Katedra i Zakład Biochemii

Transkrypt

1 Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu Katedra i Zakład Biochemii Kierownik Katedry Prof. dr hab. n. med. Ewa Birkner ul. Jordana Zabrze tel./fax biochemz@sum.edu.pl OCENA rozprawy na stopień doktora nauk medycznych mgr Olgi Gala pt. Osoczowe stężenie adropiny, iryzyny i waspiny u otyłych pacjentów z cukrzycą typu II leczonych metforminą" Szacuje się, że zachorowalność w Polsce na cukrzycę typu II wynosi od 1,6 do 4,7%. Zasadniczą rolę w etiopatognezie odgrywa interakcja między czynnikami genetycznymi (dziedziczenie monogenowe lub wielogenowe) a czynnikami środowiskowymi (m.in. otyłość zwłaszcza brzuszna, mała aktywność fizyczna) oraz różnie nasilone upośledzenie wydzielania insuliny i obwodowa insulinooporność. Cukrzyca typu II jest chorobą o dynamicznie zmieniającym się przebiegu, postępującym od dominującej insulinooporności, poprzez kompensacyjną hiperinsulinemię, do wyczerpania możliwości wydzielniczych komórek β. W początkowym okresie rozwoju cukrzycy typu II zmniejszona wrażliwość na insulinę jest kompensowana coraz intensywniejszym jej wydzielaniem przez komórki β. Jeżeli z insulinoopornością uwarunkowaną genetycznie lub środowiskowo współistnieje uwarunkowany wielogenowo defekt wydzielania insuliny, to stosunkowo szybko dochodzi do wyczerpania rezerw wydzielniczych komórek β. Jeżeli sprawność wydzielnicza komórek β jest duża, to hiperinsulinemia może się długo utrzymywać i sprzyjać postępowi miażdżycy. Przy wyczerpywaniu się rezerw wydzielniczych należy wdrożyć oprócz leczenia poprawiającego insulinowrażliwość leki pobudzające wydzielanie insuliny. Gdy leczenie doustnymi lekami jest nieskuteczne należy rozpocząć leczenie insuliną. Doustne leki przeciwcukrzycowe dzieli się na dwie grupy o odmiennym wpływie na gospodarkę węglowodanową: leki hipoglikemizujące (pochodne sulfonylomocznika) i leki antyhiperglikemiczne takie jak metformina - pochodna biguanidu, akarboza inhibitor α- glukozydazy, inhibitory peptydazy dipeptydylowej IV (DPP-4) zwane gliptynami, inhibitory kotransportera sodowo-glukozowego 2 (SGLT-2) odpowiedzialnego za wychwyt glukozy z moczu pierwotnego tzw. flozyny oraz antagonistę receptora jądrowego PPAR-γ należących do pochodnych tiazolidynodionu. Obecnie nadal pierwszym zalecanym lekiem doustnym, którego stosowanie rozpoczyna się w chwili rozpoznania choroby jest metformina, która obok działania antyhiperglikemicznego powoduje zmniejszenie masy ciała, poprawia profil lipidowy, obniża ciśnienie tętnicze i ma inne działania protekcyjne. Dlatego temat podjęty przez Doktorantkę jest tematem aktualnym i zapewne wymagającym ciągłej weryfikacji i analizy z powodu tendencji ciągłego wzrostu zachorowalności na cukrzycę typu II. 1

2 Charakterystyka ogólna pracy Przedstawiona mi do oceny dysertacja ma układ typowy dla prac doktorskich. Rozprawa liczy 169 stron i składa się wykazu skrótów, wykazu tabel i rycin oraz następujących rozdziałów: wstępu, założenia i celu pracy, materiałów i metodyki badań, wyników, dyskusji, wniosków, piśmiennictwa, streszczenia w języku polskim i angielskim. Zawiera 241 pozycji bibliografii, 28 tabel i 69 rycin. Praca jest przejrzysta i starannie sformatowana. Zawiera drobne błędy edytorskie (str. 40, 139). Ponadto Doktorantka używa słowa trójglicerydy str. 40, 128 (również taka nazwa znajduje się w wykazie skrótów strona 10). W obecnej nomenklaturze powinno się używać triacyloglicerole. Wstęp Wstęp został podzielony na sześć części. Doktorantka opisała w nim w sposób bardzo staranny i merytoryczny epidemiologię oraz rolę insulinooporności w cukrzycy typu II. Ponadto przedstawiła rolę tkanki tłuszczowej w patogenezie otyłości i cukrzycy typu II. Znaczącą pozycje we wstępie zajmuje opis metforminy, leku stosowanego farmakoterapii cukrzycy typu II. Bardzo istotną częścią wstępu jest podrozdział dotyczący adipokin i peptydów biorących udział w utrzymaniu homeostazy metabolicznej a mianowicie atropiny, iryzyny i waspiny. Cennym dopełnieniem tej części pracy jest sześć rycin obrazujących informacje zawarte w tym rozdziale. Cel pracy Celem nadrzędnym rozprawy była ilościowa ocena adropiny, iryzyny i waspiny w osoczu krwi otyłych pacjentów ze świeżo rozpoznaną, dotychczas nie leczoną cukrzycą typu 2 oraz po sześciu miesiącach stosowania metforminy, w odniesieniu do adropinemii, iryzynemii i waspinemii osób zdrowych. Aby ocenić pełniejszą dynamikę ewentualnych zmian stężeń w/w związków Doktorantka poddała je również analizie wraz z parametrami funkcji nerek (wskaźnik albumina/kreatynina w moczu oraz szacunkowym współczynnikiem filtracji kłębuszkowej; ze wskaźnikami wrażliwości tkanek na działanie insuliny: HOMA-IR, QUICKI, wskaźnikiem insulinowrażliwości (%S), wskaźnikiem funkcji komórek β (%B) oraz insuliną oraz z parametrami gospodarki węglowodanowo-lipidowej: hemoglobiną glikowaną, szacowanym wskaźnikiem dystrybucji glukozy, glukozą, panelem lipidowym i wskaźnikiem TG/HDL. Ważnym elementem pracy jest analiza wykorzystująca metody sztucznej inteligencji, pozwalająca na rozstrzygnięcie, które zmienne biochemiczne najlepiej różnicują osoby ze zdrową metabolicznie otyłością i otyłością w przebiegu cukrzycy typu 2, jak również z dużą dokładnością różnicują stan metaboliczny pacjentów przed i po 6-miesięcznym okresie leczenia metforminą, będąc zarazem wskaźnikiem odzwierciedlającym wpływ terapii farmakologicznej na ekspresję omawianych molekuł regulatorowych. Cel główny jak również cele cząstkowe w mojej opinii zostały prawidłowo sformowane Materiał i Metody Rozdział ten stanowi 21 stron maszynopisu. Doktorantka bardzo szczegółowo opisuje w nim metodyki badań oraz charakteryzuje grupy od których został pozyskany materiał do badań. Na stronie 53 jest zdanie, że.żadna osoba uczestnicząca w badaniach nie przerwała terapii metforminą z powodu wystąpienia skutków ubocznych stosowania powyższego preparatu brak jest informacji jakie to były skutki uboczne. Ponadto w przeprowadzonym z pacjentem wywiadzie brak jest informacji o paleniu papierosów co wydaje się istotne w kontekście prowadzonych badań. 2

3 Niniejszy rozdział zawiera cztery tabele w których Doktorantka charakteryzuje badane grupy pod względem płci, wieku parametrów antropometrycznych, funkcji nerek, wykładników insulinoopornosci i insulinowrażliwości jak również parametrów biochemicznych. W tabelach Doktorantka używa określeń osoby zdrowe, osoby chore moim zdaniem właściwe byłoby określenie grupa kontrolna, grupa badana, co zresztą widnieje w opisie tabel zwłaszcza w odniesieniu do pierwszej grupy. W tabeli IV na stronie 57 są zamieszczone wartości referencyjne jednak brak jest piśmiennictwa do tych danych. Wydaje się to dość istotne, ponieważ wg najnowszego podręcznika Interna autorstwa prof. Szczeklika z 2017 roku wartości referencyjne podane w tabeli różnią się od przytoczonej pozycji np. glukoza od mg/dl a w dysertacji mg/dl, TG mg/dl a w pracy mg/dl. Różnice dotyczą również cholesterolu całkowitego, frakcji HDL, LDL, kreatyniny i kwasu moczowego. Na stronie 58 Doktorantka zaznaczyła, że praca posiada zgodę Komisji Bioetycznej natomiast brak jest numeru. W niniejszej pracy zostały oznaczone w moczu parametry funkcji nerek, m.in. kreatynina oraz albumina. Czy powyższe parametry zostały oznaczone w dobowej zbiórce moczu, czy tylko w porannej porcji? Wyniki Uzyskane wyniki Doktorantka opracowała statystycznie używając programu STATISTICA wersja 10 wykorzystując typowe testy statystyczne. Ponadto kluczowym elementem pracy jest informatyczna analiza i klasyfikacja (metodami sztucznej inteligencji) pozwalająca na weryfikację tezy ocenę, czy badane zmienne adropina, iryzyna i waspina różnią się u pacjentów z cukrzycą typu 2 w stosunku do osób zdrowych, a także na rozstrzygnięcie, które z wymienionych parametrów wyraźnie różnią się u pacjentów przed i po leczeniu, będąc zarazem potwierdzeniem skuteczności terapii farmakologicznej. Wielowymiarową ocenę i wizualizację zależności między badanymi zmiennymi biochemicznymi, przeprowadzono w oparciu o analizę dyskryminacyjną. Doktorantka uzyskane w wyniku powyższych analiz dane przedstawiła w sposób bardzo szczegółowy na 51 stronach maszynopisu. Zobrazowane one zostały w postaci licznych tabel i rycin i zostały podzielone na cztery części. Analiza statystyczna zastosowana w niniejszej pracy jest bardzo skomplikowana, co w mojej ocenie może utrudniać interpretację wyników. Część wyników zostało przedstawionych zarówno, w tabelach, jak również na rycinach, co wydaje się niepotrzebne, gdyż nie zaleca się powielania tych samych wyników. Ponadto w tabelach wyniki przedstawiono z użyciem kropek jako wartości dziesiętnych, setnych czy tysięcznych a powinny być użyte przecinki (wynika to najpewniej z przygotowywania tabel do publikacji w czasopismach anglojęzycznych). Autorka nie wykazała istotnych różnic w osoczowym stężeniu adropiny u osób chorych na cukrzycę typu 2 po sześciomiesięcznej terapii metforminą w porównaniu przed leczeniem, a także względem adropinemii osób grupy kontrolnej, co może być związane z niewielkim rozmiarem próby. W niniejszej pracy wykazano, że w osoczu krwi otyłych chorych z cukrzycą typu 2, zarówno przed, jak i po zastosowaniu farmakoterapii, iryzyna występuje w stężeniach znamiennie wyższych, w stosunku do wartości stężeń tego białka w osoczu krwi zdrowych osób otyłych jak również istotnie wyższe stężenia ocenianej molekuły w grupie badanej po półrocznym leczeniu metforminą, w porównaniu przed wdrożeniem leczenia. Ponadto, w grupie badanej przed leczeniem wykazano istotne statystycznie ujemną korelację pomiędzy stężeniem iryzyny a egfr (co może potwierdzać udział iryzyny w patogenezie postępującego uszkodzenia nerek w przebiegu T2DM) i dodatnią z odsetkiem hemoglobiny glikowanej oraz, w grupie po półrocznej terapii metforminą, dodatnią korelację między stężeniem iryzyny a wskaźnikiem QUICKI. 3

4 Ostatnią analizowaną adipokiną była waspina. Autorka wykazała znamiennie niższą waspinemię w grupie pacjentów otyłych ze świeżo rozpoznaną cukrzycą typu 2 przed wdrożeniem terapii, względem osób zdrowych. Sześciomiesięczna terapia metforminą spowodowała natomiast 48 [%]-owy wzrost stężenia oznaczanej waspiny w osoczu krwi w porównaniu z okresem przed leczeniem. Ponadto w grupie otyłych chorych z cukrzycą typu 2 przed wdrożeniem leczenia farmakologicznego wykazano istotne statystycznie korelacje osoczowego stężenia waspiny z trzema parametrami dodatnie z HOMA-IR i stężeniem insuliny oraz ujemną ze wskaźnikiem insulinowrażliwości %S. W niniejszej pracy w grupie badanej po półrocznym leczeniu metforminą odnotowano natomiast negatywną zależność pomiędzy stężeniem waspiny a wskaźnikiem QUICKI. Wykazane w niniejszej pracy wszystkie korelacje omawianej adipokiny dotyczą parametrów związanych z gospodarką węglowodanową. Stąd Autorka stwierdza, że stężenia krążącej w surowicy waspiny mogą odzwierciedlać stopień wrażliwości na insulinę obniżony w momencie zdiagnozowania choroby, natomiast wyższy po 6 miesiącach stosowania metforminy. Dyskusja i wnioski Dyskusja przeprowadzona jest w sposób bardzo dojrzały i świadczy o dużej wiedzy Doktorantki i umiejętności analizy. Autorka porównuje wyniki własne z innymi badaczami. Zaznacza, że prowadzi się wiele badań molekularnych, które dotyczą cukrzycy typu 2 i które potwierdziły udział tkanki tłuszczowej w przewlekłych stanach zapalnych i insulinooporności, czyli dwóch istotnych czynników ryzyka rozwoju miażdżycy i powikłań sercowonaczyniowych. Podkreśla, że tkanka tłuszczowa pełni funkcję narządu endokrynnego, stanowiącego źródło m.in. prozapalnych, regulatorowych molekuł, czyli adipokin, które odgrywają kluczową rolę m. in. w przebiegu stanu zapalnego, w odpowiedzi immunologicznej, angiogenezie, w rozwoju miażdżycy, w metabolizmie lipidów, w regulacji insulinowrażliwości oraz przemian węglowodanów. Autorka podjęła się wyjaśnienia roli niedawno odkrytej adropiny, która obok iryzyny i waspiny stanowi molekułę wydzielaną przez tkankę tłuszczową. Sugeruje potrzebę precyzyjnego określenia molekularnych oraz patobiochemicznych mechanizmów działania w/w adipokin, co mogłoby posłużyć do zaprojektowania skuteczniejszych schematów postępowania farmakoterapeutycznego stąd powzięty temat dysertacji. Autorka przeprowadziła ilościową ocenę adropiny, iryzyny i waspiny w osoczu krwi otyłych pacjentów ze świeżo rozpoznaną, dotychczas nieleczoną cukrzycą typu 2 oraz u tych samych pacjentów po sześciu miesiącach stosowania metforminy, w odniesieniu do adropinemii, iryzynemii i waspinemii osób zdrowych. Dokonała analizy współzależności pomiędzy osoczowym stężeniem oznaczonych peptydów, a wykładnikami insulinooporności i funkcji nerek oraz różnymi parametrami biochemicznymi. Podjęła próbę identyfikacji zestawu oznaczeń biochemicznych istotnie różniących się u otyłych osób zdrowych i otyłych chorych z cukrzycą typu 2 oraz zmieniających się u pacjentów z cukrzycą typu 2 pod wpływem 6-miesięcznej terapii metforminą, a tym samym różnicujących stan pacjentów przed i po leczeniu. Do wymienionych analiz danych zastosowała zarówno statystyczne miary siły związków poszczególnych parametrów, jak również metody wielowymiarowe, włączając analizę dyskryminacyjną oraz analizę wieloczynnikową wywodzącą się z metod uczenia maszynowego. Autorka wykazała brak istotnych różnic w osoczowym stężeniu adropiny u osób chorych na cukrzycę typu 2 po sześciomiesięcznej terapii metforminą względem sytuacji przed leczeniem, a także pod względem adropinemii osób grupy kontrolnej co jest rozbieżne z wynikami większości dotychczas przeprowadzonych badań, wskazujących na znaczące zmiany stężenia adropiny w przebiegu chorób związanych z opornością na insulinę m.in. w cukrzycy typu 2. Wykazała natomiast istotne statystycznie, dodatnie korelacje pomiędzy 4

5 stężeniem adropiny a stężeniem triacylogliceroli i wartością wskaźnika triacyloglicerole/hdl w grupie badanej z cukrzycą typu 2 przed rozpoczęciem terapii metforminą, co może potwierdzać udział omawianej biomolekuły w patogenezie przemian metabolicznych zachodzących w przebiegu otyłości, towarzyszącej cukrzycy typu 2, co znalazło potwierdzenie w licznych publikacjach. Niewątpliwie wielkim atutem pracy jest zastosowanie analiz wykorzystujących metody sztucznej inteligencji co jest wielce pomocne w diagnostyce choroby i użyteczne klinicznie w podjęciu decyzji o wdrożeniu terapii behawioralnej bądź farmakologicznej. W/w analiza przybliża zależności pomiędzy wartościami osoczowego stężenia ocenianych adipokin i molekuł regulatorowych, a wybranymi parametrami funkcji nerek, wrażliwości tkanek na działanie insuliny i badaniami biochemicznymi. Doktorantka na podstawie wstępnej analizy statystycznej wyselekcjonowała zbiór 10 parametrów, opisujących pacjentów z cukrzycą typu 2: HOMA-IR, QUICKI, ACR, egfr, HbA1c, egdr, %B, %S, stężenie insuliny oraz stosunek TG/HDL, które obok stężeń 3 wybranych peptydów regulatorowych, posłużyły do dalszych badań metodą trójwymiarowej analizy dyskryminacyjnej, która umożliwia szybką ilościową ocenę powiązań między poszczególnymi cechami w układzie trzech wybranych parametrów i określenie, czy można na ich podstawie odróżnić osoby chore od zdrowych. Ponadto Doktorantka zaproponowała profilowy algorytm, umożliwiający stwierdzenie, czy badane zmienne różnią się u pacjentów z cukrzycą przed i po wdrożeniu terapii metforminą jak również analizy wielowymiarowe w celu wykrycia złożonych zależności pomiędzy osoczowym stężeniem ocenianych molekuł regulatorowych iryzyny i waspiny, a wybranymi parametrami biochemicznymi. Podjęła próbę stworzenia biochemicznych paneli diagnostycznych, które w oparciu o iryzynemię i/lub waspinemię oraz wybrane wskaźniki opisujące stan metaboliczny pacjenta (HbA1c, HDL, LDL, TG, ACR, egfr, glukoza, insulina, QUICKI, HOMA-IR, %S, %B i egdr), ulegają największym zmianom w trakcie zastosowanej terapii farmakologicznej, a tym samym najlepiej różnicują stan pacjenta przed i po leczeniu. Oceniane w niniejszej pracy molekuły regulatorowe, zwłaszcza zaś iryzyna i waspina, potwierdziły swą użyteczność Wnioski zostały sformułowane prawidłowo i odpowiadają celom pracy. Piśmiennictwo Dołączone piśmiennictwo jest prawidłowo cytowane. Składa się z 241 pozycji z czego z ostatnich pięciu lat ( ) stanowi aż 68% cytowań, co świadczy o bardzo dobrej znajomości najnowszego piśmiennictwa dotyczącego podjętego przez Doktorantkę tematu. W pozycji 118 brak jest pełnego roku publikacji. Podsumowując stwierdzam, że przedstawiona mi do oceny dysertacja zawiera oryginalną i nowatorską koncepcję naukowo-badawczą. Ponadto świadczy o doskonałym warsztacie Doktorantki, umiejętności połączenia metod diagnostycznych z nowoczesnymi metodami opartymi na wykorzystaniu narzędzi informatycznych jakimi są analiza dyskryminacyjna i wieloparametrowa analizy danych biomedycznych. Są to pierwsze tego typu analizy wykazujące związek adropiny, iryzyny oraz waspiny ze sobą oraz pozwalające na skonstruowanie trój- i wieloparametrowych paneli diagnostycznych jako czynników dyskryminujących osoby zdrowe od osób z cukrzycą typu 2, przebiegającą z otyłością, a tym samym wskazujących możliwość zastosowania ocenianych molekuł regulatorowych jako wskaźników zaburzeń metabolicznych w cukrzycy typu 2. 5

6 Rozprawa doktorska spełnia warunki określone w art. 13 ust. 1 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. Nr 65, poz. 595, z późn. zm.). Wymienione wyżej uwagi w recenzji w żaden sposób nie umniejszają wartości i oryginalności dysertacji i są jedynie wskazówkami do dalszych publikacji. Na tej podstawie zwracam się do Wysokiej Rady Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach o dopuszczenie mgr Olgi Gala do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Jednocześnie wnoszę o wyróżnienie rozprawy dr hab. n. med. Aleksandra Kasperczyk 6