK2 w raku piersi. Kolejna dokonana obserwacja dotyczy udziału FGFR2 w regulacji funkcji receptora progesteronu. W toku są analizy skupiające się na mechanizmie i konsekwencjach tego procesu. Opublikowano również monografię związaną z tą tematyką. Piasecka D, Składanowski AC, Kordek R, Romańska HM, Sądej R. Aspekty regulacji aktywności receptora progesteronu (PR) znaczenie w progresji raka gruczołu piersiowego. Postępy Biochemii 2015: 61, IF brak, MNiSW 8 Równocześnie prowadzona jest współpraca z dr. hab. Michałem Żmijewskim z Katedry Histologii Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego dotycząca wpływu witaminy D3 na zjawisko progresji nowotworowej. Jej efektem jest poniższa publikacja: Wierzbicka JM, Binek A, Ahrends T, Nowacka JD, Szydłowska A, Turczyk Ł, Wasiewicz T, Wierzbicki PM, Sadej R, Tuckey RC, Slominski AT, Chybicki J, Adrych K, Kmiec Z, Zmijewski 17

19 MA. Differential antitumor effects of vitamin D analogues on colorectal carcinoma in culture. Int J Oncol 2015;47: IF = 3,025, MNiSW = 25 Równolegle z działalnością naukową od 2010 roku zaangażowany jestem w działalność dydaktyczną. Prowadzę ćwiczenia laboratoryjne, seminaria i wykłady dla studentów Międzyuczelnianego Wydziału Biotechnologii UG-GUMed takie jak: ćwiczenia z biochemii, seminarium projekt badawczy, wykład chemia związków naturalnych aspekty toksyczności. Jestem promotorem 5 prac magisterskich i promotorem pomocniczym w 3 przewodach doktorskich (załącznik nr 4). Bibliografia [1] S. Levy, T. Shoham, Protein-protein interactions in the tetraspanin web, Physiology (Bethesda), 20 (2005) [2] F. Berditchevski, E. Odintsova, Tetraspanins as regulators of protein trafficking., Traffic, 8 (2007) [3] F. Berditchevski, Complexes of tetraspanins with integrins: more than meets the eye., J Cell Sci, 114 (2001) [4] F. Berditchevski, E. Odintsova, S. Sawada, E. Gilbert, Expression of the palmitoylation-deficient CD151 weakens the association of alpha 3 beta 1 integrin with the tetraspanin-enriched microdomains and affects integrin-dependent signaling., J Biol Chem, 277 (2002) [5] O.V. Kovalenko, X. Yang, T.V. Kolesnikova, M.E. Hemler, Evidence for specific tetraspanin homodimers: inhibition of palmitoylation makes cysteine residues available for cross-linking, Biochem J, 377 (2004) [6] C. Boucheix, E. Rubinstein, Tetraspanins, Cell Mol Life Sci, 58 (2001) [7] J.E. Testa, P.C. Brooks, J.M. Lin, J.P. Quigley, Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis., Cancer Res, 59 (1999) [8] J. Lammerding, A.R. Kazarov, H. Huang, R.T. Lee, M.E. Hemler, Tetraspanin CD151 regulates alpha 6 beta 1 integrin adhesion strengthening, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100 (2003). [9] X.W. Yang, C. Claas, S.K. Kraeft, L.B. Chen, Z.M. Wang, J.A. Kreidberg, M.E. Hemler, Palmitoylation of tetraspanin proteins: Modulation of CD151 lateral interactions, subcellular distribution, and integrin-dependent cell morphology, Molecular Biology of the Cell, 13 (2002). [10] M.E. Janik, A. Lityńska, P. Vereecken, Cell migration-the role of integrin glycosylation, Biochim Biophys Acta, 1800 (2010) [11] N.E. Winterwood, A. Varzavand, M.N. Meland, L.K. Ashman, C.S. Stipp, A critical role for tetraspanin CD151 in alpha3beta1 and alpha6beta4 integrin-dependent tumor cell functions on laminin-5., Mol Biol Cell, 17 (2006) [12] L. Liu, B. He, W.M. Liu, D. Zhou, J.V. Cox, X.A. Zhang, Tetraspanin CD151 promotes cell migration by regulating integrin trafficking, J Biol Chem, 282 (2007) [13] A. Zijlstra, J. Lewis, B. Degryse, H. Stuhlmann, J.P. Quigley, The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151., Cancer Cell, 13 (2008) [14] P. Schedin, P.J. Keely, Mammary gland ECM remodeling, stiffness, and mechanosignaling in normal development and tumor progression, Cold Spring Harb Perspect Biol, 3 (2011) a [15] D. Padua, J. Massagué, Roles of TGFbeta in metastasis, Cell Res, 19 (2009) [16] M.J. Kwon, S. Park, J.Y. Choi, E. Oh, Y.J. Kim, Y.H. Park, E.Y. Cho, S.J. Nam, Y.H. Im, Y.K. Shin, Y.L. Choi, Clinical significance of CD151 overexpression in subtypes of invasive breast cancer, Br J Cancer, 106 (2012) [17] X.H. Yang, A.L. Richardson, M.I. Torres-Arzayus, P. Zhou, C. Sharma, A.R. Kazarov, M.M. Andzelm, J.L. Strominger, M. Brown, M.E. Hemler, CD151 accelerates breast cancer by regulating alpha 6 integrin function, signaling, and molecular organization, Cancer Res, 68 (2008) [18] V. Novitskaya, H. Romanska, R. Kordek, P. Potemski, R. Kusińska, M. Parsons, E. Odintsova, F. Berditchevski, Integrin α3β1-cd151 complex regulates dimerization of ErbB2 via RhoA, Oncogene, (2013). 18

20 [19] R. Sadej, H. Romanska, G. Baldwin, K. Gkirtzimanaki, V. Novitskaya, A.D. Filer, Z. Krcova, R. Kusinska, J. Ehrmann, C.D. Buckley, R. Kordek, P. Potemski, A.G. Eliopoulos, e.-n. Lalani, F. Berditchevski, CD151 regulates tumorigenesis by modulating the communication between tumor cells and endothelium, Mol Cancer Res, 7 (2009) [20] C.W. Chien, S.C. Lin, Y.Y. Lai, B.W. Lin, J.C. Lee, S.J. Tsai, Regulation of CD151 by hypoxia controls cell adhesion and metastasis in colorectal cancer, Clin Cancer Res, 14 (2008) [21] M. Adachi, T. Taki, C. Huang, M. Higashiyama, O. Doi, T. Tsuji, M. Miyake, Reduced integrin alpha3 expression as a factor of poor prognosis of patients with adenocarcinoma of the lung, J Clin Oncol, 16 (1998) [22] L.A. Baldwin, J.T. Hoff, J. Lefringhouse, M. Zhang, C. Jia, Z. Liu, S. Erfani, H. Jin, M. Xu, Q.B. She, J.R. van Nagell, C. Wang, L. Chen, R. Plattner, D.M. Kaetzel, J. Luo, M. Lu, D. West, C. Liu, F.R. Ueland, R. Drapkin, B.P. Zhou, X.H. Yang, CD151-α3β1 integrin complexes suppress ovarian tumor growth by repressing slug-mediated EMT and canonical Wnt signaling, Oncotarget, 5 (2014) [23] B. Weigelt, H.M. Horlings, B. Kreike, M.M. Hayes, M. Hauptmann, L.F. Wessels, D. de Jong, M.J. Van de Vijver, L.J. Van't Veer, J.L. Peterse, Refinement of breast cancer classification by molecular characterization of histological special types, J Pathol, 216 (2008) [24] R. Sadej, H. Romanska, D. Kavanagh, G. Baldwin, T. Takahashi, N. Kalia, F. Berditchevski, Tetraspanin CD151 regulates transforming growth factor beta signaling: implication in tumor metastasis, Cancer Res, 70 (2010) [25] V. Novitskaya, H. Romanska, M. Dawoud, J.L. Jones, F. Berditchevski, Tetraspanin CD151 regulates growth of mammary epithelial cells in three-dimensional extracellular matrix: implication for mammary ductal carcinoma in situ, Cancer Res, 70 (2010)