Perspektywy zastosowania mikrorna w leczeniu nowotworów

Transkrypt

1 PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 4, str ANNA CIEPŁUCHA, KRZYSZTOF JAMROZIAK, TADEUSZ ROBAK Perspektywy zastosowania mikrorna w leczeniu nowotworów Perspective on the role of microrna in the therapy of cancer Z Kliniki Hematologii Uniwersytet Medycznego w Łodzi Kierownik: Prof. dr hab. med. Tadeusz Robak STRESZCZENIE Odkrycie mikrorna i jego funkcji biologicznych jest waŝnym krokiem na drodze do poznania molekularnych aspektów fizjologii oraz patogenezy chorób człowieka. MikroRNA są klasą krótkich, jednoniciowych cząsteczek niekodującego RNA, zaangaŝowanych w regulację podstawowych procesów biologicznych, w tym proliferacji, róŝnicowania i apoptozy komórek, w mechanizmie obniŝania ekspresji genów na etapie translacji. Prowadzone w ostatnich latach badania dostarczyły wielu przykładów związku zaburzeń ekspresji mikrorna z występowaniem róŝnych chorób, stając się podstawą do poszukiwania nowych strategii terapeutycznych. Głównym celem obecnej pracy jest charakterystyka wstępnych wyników badań dotyczących moŝliwości zastosowania mikrorna w leczeniu chorób nowotworowych. SŁOWA KLUCZOWE: mikrona Onkomiry Antagomiry Choroby nowotworowe SUMMARY Discovery of microrna and its biological functions is a significant step towards the understanding of molecular bases of human physiology and pathology. MicroRNAs constitute a class of short, non-coding RNA molecules involved in the regulation of a number of important biological processes including cell proliferation, differentiation and apoptosis by down-regulation of gene expression during translation phase. Recent research supports a role of micrornas in the pathogenesis of various diseases that gives theoretical base for development of novel therapeutical strategies. The aim of this paper is to review current results of studies addressing the use of micrornas as drugs or drug targets in human malignancies. KEY WORDS: microrna Oncomirs Antagomirs Cancer WSTĘP Rozwój nowoczesnych metod leczenia przeciwnowotworowego jest moŝliwy dzięki postępowi w badaniach molekularnych uwarunkowań onkogenezy. Dotychczas, skłonność do nowotworzenia była tłumaczona zaburzeniami trzech grup genów, czyli onkogenów, genów supresorowych oraz genów mutatorowych, spośród których wszystkie są genami kodującymi białka. W ostatnich latach dokonuje się przełom w dziedzinie genetyki polegający na coraz lepszym rozumieniu biologicznej roli niekodującego RNA,

2 426 A. CIEPŁUCHA i wsp. a szczególnie na odkryciu mikrorna. MikroRNA są klasą krótkich, nukleotydowych, jednoniciowych, niekodujących cząsteczek RNA, których rolą jest obni- Ŝanie ekspresji genów na etapie translacji informacji genetycznej (1). Na podstawie dotychczasowych badań, szacuje się, iŝ u człowieka występuje około 1000 genów mikrorna, które regulują około 30% wszystkich genów kodujących białka (2). Większość genów mikrorna (70%) jest zlokalizowana w intronach i/lub w egzonach innych genów, natomiast 30% między genami kodującymi białka oraz niekodującym RNA (3). Z uwagi na fizjologiczną funkcję związaną z regulacją procesów proliferacji, róŝnicowania i apoptozy komórek, zaburzenia ekspresji lub struktury genów mikror- NA mogą odgrywać istotną rolę w etiopatogenezie nowotworów. Biogeneza i mechanizm regulacji ekspresji przez mikrorna Proces biogenezy mikrorna jest złoŝony. Wykazano, iŝ orientacja genów mikrorna warunkuje określony profil ekspresji tych genów. Pierwsza grupa genów zlokalizowana w intronach i/lub egzonach zorientowana w kierunku 5 3 ulega transkrypcji zaleŝnie od ekspresji genu, którego jest częścią. Druga grupa genów mikrorna zlokalizowanych między genami kodującymi białka lub niekodujący RNA jest transkrybowana jako niezaleŝna jednostka transkrypcyjna (4). Ponadto grupa genów mikrorna pochodząca z intronów i/lub egzonów moŝe być transkrybowana w antysensownej orientacji. Za transkrypcję genów mikrorna odpowiedzialne są polimeraza: RNA II lub III, w tym polimeraza RNA II odgrywa główną rolę. W wyniku ich działania powstają pierwotne prekursory (pri-mikrorna) zawierające około 70 nukleotydów, które tworzą fragmenty o strukturze nieregularnej spinki (ang. hairpin). Dojrzewanie pri-mikrorna zachodzi w dwóch etapach, katalizowanych przez rybonukleazy Drosha i Dicer, naleŝących do RNaz typu III (5). Etap przycinania primikrorna do pre-mikrorna odbywa się w jądrze komórkowym i przeprowadzany jest przez kompleks Mikroprocesora. W jego skład wchodzi rybonukleaza Drosha oraz białko wiąŝące podwójną nić RNA, DGCR8 (double stranded RNA binding protein) (6). Pre-mikroRNA jest następnie transportowany do cytoplazmy, w której zachodzi kolejny etap biogenezy. Za transport przez pory jądra komórkowego odpowiedzialne jest białko eksportyna-5, które wiąŝe pre-mikrorna współdziałając z białkiem Ran zaleŝnym od GTP. W cytoplazmatycznym etapie biogenezy mikrorna, bierze udział endonukleaza Dicer. W wyniku jej działania powstaje dupleks mikrorna składający się z nukleotydów z dwunukleotydowym 3 końcem (7) Następnie jedna z nici RNA dupleksu ulega inkorporacji do kompleksu rybonukloproteinowego o nazwie mirisc (RNA induced silencing complex), stanowiący mechanizm regulacji ekspresji genów. W zaleŝności od stopnia komplementarności mikrorna do miejsca jego wiązania w mrna oraz rodzaju białka Argonaute wchodzącego w skład kompleksu, moŝe on doprowadzić do nukleolitycznego przecięcia określonego mrna lub represji jego translacji, w obu sytuacjach powodując obniŝenie ekspresji docelowego genu (8). Miejsca wiązania mikrorna występują głównie w regionach 3 UTR, a takŝe w 5 UTR i/lub w regionach kodujących w mrna (5).

3 Perspektywy zastosowania mikrorna 427 Fizjologiczne funkcje mikrorna MikroRNA bierze udział w regulacji wielu istotnych procesów biologicznych. Wyniki licznych badań wskazują, iŝ róŝne cząsteczki mikrorna odgrywają rolę w kontroli proliferacji komórki, róŝnicowania, apoptozy, w metabolizmie tłuszczów, sekrecji insuliny oraz procesach hematopoezy. Najlepiej poznanym przykładem czynności mikrorna jest mikrorna lin-4, który ulega ekspresji w pierwszym stadium larwalnym L1 nicienia Caenorhabditis elegans (9). Cząsteczka ta odpowiedzialna jest za inhibicję ekspresji genów lin-14 oraz lin-28, regulatorów wczesnych stadiów rozwojowych. Mutacja lin-4 powoduje powtórzenie podziałów charakterystycznych dla pierwszego stadium larwalnego zamiast róŝnicowania komórek. Przykłady cząsteczek mikrorna i ich związek z regulacją wybranych procesów biologicznych zostały przedstawiony w tabeli 1. Tabela 1. Udział mikrorna w określonych procesach fizjologicznych Table 1. The role of microrna in various physiological processes mikrorna Funkcja Gen stanowiący cel Cytowanie działania mikrorna mikrorna-1 RóŜnicowanie i proliferacja kardiomocy- HAND2 (10) Tów i komórek mięśni szkieletowych mikrorna-15a Regulacja apoptozy BCL-2 (11) mikrorna-27 Regulacja metabolizmu ksenobiotyków CYP1B1 (12) mikrorna-132 Regulacja morfogenezy układu nerwo- P250GAP (13) wego mikrorna-130a Regulacja megakariopcytopoezy MAFB (14) mikrorna-221 Regulacja erytropoezy c-kit (15) mikrorna-375 Regulacja sekrecji insuliny MTPN (16) mikrorna-143 RóŜnicowanie adypocytów ERK5 (17) HAND2 hand transcription factor; BCL2 B-cell lymphoma 2, CYP1B1, cytochrome P450 1B1, MAFB v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue B, c-kit stem cell factor receptor, MTPN myotrophin, ERK5 extracellular signal regulated kinase 5 Rola mikrorna w etipatogenezie nowotworów hematologicznych Ze względu na udział mikrorna w regulacji podstawowych procesów proliferacji, róŝnicowania i apoptozy komórek organizmu zaburzenia aktywności określonych cząsteczek mikrorna mogą mieć istotne znaczenie w procesie inicjacji i progresji chorób nowotworowych. Zwiększone ryzyko nowotworzenia moŝe być wynikiem zarówno uaktywnienia genów onkogennych, jak i wyciszania genów supresorowych, w zaleŝności od celów regulacji określonych mikrorna. MikroRNA, których geny ulegają delecji lub wyciszaniu mogą powodować efekt onkogenny, jeśli obiektem ich regulacji są protoonkogeny. Z drugiej strony, do nowotworzenia moŝe równieŝ prowadzić amplifikacja lub wzrost ekspresji genu mikrorna regulującego ekspresję genu supresorowego (18). MikroRNA, które funkcjonują jako onkogeny lub geny supresorowe zostały nazwane onkomirami (19).

4 428 A. CIEPŁUCHA i wsp. Pierwsze doniesienie sugerujące związek mikrorna z nowotworami dotyczyło przewlekłej białaczki limfatycznej (PBL). Stwierdzono, Ŝe wspólne miejsce występujących w około 70% przypadków PBL delecji fragmentu 13q14 obejmuje loci genów mikrorna-15a oraz mikrorna-16-1 (20). Następnie udowodniono korelację między obniŝoną ekspresją genów mikrorna-15a oraz mikrorna-16-1, a podwyŝszoną ekspresją genu bcl-2, typową dla PBL (21). W patogenezie PBL odgrywa równieŝ prawdopodobnie rolę niska ekspresja mikrorna-29 oraz mikrorna-181, które zawierają homologiczne sekwencje do 3 UTR mrna dla onkogenu TCLI. Wykazano, iŝ białko TCLI jest aktywatorem szlaku kinezy 3-fosfatydyloinozytolu, która powoduje aktywacje kinazy białkowej B określanej akronimem Akt. Kinaza Akt jest odpowiedzialna za regulację czasu przeŝycia oraz procesu proliferacji komórek, w tym limfocytów B oraz limfocytów T (22). Ponadto kompleks Akt-TCLI wpływa na większą aktywność kinazy Akt, co sugeruje, Ŝe TCLI jest kooaktywatorem kinazy Akt (23). Po aktywacji kinaza Akt dokonuje fosforylacji czynników zaangaŝowanych w procesy odpowiedzialne za przetrwanie komórki lub jej śmierć. Przykładem moŝe być czynnik proapoptyczny Bad (24) lub CREB (camp-response element binding protein) (25). W większości przypadków fosforylacja przeprowadzana przez kinazę Akt zwiększa czas przeŝycia komórki. Wykazano, Ŝe nadekspresja onkogenu TCLI jest skorelowana nie tylko z agresywną postacią PBL, ale równieŝ z występowaniem delecji 11q (49). NaleŜy jednak zaznaczyć, Ŝe pomimo istotnej odwrotnej korelacji między ekspresją mikrorna- 29 i mikrorna-181 a aktywnością TCLI istnieją przypadki PBL, które charakteryzują się niską ekspresją cząsteczek mikrorna-29, mikrorna-181 oraz TCLI, które sugerują, iŝ obniŝona ekspresja TCLI moŝe być równieŝ spowodowana innymi mechanizmami. Chłoniak Burkitta, chłoniak Hodgina oraz rozlane chłoniaki z duŝych limfocytów B są kolejnymi nowotworami, u których udowodniono związek ich występowania z zmienionym profilem ekspresji mikrorna. W wyŝej wymienionych chłoniakach stwierdzono wzrost ekspresji mikrorna-155 (26, 27, 28). Właściwości onkogenenne mikrorna-155 zostały potwierdzone w transgenicznym modelu mysim, w którym wywołanie nadekspresji mikrorna-155 powodowało niekontrolowaną proliferację limfocytów B (29). UwaŜa się, iŝ aktywność onkogenna mikrorna-155 związana jest z wpływem regulacyjnym na gen kodujący białko BIC, którego ekspresja jest wysoka w tych chłoniakach, a niska w prawidłowych limfocytach. Przypuszczenia te są poparte istnieniem konserwatywnych sekwencji w budowie genów dla mikrorna-155 oraz BIC (30). Jednak podstawy molekularne zaleŝności między mikrorna-155, a białkiem BIC są nieznane. Innym przykładem wskazującym na znaczenie mikrorna w etiopatogenezie nowotworów jest zlokalizowany na chromosomie 13q31 policistron mikrorna zawierający geny dla siedmiu mikrorna: mikrorna-17-5p, mikrorna-17-3p, mikrorna-18, mikrorna-19a, mikrorna-20, mikrorna-19b, mikrorna Amplifikacja tego regionu została potwierdzona w rozlanym chłoniaku z duŝych limfocytów B, chłoniaku grudkowym, chłoniaku z komórek płaszcza oraz w pierwotnym chłoniaku skóry B-komórkowym (31). Onkogenną rolę policistronu mikrorna po-

5 Perspektywy zastosowania mikrorna 429 twierdzono w doświadczeniu, w którym z komórek macierzystych wywodzących się z płodu myszy transfekowanych wektorem zawierającym klaster mikrorna-19b rozwinął się chłoniak B-komórkowy (32). PodwyŜszona ekspresja zespołu genów mikrorna indukowana jest przez nadekspresję czynnika transkrypcyjnego Myc (33). Cząsteczka Myc powoduje równieŝ wzrost ekspresji czynnika transkrypcyjnego E2F1 odpowiedzialnego za regulację przejścia fazy G1 do fazy S cyklu komórkowego (34). W modelu chłoniaka u myszy wykazano, iŝ podwyŝszona ekspresja policystronu mikrorna indukowana przez nadekspresję c-myc powoduje wzrost częstości podziałów mitotycznych i inhibicję apoptozy. Efekt ten wymaga kooperatywnego działania składowych policistronu mikrorna (35). Równie waŝny jest fakt, iŝ dwie składowe policystronu: mikrorna-17-5 i mikrorna-20a w obecności cząsteczki Myc obniŝają ekspresję czynnika transkrypcyjnego E2F1, tym samym umoŝliwiając precyzyjną regulację proliferacji komórek (69). Profil ekspresji mikrorna w guzach litych Przykładem funkcjonowania cząsteczek mikrorna jako supresorów nowotworzenia jest rodzina mikrorna let-7. U człowieka celem ich regulacji są mrna dla białek Ras, które biorą udział w przekazywaniu sygnałów komórkowych. W 3 UTR mrna trzech ludzkich onkogenów Ras (K-Ras, H-Ras oraz N-Ras) występują sekwencje komplementarne do mikrorna let-7. Wykazano, iŝ obniŝona ekspresja let-7 ma związek z występowaniem raka płuc (36). Udowodniono równieŝ, Ŝe wzrost ekspresji mikrorna-372 oraz mikrorna-373 odgrywa rolę w patogenezie raka jądra (37). Ponadto, opisano współistnienie zwiększonej ekspresji mikrorna-21 z rozwojem raka piersi (38), glejaka wielopostaciowego (39) oraz raka trzustki (40). Przykłady zmienionego profilu ekspresji mikrorna w innych nowotworach litych zostały przedstawione w tabeli 2. Tabela 2. Zmiany profilu ekspresji mikrorna w niektórych chorobach nowotworowych Table 2. Altered micrornas expression profil in selected solid tumours Rodzaj nowotworu MikroRNA Zmiana ekspresji Cytowanie Rak jelita grubego mikrorna-143 (41) mikrorna-145 Rak brodawkowy tarczycy mikrorna-221 mikrorna-222 mikrorna-146 mikrorna-181 (42) Rak wątrobowokomórkowy mikrorna-18 mikrorna-224 mikrorna-199a mikrorna-195 mikrorna-199a mikrorna-200a mikrorna-125a (43)

6 430 A. CIEPŁUCHA i wsp. Rak prostaty Neuroblastoma mikrorna-128a mikrorna-195 mikrorna-203 let-7d mikrorna-34a mikrorna-184 (44) (45) MoŜliwości terapeutyczne związane z mikrorna Postęp wiedzy na temat udziału mikrorna w procesach chorobowych jest punktem wyjścia badań nad strategiami terapeutycznego wykorzystania mikrorna, zarówno jako leków, jak i celów dla terapii. ChociaŜ większość badań jest obecnie w początkowej fazie, niektóre wstępne wyniki wydają się bardzo obiecujące. Głównym załoŝeniem zastosowania mikrorna w leczeniu jest uzyskanie wpływu na kontrolę ekspresji białek. Istnieje wiele doniesień wskazujących na moŝliwość pośredniej modyfikacji ekspresji białek zaangaŝowanych w patogenezę róŝnych chorób, w tym nowotworów za pomocą mikrorna. Wykazano na przykład, Ŝe wprowadzenie do mikrorna-125b mutacji typu knockdown powoduje ograniczenie proliferacji linii komórkowych raka prostaty PC-3 oraz komórek raka szyjki macicy HeLa (46). Jedną z potencjalnych strategii terapeutycznego wykorzystania mikrorna jest synteza sztucznych (ang. artificial) mikrorna komplementarnych do mrna określonego genu. W tym układzie zadaniem syntetycznego mikrorna byłoby wyciszenie ekspresji genu istotnego dla rozwoju lub progresji określonej choroby. Istnieją dość liczne doniesienia sugerujące potencjalną skuteczność takiej strategii. Wykazano, iŝ transfekcja plazmidu pcdna6.2-gw/emgfp-mir-based zawierającego sztucznie zaprojektowany pre-mikrorna przeciwko receptorowi chemokinowemu CXCR4 do hodowli komórek raka piersi MDA-MB-231 powoduje obniŝenie ekspresji CXCR4 o blisko 100% oraz w efekcie, zahamowanie migracji komórek nowotworowych. Potwierdzeniem powyŝszych obserwacji są wyniki badań in vivo przeprowadzonych na modelu mysim. U zwierząt, którym podano komórki nowotworowe linii raka piersi MDA-MB-231 transfekowane mikrorna-cxcr4 obserwowano mniejszą liczbę przerzutów w płucach w porównaniu z myszami, którym podano komórki MDA-MB-231 transfekowane plazmidem kontrolnym. Autorzy wykazali takŝe, iŝ wyciszenie ekspresji CXCR4 przez syntetyczny mikrorna-cxcr4 powoduje zablokowanie fosforylacji enzymu Akt a tym samym ma wpływ na inwazyjność i zdolność do przerzutowania komórek nowotworowych raka piersi (47). W innym badaniu przeprowadzono podobne doświadczenia na linii komórkowej raka Ŝołądka SGC7901. Dowiedziono, iŝ na skutek transfekcji plazmidu zawierającego sztucznie zsyntetyzowany mikrorna przeciwko mrna dla fosfatazy tyrozynowej PRL-3, która odpowiada za przerzutowanie raka Ŝołądka do węzłów chłonnych, doszło do zahamowania migracji i inwazyjności badanych komórek. Dane zostały potwierdzone takŝe in vivo na modelu mysim (48). Sztuczny, syntetyczny mikrorna został równieŝ wykorzystany w badaniu nad związkiem receptora chemokinowego CC1 a migracją i zdolnością do dawania przerzutów przez raka wątrobowokomórkowego. Receptor CC1

7 Perspektywy zastosowania mikrorna 431 ulega nadekspresji w raku wątrobowokomórkowym. Wykazano, iŝ transfekcja plazmidu pcdna6.2-gw/emgfp-mir-based zawierającego mikrorna komplementarny do mrna CC1, do hodowli linii raka wątrobowokomórkowego HCCLM3, doprowadziła do obniŝenia eskpersji CC1, a tym samym do obniŝenia inwazyjności tych komórek oraz spadku poziomu metaloproteinazy MMP-2 (49). Metaloproteinazy są klasą enzymów proteolitycznych o aktywności endopeptydaz zaleŝnych od jonów Zn 2+ i Ca 2+ trawiących składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, a ich podwyŝszony poziom u chorych jest na ogół niekorzystnym czynnikiem prognostycznym. Inną strategią terapeutyczną związaną z mikrorna są próby stosowania tzw. antagomirów. Termin antagomir (inaczej oligonukleotyd anty-mikrorna, AMO), oznacza syntetyczny oligonukleotyd komplementarny do określonego mikrorna. Idea leczenia antagomirami polega na modyfikacji aktywności określonych białek, pośrednio, poprzez wyciszenie genów mikrorna regulujących ich ekspresję. Spektakularnym przykładem skuteczności takiej terapii są badania in vivo nad wpływem antagomiru antymikrorna-122 na poziom cholesterolu u myszy (50). W tym doświadczeniu spadek poziomu mikrorna-122 wystąpił trzy dni po iniekcji anty-mikrorna-122. Obserwowano równieŝ obniŝenie ekspresji genów regulowanych przez mikrorna-122, w tym genów kodujących enzymy szlaku biosyntezy cholesterolu, oraz obniŝenia osoczowego stęŝenia cholesterolu o 40%, które utrzymywało się przez dwa tygodnie od podania leku. W doświadczeniu tym cząsteczka antagomiru została w odpowiedni sposób zmodyfikowana w celu uzyskania stabilności i oporności na działanie endonukleaz komórkowych. W pozycji 2 rybozy kaŝdego nukleotydu nici antysensowej wprowadzono grupę O-metylową. Terminalne nukleotydy na końcach obu nici ponadto zmodyfikowano wprowadzając wiązanie tiofosforanowe w miejce wiązania fosfodiestrowego. W celu zapewnienia odpowiednich właściwości farmakokinetycznych obejmujących zwiększenie powinowactwa do białek nośnikowych surowicy, wydłuŝenie okresu półtrwania oraz zwiększenie wychwytu przez hepatocyty, koniec 3 anty-mikrorna-122 został skoniugowany z cholesterolem. Antagomir był dobrze tolerowany przez organizm myszy. Nie odnotowano zamian w profilu enzymatycznym wątroby, który świadczyłby o toksyczności antagomiru Podobne wyniki odnotowano w odrębnym badaniu (51). Podawano myszom antymikrorna-122 IV dwa razy na tydzień przez cztery tygodnie. Antagomir wysycony był wiązaniami tiofoforanowymi na całej swej długości. Ponadto zawierał w pozycji 2 rybozy grupę O-metoksyetylową. Odnotowano takŝe wzrost oksydacji kwasów tłuszczowych w wątrobie oraz spadek syntezy kwasów tłuszczowych na skutek spadku ekspresji genów, których produkty biorą udział w metabolizmie tłuszczów. Korzystne zmiany w profilu lipidowym po stosowaniu anty-mikrorna-122 obserwowano równieŝ u myszy otyłych na skutek specjalnie wdroŝonej diety. Dokładny mechanizm działania antagomiru nie jest poznany, jednak przypuszcza się, iŝ wpływa on na dojrzałą cząsteczkę mikrorna, gdyŝ poziom pre-mikrorna-122 był niezmieniony. Najbardziej prawdopodobnym miejscem wiązania badanej cząsteczki jest kompleks RISC. Wykazano równieŝ, Ŝe anty-mikrorna-122 oddziałuje na replikację wirusa HCV wywołującego u człowieka wirusowe zapalenie wątroby typu C. Wyniki badań in vitro

8 432 A. CIEPŁUCHA i wsp. na liniach komórkowych CNS3 i 9-13 wskazują na istotne obniŝenie replikacji RNA HCV po podaniu anty-mikro-22. Antagomir ten odpowiedzialny był równieŝ za redukcję poziomu mrna Bach1 oraz za wzrost poziomu mrna HO-1 (52). Bach-1 jest białkiem wiąŝącym hem i stanowi w postaci heterodimeru z białekim Nrf2 (NF-E2- related factor 2) czynnik hamujący ekspresję genu HO-1 poprzez zdolność wiązania się z 5 UTR tego genu (53). HO-1 jest oksygenazą hemową o właściwościach antyoksydacyjnych, antyproliferacyjnych, przeciwzapalnych i obniŝenie ekspresji tego enzymu ma istotne znaczenie w patogenezie przewlekłego zapalenia wątroby wywołanego przez HCV (54). PowyŜsze dane sugerują, Ŝe dalsze badania nad stosowaniem antagomirów mogą w przyszłości przyczynić się do poprawy wyników leczenia przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu C. Ponadto, antysensowne oligonukleotydy anty-mikrorna-21 powodowały inhibicję ekspresji mikrorna-21 cząsteczki o działaniu przeciwapoptotycznym, co powodowało aktywację kaspazy-3 i kasapazy-7 i nasilenie apoptozy w warunkach in vitro. PodwyŜszona ekspresja mikrorna-21 jest obserwowana w przypadkach glejaka wielopostaciowego (55). W badaniu poświęconym analizie ekspresji poliscistronu mikrorna w przewlekłej białaczce szpikowej wykorzystano antagomiry anty-mikrorna-17.5p oraz anty-mikrorna-20. Wykazano znaczący spadek ekspresji dwóch składowych policistronu-mikrorna-17.5p oraz mikrorna-20 w hodowli linii komórkowej przewlekłej białaczki szpikowej K562. Dowiedziono takŝe, iŝ na skutek nadekspresji mikrorna policistronu w wyniku transfekcji komórek K562 wirusowym wektorem ekspresyjnym doszło do wzrostu proliferacji komórek i wraŝliwości na imatinib (56). Przeprowadzone badanie in vitro na komórach raka piersi linii MCF-7 z uŝyciem antagomiru skierowanego przeciw mikrorna-206, wykazało obniŝenie mrna receptora estrogenowego alfa (Erα) (57). Nadekspresja receptora ERα koreluje z wysokim ryzykiem wystąpienia raka piersi oraz raka endometrium i wystęuje w około 70% przypadków raka piersi. Przedstawione zaleŝności mogą okazać się istotne w leczeniu tych nowotworów. Interesującym doświadczeniem było zastosowanie mikrorna w celu obniŝenia ekspresji genu, który w warunkach fizjologcznych nie podlega regulacji przez mikrorna. Czynnik transkrypcyjny Gli-1 (Glioma assosiated antygen-1) jestem elementem szlaku przekazywania sygnału komórkowego istotnego w procesie organogenezy. Amplifikacja genu Gli-1 została wykazana w komórkach nowotworowych i często skorelowana jest z podwyŝszoną ekspresją protoonkogenu Her-2 (58). Her-2 koduje glikoproteinę o masie 185 kda naleŝący do rodziny receptorów czynników wzrostowych o aktywności kinazy tyrozynowej. Nadekspresja Her-2 oraz Gli-1 powoduje zaburzenia regulacji cyklu komórkowego, a takŝe zwiększa właściwości inwazyjne i zdolność do tworzenia przerzutów (59). Wykazano, Ŝe zastosowanie syntetycznego mikrorna komplementarnego do 3 UTR mrna dla Gli-1 skutkowało obniŝeniem poziomu czynnika Gli-1 w liniach komórkowych raka jajnika SK-OV-3 oraz raka trzustki MiaPaCa-2.

9 Perspektywy zastosowania mikrorna 433 Pomimo stosunkowo ograniczonej jeszcze wiedzy na temat roli mikrorna w patogenezie chorób i początkowej fazie badań potencjalnych strategii terapeutycznych, wiąŝe się z nimi duŝe nadzieje. Perspektywa zastosowania mikrorna w leczeniu chorób nowotworowych wydaje się obiecująca, jednak oprócz selekcji potencjalnych celów leczenia wymaga rozwiązania wielu problemów technicznych, m.in. udoskonalenia metod transferu mikrorna i anty-mikrorna do organizmu, poprawy wydajności wektorów ekspresyjnych, a takŝe określenia i ograniczenia efektów niepoŝądanych związanych z tym rodzajem terapii. PIŚMIENNICTWO 1. Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell 2004; 116: Bentwich I, Avniel A, Karov Y, et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human micrornas. Nat Genet 2005; 37: Rodriguez A, Griffiths_Jones S, Ashurst JL, Bradley A. Identification of mammalian microrna hostgenes and transcription units. Genome Res 2004; 14: Lee Y, Jeon K, Lee JT, Kim S, Kim VN MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellularlocalization. EMBO J.2002; 21: Bartel DP MicroRNAs: genomics, biogenesis,mechanism, and function. Cell 2004, 23: Han J, Lee Y, Yeom KH, Kim YK, Jin H TheDrosha-DGCR8 complex in primary microrna processing.genes Dev.2004; 18: Lee Y, Ahn C, Han J, Choi H, Kim J. The nuclearrnase III Drosha initiates microrna processing. Nature. 2003; 425: Tang G. sirna and mirna: an insight into RISCs. Trends BiochemSci 2005; 30: Pasquelli AE and Ruvkun G. Control of developmental timing by micrornasand their targets. Cell Dev Biol. 2002; 18: Nakajima N, Takahashi T, Kitamura R, et al. MicroRNA-1facilitates skeletal myogenic differentiation withoutaffecting osteoblastic and adipogenic differentiation. Biochem Biophys Res Commun 2006; 350: Cimmino A, Calin GA, Fabbri M, et al. mir-15 and mir-16 induce apoptosis by targetingbcl2. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102: Tsuchiya Y, Nakajima M, Takagi S, et al. MicroRNA regulates the expression of human cytochrome P450 1B1. Cancer Res 2006; 66: Vo N, Klein ME, Varlamova O, et al. A camp-response element binding protein-induced microrna regulates neuronal morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102: Garzon R, Pichiorri F, Palumbo T, et al. MicroRNA fingerprints during human megakaryocytopoiesis. Proc NatlAcad Sci USA 2006;103: Felli N, Fontana L, Pelosi E, et al. MicroRNAs 221 and 222 inhibit normal erythropoiesis and erythroleukemic cell growth via kit receptor down-modulation. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: Poy MN, Eliasson L, Krutzfeldt J, et al. A pancreatic isletspecific microrna regulates insulin secretion. Nature 2004; Esau C, Kang X, Peralta E, et al. MicroRNA-143 regulates adipocyte differentiation. J Biol Chem 2004; 279: Chen CZ. MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors. N Engel J Med 2005; 353: Esquela-Kerscher A, Slack FJ. Oncomirs micrornas with a role in cancer. Nat Rev Cancer 2006; 6:

10 434 A. CIEPŁUCHA i wsp. 20. Calin, G.A., Dumitru, C.D., Shimizu, M., Bichi, R., Zupo, S., Noch, E., Aldler, H., Rattan, S., Keating, M., Rai, K. Frequent deletions and down-regulation of micro-rna genes mir15 and mir16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002; 99: Cimmino A, Calin GA, Fabbri M et al. mir-15 and mir-16 induce apoptosis by targeting BCL2. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102: Chan TO, Rittenhouse SE, Tsichlis PN. AKT/PKB and other D3 phosphoinositide-regulated kinases: kinase activation by phosphoinositide-dependent phosphorylation. Annual Review of Biochemistry 1999; 68: Laine J, Kunstle G, Obata Tet al. The protooncogene TCL1 is an Akt kinase coactivator. Molecular Cell 2000; 6: Mok CL, Gil-Gomez G, Williams O et al. Bad can act as a key regulator of T cell apoptosis and T cell development. The Journal of Experimental Medicine 1999; 189: Du K & Montminy M. CREB is a regulatory target for the protein kinase Akt/PKB. The Journal of Biological Chemistry 1998; 273: Eis PS, Tam W, Sun L, et al. Accumulation of mir-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102: Kluiver J, Poppema S, de Jong D, et al. BIC and mir-155 are highly expressed in Hodgkin, primary mediastinal and diffuse large B cell lymphomas. J Pathol 2005;207: Metzler M, Wilda M, Busch K, et al. High expression of precursor microrna-155/bic RNA in children with Burkitt lymphoma. Genes Chromosomes Cancer 2004; 39: Costinean S, Zanesi N, Pekarsky Y, et al. Pre-B cell proliferation and lymphoblastic leukemia/highgrade lymphoma in E(mu)-miR155 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A, Meyer J, Lendeckel W, et al. Identification of tissuespecific micrornas from mouse. Curr Biol 2002; 12: Ota A, Tagawa H, Karnan S, Tsuzuki S, Karpas A, Kira S, Yoshida Y, Seto M. Identification and characterization of a novel gene, C13orf25, as a target for 13q31-q32 amplification in malignant lymphoma. Cancer Res 2004; 64: He L, Thomson JM, Hemann MT, et al. A mikrorna polycistron as a potential human oncogene. Nature 2005; 435: O Donnell KA, Wentzel EA, Zeller KI, Dang CV, Mendell JT. c-myc-regulated micrornas modulate E2F1 expression. Nature 2005; 435: Trimarchi JM, Lees JA. Sibling rivalry in the E2F family. Nat Rev Mol Cell Biol 2002; 3: He L, Thomson JM, Hemann MT, et al. A microrna polycistron as a potential human oncogene. Nature 2005; 435: Johnson SM, Grosshans H, Shingara J et al. RAS is regulated by the let-7 microrna family. Cell 2005; 120: Voorhoeve, P.M., le Sage, C., Schrier, M., Gillis, A.J.M., Stoop, H., Nagel, R., Liu, Y.-P., van Duijse, J., Drost, J., Griekspoor, A., A genetic screen implicates mirna-372 and mirna-373 as oncogenes in testicular germ cell tumors. Cell 2006; 124: Iorio MV, Ferracin M, Liu CG, et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer. Cancer Res 2005; 65: Chan JA, Krichevsky AM, Kosik KS. MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res 2005; 65: Roldo C, Missiaglia E, Hagan JP, et al. MicroRNA expression abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors are associated with distinctive pathologic features and clinical behavior. J Clin Oncol 2006; 24: Michael, M.Z., O'Connor S.M, Pellekaan, NGV, Young, GP, James, R.J., Reduced accumulation of specific micrornas in colorectal neoplasia. Mol. Cancer Res. 2003; 1: He H.L, Jazdzewski K, LiW, Liyanarachchi S, Nagy R, Volinia S, Calin GA, Liu CG, Franssila K, Suster S, Kloos RT, Croce CM, de la Chapelle A. The role of microrna genes in papillary thyroid carcinoma. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005a; 102:

11 Perspektywy zastosowania mikrorna Murakami Y, Yasuda T, Saigo K, Urashima T, Toyoda H, Okanoue T, Shimotohno, K.,. Comprehensive analysis of microrna expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues. Oncogene 2006; 25: Volinia S, Calin GA, Liu CG, et al. A microrna expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103: Chen Y, Stallings RL. Differential patterns of mikrorna expression in neuroblastoma are correlated with prognosis, differentiation, and apoptosis. Cancer Res 2007; 67: Lee YS, Dutta A. MicroRNAs: small but potent oncogenes or tumor suppressors. Curr Opin Investig Drugs 2006; 7: Liang Z. et al: Blockade of invasion and metastasis of breast cancer cells via targeting CXCR4 with an artificial microrna. / Biochemical and Biophysical Research Communications. 2007; 363: Li Z., Zhan W., Wang Z. et al: Inhibition of PRL-3 gene expression in gastric cancer cell line SGC7901 via microrna suppressed reduces peritoneal metastasis Biochemical and Biophysical Research Communications 2006; 348: Wu X., Fan J., Wang X., Zhou J. et al: Downregulation of CCR1 inhibits human hepatocellular carcinoma cell invasion, Biochemical and Biophysical Research Communications 2007; 355: Krutzfeldt J, Rajewsky N, Braich R, et al. Silencing of micrornas in vivo with antagomirs. Nature 2005; 438: Esau C, Davis S, Murray SF, et al. mir-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metab 2006; 3: Shan Y., Zheng J. Reciprocal Effects of Micro-RNA-122 on Expression of Heme Oxygenase-1 and Hepatitis C Virus Genes in Human Hepatocytes Gastroenterology 2007; 133: Oyake T, Itoh K, Motohashi H, et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol 1996; 16: Okuda M, Li K, Beard MR, et al. Mitochondrial injury, oxidative stress, and antioxidant gene expression are induced by hepatitis C virus core protein. Gastroenterology 2002; 122: Chan JA, Krichevsky AM, Kosik KS. MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res 2005; 65: Letizia Venturini,1 Karin Battmer,1 Mirco Castoldi: Expression of the mir polycistron in chronic myeloid leukemia (CML) CD34_ cells Blood. 2007; 109: Adams BD, Furneaux H, White BA. The micro-ribonucleic acid (mirna) mir-206 targets the human estrogen receptor-alpha (ERalpha) and represses ERalpha messenger RNA and protein expression in breast cancer cell lines. Mol Endocrinol. 2007; 21: Stepan V, Ramamoorthy S, Nitsche H, Zavros Y,Merchant JL, Todisco A. Regulation and function ofthe sonic hedgehog signal transduction pathway inisolated gastric parietal cells. J Biol Chem 2005; 280: M. Tan, J. Yao, D. Yu, Overexpression of the c-erbb-2 gene enhanced intrinsic metastasis potential in human breast cancer cells without increasing their transformation abilities, Cancer Res 1997; 57: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autorów: Kliniki Hematologii Uniwersytet Medycznego w Łodzi ul. Ciołkowskiego 2, Lodz, Poland Tel. +(48) Fax +(48) robaktad@csk.umed.lodz.pl

12 436 A. CIEPŁUCHA i wsp.