ALGORYTM FENOTYPOWANIA BLASTÓW W OSTRYCH BIAŁACZKACH DZIECIĘCYCH ALGORHYTHM OF BLASTS PHENOTYPING IN ACUTE CHILDREN S LEUKEMIAS

Transkrypt

1 Nowiny Lekarskie 28, 77, 3, MARIA WĄSIK, URSZULA DEMKOW, BARBARA JAKUBCZAK, MARZENA MODZELEWSKA, ANNA STELMASZCZYK-EMMEL, ELŻBIETA GÓRSKA, MONIKA BŁOCKA ALGORYTM FENOTYPOWANIA BLASTÓW W OSTRYCH BIAŁACZKACH DZIECIĘCYCH ALGORHYTHM OF BLASTS PHENOTYPING IN ACUTE CHILDREN S LEUKEMIAS Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego Warszawski Uniwersytet Medyczny Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Maria Wąsik Streszczenie Wstęp. Opracowanie przedstawia retrospektywną analizę oceny przydatności diagnostycznej jednoczasowego stosowania zestawu 23 przeciwciał monoklonalnych u 231 dzieci z rozpoznaną ostrą białaczką. Cel. Celem opracowania było sprawdzenie, które z nich pozwalają z dużym prawdopodobieństwem na szybkie ustalenie pochodzenia komórek blastycznych w ostrych białaczkach wieku dziecięcego. Metodyka. Oceniono przydatność przeciwciał anty CD34, CD45, HLA-DR oraz wykrywających y komórek charakterystycznych dla linii limfocytów T i B oraz komórek linii mieloidalnej. Wyniki. Stwierdzono, że dla ALL z linii B istotnie statystycznie częściej występuje CD19 w porównaniu do CD22 (p <,1). Dla AML stwierdzono istotnie częściej występowanie u CD33 w porównaniu do CD13 i CD15. Dla ALL z linii T najbardziej charakterystyczny był CD7 występujący u pond 9 przypadków. Wnioski. Autorzy analizy sugerują dwuetapowe fenotypowanie pozwalające na szybkie rozpoznanie choroby i następujące po nim już ukierunkowane szukanie ekspresji ów, które pozwolą na dokładną charakterystykę blastów przydatną do oceny choroby resztkowej. Taka procedura będzie miała wymierne korzyści finansowe nie ograniczając informacji o cechach komórek nowotworowych. SŁOWA KLUCZOWE: ostre białaczki wieku dziecięcego, ostra białaczka limfoblastyczna T, ostra białaczka limfoblastyczna B, białaczki mieloidalne (nielimfoblastyczne AML), cytometryczna ocena fenotypu, częstość ekspresji ów. Summary Introduction. This paper presents retospective analysis of simultaneous application of the set of 23 monoclonal antibodies in a group of 232 children with recognized acute leukemias. Aim. The aim of the analysis was assessment which of them with high probability and faster allow to determine recognition of the tumor cell line origin in children s acute leukemias. Methods. Assessment was performed with antibodies against CD34, CD45 and HLA-DR as well as detecting antigens characteristic for T and B lymphocytes and myeloid cells. Results. The results showed that for B lymphocytes the most characteristic antigens was CD19 and in comparison to CD22 this antigen is expressed more frequently p <.1. In cases with AML CD33 had the significantly higher expression CD33 in comparison to CD13 and CD15. Lymphoblasts T were characterized by expression of CD7 in almost 9 of investigated ALLT cases. Conclusions. The authors suggest a two-stages phenotyping in which the first stage would allow recognition of the disease and the second would involve search for antigens coexpression allowing determination of minimal residual disease. The two stages procedure would be profitable without restriction of information about tumor cells. KEY WORDS: acute children s leukemias, acute lymphoblastic T leukemia, acute lymphoblastic B leukemia, myeloid leukemia (acute non lymphoblastic leukemia, AML), cytometric phenotyping, frequency of antigen expression. Wstęp Potwierdzenie podejrzenia choroby nowotworowej w układzie krwiotwórczym powinno wynikać z badań wykonanych w szpiku, ponieważ w tej tkance choroba się rozwija. Tylko w sytuacjach wyjątkowych problemów z pobraniem aspiratu szpiku dopuszcza się wykonanie badań we krwi obwodowej. Z pobranego szpiku do suchej strzykawki (bez antykoagulantu) wykonuje się rozmazy, które następnie wybarwione będą swoistymi metodami pozwalającymi na uwidocznienie barwnej reakcji w komórkach posiadających wewnątrzkomórkowe enzymy (MPO), fosfataza kwaśna i zasadowa, i esterazy oraz związki chemiczne, takie jak glikogen. W celu wykonania fenotypowania, czy też badań genetycznych, szpik należy pobrać na heparynę, a w przypadku krwi na EDTA. Zawsze należy ocenić liczbę leukocytów w szpiku i krwi i wykonać rozmaz, który barwi się metodą May Grunwald-Giemza. Oglądając preparat należy zwrócić uwagę na liczbę blastów i ocenić na ile komórki nowotworowe wyparły z badanej tkanki prawidłowe leukocyty. Odpowiednią objętość pobranej tkanki należy przesłać do pracowni specjalistycznych celem wykonania badań cytogenetycznch i immunofenotypowania [1]. Ocenę immunofenotypu wykonuje się wtedy, gdy ocena liczby i morfologii leukocytów potwierdziła podejrzenie białaczki. Wykonanie immunofenotypowania pozwala na rozpoznanie typu ostrej białaczki lub jej

2 Algorytm fenotypowania blastów w ostrych białaczkach dziecięcych 191 wykluczenie. Rozpoznając chorobę należy uwzględnić linię, z której pochodzą komórki blastyczne i etap zróżnicowania, na którym zostało zakłócone dojrzewanie komórek tej linii [2, 3]. Immunofenotypowanie pozwala również na ocenę cech komórek nowotworowych mających wpływ na rokowanie [4, 5, 6]. Wśród tych cech ważne znaczenie mają: lekooporność [4, 7] ph [8] wrażliwość na apoptozę [8, 9, ]. Ważne praktycznie znaczenie ma również znalezienie takich cech owych, które różnią komórki nowotworowe od prawidłowych, ponieważ umożliwią one monitorowanie procesu leczenia zmianą liczby komórek nowotworowych we krwi i szpiku pacjenta, czyli śledzenie choroby resztkowej (MDR minimal residual disease) [4, 5]. Na zapotrzebowanie Katedry i Kliniki Pediatrii, Hematologii i Onkologii Akademii Medycznej w Warszawie cytometryczne rozpoznawanie ostrych białaczek u dzieci rozpoczęto w roku 1996 i jest ono do dziś kontynuowane. W okresie lat wykonano badania u ponad dzieci podejrzanych o chorobę nowotworową z zajęciem szpiku kostnego. Cel pracy Postanowiono wykonać retrospektywną analizę przydatności diagnostycznej jednoczasowego stosowania pełnego zestawu 23 przeciwciał, by sprawdzić, które z nich pozwolą z dużym prawdopodobieństwem na szybkie ustalenie pochodzenia komórek blastycznych. Materiał i metody Do określenia fenotypu blastów w szpiku dzieci podejrzanych o ostrą białaczkę stosowano następujące 23 przeciwciała monoklonalne rozpoznające następujące y: CD34, CD45, HLA-DR i CD oraz y charakterystyczne odpowiednio dla limfocytów B: CD19, CD2, CD22, cytoplazmatyczne łańcuchy μ, sigg, sigm i siga; dla limfocytów T: CD2, CD3, CD5, CD7, CD4, CD8; dla linii mieloidalnej CD13, CD14, CD15, CD 33, CD65w, CD117 i przeciwciało przeciwko mieloperoksydazie. U 231 pacjentów z grupy badanych rozpoznano ostrą białaczką. W 134 (58) przypadkach była to ALL B, w 53 (23) przypadkach była to ALL T, a w 43 (19) przypadkach była to AML. U dzieci z rozpoznaną ALL B porównano częstość występowania CD19 i CD22. W ALL T porównano częstość występowania CD2, CD3, CD5 i CD7. W AML porównano częstość występowania CD13 i CD33. Analizowano odsetki pacjentów, u których w szpiku znajdowano wysokie odsetki blastów z badanymi ami (ponad 25 blastów pozytywnych dla analizowanego u). Do analizy statystycznej stosowano test t-studenta i test χ2. Wyniki Wyniki oceny częstości występowania ów CD19 i CD22 w grupie dzieci z rozpoznaną ALL B wykazały, że istotnie częściej w tej grupie są pacjenci, u których w szpiku stwierdzano wyższy odsetek blastów CD19+ (76,8 ± 19,72 ) w porównaniu do odsetka blastów CD22+ (7,9 ± 23,39). Różnica pomiędzy tymi wynikami jest istotna statystycznie (test t-studenta p <,1, n = 135). Analiza testem χ2 wykazała również, że istotnie częściej w tej grupie badanych blasty wykazują ekspresje CD19 niż CD22 (p <,1). Analizę częstości ekspresji ów w ALL B wykonano również dla wyników badań po podzieleniu tej grupy zgodnie z rozpoznanym podtypem ostrej białaczki limfoblastycznej B tzn: pro B (ryc. 1.), common B (ryc. 2.), pre B (ryc. 3.) i dojrzałe B (ryc. 4.) CD45 CD34 HLA DR CD19 CD22 CD/CD19 CD2 cigµ Ryc. 1. Odsetek pacjentów z rozpoznaną ALL pro B, u których analizowane y występowały na powyżej 25 blastów w szpiku (n = 13). Fig. 1. Percentage of patients with diagnosed ALL pro B in which analyzed antigens were expressed on more than 25 bone marrow blasts (n = 13) CD45 CD34 HLA DR CD19 CD19/CD CD22 CD2 Ryc. 2. Odsetek pacjentów z rozpoznaną call, u których analizowane y wystąpiły na powyżej 25 blastów w szpiku (n = 1). Fig. 2. Percentage of patients with diagnosed call pro B in which analyzed antigens were expressed on more than 25 bone marrow blasts (n = 1). Jak pokazano na rycinach, ekspresję u CD45 na blastach ALLB stwierdzono u ponad 85 badanych pacjentów. U około 5 badanych blasty wykazywały ekspresję u CD34. U blisko badanych na limfoblastach B występowały y MHC II klasy (HLA DR). Z dwóch ów: CD19 i CD22, charakterystycznych dla limfocytów B, częściej na limfoblastach białaczki ALLproB występował CD19 niż

3 192 Maria Wąsik i inni CD22. Test χ2 wykazał istotnie statystycznie wyższą częstość występowania wyższej liczby blastów z ekspresją u CD19+ niż CD22+ (p <,2) CD45 CD34 HLA-DR CD19 CD22 CD19CD CD2 cigµ Ryc. 3. Odsetek pacjentów z rozpoznaną ALL preb, u których analizowane y wystąpiły na powyżej 25 blastów w szpiku (n = 9). Fig. 3. Percentage of patients with diagnosed ALL pre B in which analyzed antigens were expressed on more than 25 bone marrow blasts (n = 9). W szpiku chorych z rozpoznaną ostrą białaczką limfoblastyczną T analizowano częstość występowania na blastach ów CD2, CD3, CD5, CD7 (ryc. 5.). Ponad 97 blastów wykazywalo ekspresję u CD45 i około 5 ekspresję u CD34. Z ów charakterystycznych dla limfocytów T, będących podstawą rozpoznania ALL T, najczęściej występował CD7. Był on podstawą rozpoznania u 87 chorych w tej grupie. Antygeny CD2, CD5 i CD3 były obecne odpowiednio u 69,6, 69,2 i 51, 2 pacjentów z rozpoznaną ALL T. Analiza testem χ2 wykazała statystycznie istotne różnice w częstości występowania tych ów na blastach T (p <,1). Częściej na wyższym odsetku limfoblastów T występował CD7 (p <,1) w porównaniu do CD2 i CD5. Częściej wyższy odsetek blastów miał ekspresje CD7 niż CD5 (p <,1). Częstość występowania u CD3 była najniża w porównaniu do CD7, CD5 i CD2 (p <,1). W grupie pacjentów z rozpoznaną ostrą białaczką mieloidalną (AML) (nielimfoblastyczną) CD45 kappa sigg+iga CD19/CD HLA DR CD22 CD procent pacjentów Ryc. 4. Odsetek pacjentów z blastami ALL B wykazującymi charakterystyczne y (n = 3). Fig. 4. Percentage of patients with ALL B blasts expressing characteristic antigens (n = 3). W tym typie białaczki CD towarzyszył CD19 tylko u około badanych i to na niskim odsetku blastów. W callb stwierdzono również, że istotnie częściej w szpiku występuje wyższy odsetek blastów z ekspresją CD19 w porównaniu do CD22. Analiza częstości występowania u CD19 i CD22 na blastach testem χ2 wykazała istotność statystyczną z p >,1. We wszystkich badanych przypadkach stwierdzano obecność ów CD19 i CD. U chorych z rozpoznaną ALL preb i dojrzałokomórkową B nie znaleziono różnic w częstości występowania ów CD19 i CD22. W tych przypadkach pojawiał się na większości blastach CD2. wykryto na blastach 97 pacjentów a CD43 u 54. Występowanie ów CD13 i CD33 na blastach upoważniające do rozpoznania AML stwierdzono odpowiednio u 73 i 81 pacjentów. Ekspresja u CD15 wystąpiła na blastach 74 chorych a wewnątrzkomórkową mieloperoksydazę (MPO) znaleziono w blastach 55 chorych. Analiza testem χ2 nie wykazała istotnej statystycznie zmienności występowania ów CD13 i CD33 na badanych blastach. Jak pokazuje rycina 6. CD33 występował nieco częściej na blastach w większym odsetku badanych w porównaniu do CD13 i CD15.

4 Algorytm fenotypowania blastów w ostrych białaczkach dziecięcych CD45 CD34 HLA DR CD7 CD2 CD5 CD3 CD4 CD8 Ryc. 5. Odsetek pacjentów z T ALL, u których analizowane y wystąpiły na powyżej 25 blastów (n = 53). Fig. 5. Percentage of patients with diagnosed ALL T in which analyzed antigens were expressed on more than 25 bone marrow blasts (n = 53) CD45 CD34 HLA DR CD13 CD33 CD15 MPO Ryc. 6. Odsetek pacjentów z AML, u których analizowane y występowały na powyżej 25 blastów (n = 43). Fig. 6. Percentage of patients with diagnosed AML in which analyzed antigens were expressed on more than 25 bone marrow blasts (n = 43). Dyskusja Przeprowadzona analiza oceniająca przydatność diagnostyczną poszukiwania określonych ów na blastach szpiku chorych podejrzanych o chorobę nowotworową w układzie krwiotwórczym wykazała, że w największym odsetku chorych ami różnicującymi ostrą białaczkę limfoblastyczną B od T są y CD19 dla ALLB i CD7 dla ALLT. W białaczkach AML zaobserwowano tendencję do częstszego występowania na mieloblastach u CD33 w porównaniu do CD13. Uzyskane wyniki sugerują możliwość znacznego ograniczenia liczby przeciwciał monoklonalnych w stosowanym do immunofenotypowania panelu. Wstępne zastosowanie zestawu zawierającego przeciwciała anty CD45, CD34 i HLA DR oraz CD19, CD7 i CD33 i odpowiednich kontroli izotypowych da w ponad 9 przypadków rozpoznanie linii, z której pochodzą blasty. Wynik taki uzyska się z cytometru bardzo szybko. Po rozpoznaniu linii należałoby szukać przy pomocy dodatkowych przeciwciał monoklonalnych ekspresji tych ów, które dla tej linii pozwolą określić etap zróżnicowania komórki nowotworowej [11, 12]. Wstępny panel przeciwciał wykaże również obecność najbardziej typowych koekspresji T na B, B na T i mielo na B i T [12]. W celu rozpoznania etapu zróżnicowania blastów można zastosować: a/ w przypadku ALLT MoAbs anty: CD2, CD3, CD4, CD8, b/ w przypadku ALLB MoAbs anty: C2, CD, cyt. m, kappa, lambda, sigg, sigm, CD79, c/ w przypadku AML MoAbs anty: CD117, CD13, CD14, CD15, CD7, MPO i CD41, CD42, CD61, CD65. Rozpoznanie linii i etapu zróżnicowania komórki blastycznej wystarcza lekarzowi do postawienia rozpoznania i rozpoczęcia leczenia. Oszczędność przeciwciał monoklonalnych poprzez obniżenie wstępnego kosztu badania umożliwi dalsze poszukiwanie na lub w komórce nowotworowej [12, 13, 14] markerów odróżniających ją od komórki prawidłowej. Pozwoli to na śledzenie choroby resztkowej bez znacznego podwyższania kosztów takiego badania. Wniosek Przedstawiona analiza upoważnia do wnioskowania, że dwuetapowe immunofenotypowanie blastów przyniesie wymierne korzyści w sensie oszczędności zużycia przeciwciał monoklonalnych umożliwiając bardziej celowane badania nad poszukiwaniem cech choroby resztkowej bez znacznego podwyższenia kosztów. Jednocześnie proponowana procedura nie będzie się wiązała z ograniczeniem informacji dla lekarza o cechach komórki nowotworowej niezbędnych dla prawidłowego rozpoznania choroby. Piśmiennictwo 1. Kaleem Z., Crawford E., Pathan M.H. et al.: Flow cytometric analysis of acute leukemias. Diagnosis utility and critical analysis of data. Arch. Pathol. Lab. Med., 23, 127, Orfao A., López A., Flores J. et al.: Diagnosis of hematological malignancies: new applications for flow cytometry. Hematology (EHA Educ. Program), 26, 2, Bene M.C., Castoldi G., Knapp W., Ludwig W.D. et al.: Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European group for the immunological characterization of leukemias (EGIL). Leukemia, 1995, 9, Compana D.: Application of cytometry to study acute leukemia: in vitro determination of drug sensitivity and detection of minimal residual disease. Cytometry, 1994, 18, Compana D., Coustan-Smith E.: Advances in the immunological monitoring of childhood acute lymphoblastic leukemia. Best Pract. Res. Clin. Hematol., 22, 15, Sikorska-Fic B., Wąsik M., Rybczyńska J., Stelmaszczyk A., Rokicka-Milewska R.: DNA index in children with acute lymphoblastic leukaemia additional diagnostic factor. Cent. Eur. J. Immunol., 1999, 24, Pui Ch-H., Evans W.E.: Treatment of acute lymphoblastic leukemia. N. Eng. J. Med., 26, 354, Malinowska I., Stelmaszczyk-Emmel A., Wąsik M., Rokicka-Milewska R.: Apoptosis and ph of blasts in acute childhood leukaemia. Med. Sci. Monit, 22, 8,

5 194 Maria Wąsik i inni 9. Malinowska I., Wąsik M., Stelmaszczyk A., Górska E., Steczowicz M., Rokicka-Milewska R.: Evaluation of spontaneous and therapeutically induced apoptosis in childhood Leukemias. Acute Leukemias VIII: prognostic factors and treatment strategies. In: Haematology and Blood Transfusion. Red. Buchner T. Springer-Verlag, Berlin, 21, Modzelewska M., Wąsik M.: Ekspresja białek egulujących apoptozę i lekowrażliwość w/na komórkach prawidłowego szpiku i krwi obwodowej. Haematol. Pol., 24, 35, Wąsik M.: Przydatność i zasady oceny fenotypu komórek w diagnozowaniu ostrych bialaczek. Diag. Lab., 21, 37, Drach J., Drach D., Classl H.: Flow cytometric determination of atypical expression in acute leukemia for the study of minimal residual disease. Cytometry, 25, 13, Stelmaszczyk-Emmel A., Wasilewski R., Górska E., Popko K., Modzelewska M., Wąsik M: Sefulness of cytoplasmatic antigens appointing in hyperplastic cells in case of acute childhood leukaemia. Proceedings of the 15th IFCC-IFSCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Barcelona, Euromedlab, 23, Stelmaszczyk-Emmel A., Górska E., Malinowska I., Matysiak M., Wąsik M.: The influence of dexamethazone on P-glycoprotein (P-gp)on expression and activity. Pol. J. Environ. Stud., 25, 14, Suppl. II, Part I, Wąsik M., Modzelewska M., Górska E. i wsp.: Mechanizmy regulujące lekooporność komórek nowotworowych. Aktualne Problemy Immunodiagnostyki i Immunotoksykologii. Red. Skopińska-Różewska E., Siwicki.A.K., Wyd. SPW Edycja, Olsztyn 27, Adres do korespondencji: Prof. dr hab. Maria Wąsik Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej ul. Marszałkowska Warszawa