Grupa Radiobiologii Molekularnej

Transkrypt

1 Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów Centrum Onkologii Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie, Oddział w Gliwicach Grupa Radiobiologii Molekularnej

2 Poszukiwanie markerów molekularnych oraz nowych możliwości metodologicznych w badaniu chorób nowotworowych Grupa Radiobiologii Molekularnej Agnieszka Mazurek

3 Zespół badawczy dr Ewa Małusecka dr Anna Fiszer-Kierzkowska dr Agnieszka Mazurek Urszula Bojko

4 Kształcenie studentów Prace Magisterskie Uniwersytet Śl. (2012) (Pierzyna Magdalena) opiekun A. Mazurek Uniwersytet Śl. (2012) (Agata Gacioch) - opiekun A. Mazurek Obowiązkowe praktyki zawodowe studentów Biotechnologia, Politechnika Śląska; 2013 (Paulina Kowalska, Anna Daniłowicz) opiekun A. Mazurek Biotechnologia, Śląski Uniwersytet Medyczny; 2014 (Nikola Drożdż) opiekun A. Mazurek Biotechnologia, Śląski Uniwersytet Medyczny; 2014 (Magdalena Niemczyńska i Karolina Jandura) opiekun A. Fiszer-Kierzkowska Inżynieria Biomedyczna, Akademia Górniczo-Hutnicza; 2014 (Piotr Ciążyński) opiekun A. Mazurek Wolontariat Politechnika Śląska; (Paulina Kowalska) opiekun A. Mazurek

5 Cel badań Poszukiwanie nowych markerów molekularnych predykcyjnych/prognostycznych chorób nowotworowych Poszukiwanie nowych rozwiązań metodologicznych badanie cfdna zastosowanie w diagnostyce onkologicznej cfdna (circulating) cell-free DNA

6 Materiał do badań Bioptaty: pobrane w czasie diagnostycznej biopsji gruboigłowej chorzy z podejrzeniem raka prostaty - Zakład Radiologii i Diagnostyki Obrazowej Zabezpieczenie materiału biopsyjnego U. Bojko Osocze: chorzy na raka RGiSz - I Klinika Radioterapii i Chemioterapii chorzy na raka płuca - II Klinika Radioterapii i Chemioterapii, Zakład Radioterapii Izolacja osocza i zabezpieczenie materiału biologicznego: U. Bojko, I. Domińczyk, L. Ponge, K. Klyszcz, I. Matuszczyk Izolacja cfdna z osocza: Urszula Bojko Krew do diagnostyki Zespółu Lyncha: Chorzy z podejrzeniem ZL - Krew pobrana w Punkcie Pobierania Krwi i Mat. Tkank. Zabezpieczenie krwi i izolacja genomowego DNA: U. Bojko, L. Ponge Bloczki parafinowe do diagnostyki mutacji w BRAF i EGFR: Chorzy z rakiem płuca Chorzy z czerniakiem

7 8 biopsji diagnostycznych (badanie histopatologiczne) 4 biopsje (po 2 z każdego płata bocznego) - badania naukowe Izolacja RNA Utrwalanie materiału QRT-PCR (mrna) IHC Analiza białka

8 Krew 4-5 ml wirowanie Osocze izolacja DNA elementy morfotyczne izolacja DNA cfdna gdna

9 Tematyka badawcza Poszukiwanie genów, których ekspresja jest markerem predykcyjnym odpowiedzi na leczenie, ze szczególnym uwzględnieniem radioterapii Badanie genów podścieliska, jako markerów diagnostycznych raka prostaty Badanie mutacji somatycznych w KRAS i EGFR w krążącym wolnym DNA (cfdna) w osoczu Analiza DNA pochodzenia wirusowego w osoczu (HPV, EBV) Detekcja mutacji u chorych z klinicznym rozpoznaniem Zespołu Lyncha

10 Poszukiwanie genów, których ekspresja jest markerem predykcyjnym odpowiedzi na leczenie, ze szczególnym uwzględnieniem radioterapii grant KBN ( ) Weryfikacja markerów odpowiedzi na radioterapię w raku gruczołu krokowego z zastosowaniem mikrodyssekcji laserowej i metody Q-PCR, kierownik projektu Ewa Małusecka grant wewnętrzny IO-Gliwice (2008) Zastosowanie markerów molekularnych w raku gruczołu krokowego

11 Szczegółowy opis projektu Podział chorych na podstawie oceny histopatologicznej bioptatów: chorzy z nowotworem złośliwym vs chorzy z nowotworem łagodnym Badane geny: RGS19 (G-protein signaling regulator 19), RbAp48 (Retinoblastoma binding protein), R5PIA (ribose 5-phosphate isomerase A), AMACR (α-methylacyl-coa-racemase), hepsyna, MTA1 (metastasis associated protein 1), TRPM8 (transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 8, PIM1 (serine/threonine-protein kinase Pim-1), HSP27 (heat shock 27), EZH2 (enhancer of zeste homolog 2), AZGP1 (zinc-alpha-2-glycoprotein), MUC1 (mucin 1 transmembrane protein). Geny wskazane w pracach dotyczących prognozowania w przebiegu leczenia promieniami jako geny radiooporności ( RGS19, RbAp48, R5PIA) Geny wskazane w literaturze jako markery niepowodzenia leczenia chirurgicznego ( hepsyna, MTA, TRPM8, PIM1, EZH2, AZGP1, MUC1, HSP27) metody: QRT-PCR oraz IHC Wyniki: Zaobserwowano różnice w ekspresji genów: RGS19, hepsyna, TRPM8, HSPB1 pomiędzy bioptatami w/w grup chorych, ale analiza immunohistochemiczna nie potwierdziła tych obserwacji.

12

13 Badanie genów podścieliska, jako markerów diagnostycznych raka prostaty grant zamawiany Poszukiwanie sygnatury raka w ujemnych histopatologicznie bioptatach pacjentów z rakiem gruczołu krokowego ; grant wewnętrzny IO-Gliwice; Poszukiwanie sygnatury raka w ujemnych histopatologicznie bioptatach pacjentów z rakiem gruczołu krokowego ;

14 Szczegółowy opis projektu Podział chorych na podstawie oceny histopatologicznej bioptatów: chorzy z nowotworem złośliwym w 1 płacie, w 2 płatach i chorzy z nowotworem łagodnym I etap mikromacierze wyselekcjonowanie genów Geny: LSAMP (limbic system-associated membrane protein), LSS (lanosterol synthase (2,3-oxidosqualenelanosterol cyclase)), ATG5 (ATG5 autophagy related 5 homolog (S. cerevisiae)), MAF (v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog (avian)), ALOX15B (arachidonate 15-lipoxygenase, type B), PALMD (palmdelphin), BEX1 (brain expressed, X-linked 1), USP36 (ubiquitin specific peptidase 36), SSP1 (secreted phosphoprotein 1 (osteopontin, bone sialoprotein I, early T-lymphocyte activation 1). Weryfikacja w/w genów: za pomocą QRT-PCR IHC Wyniki: geny ATG, MAF, PALMD, LSAMP, SPP1 - weryfikacja ilościowym RT-PCR różnic pomiędzy grupami, znalezionych w badaniu mikromacierzowym. Różnice znalezione na poziomie ekspresji genów nie zostały potwierdzone immunohistochemicznie; geny ALOX, LSS, USP36 - brak statystycznie znamiennych różnic pomiędzy grupami zarówno na poziomie ekspresji genu jak i białka. Praca w trakcie recenzji

15 Współpraca II Klinika Radioterapii dr Marzena Gawkowska-Suwińska dr Beata Smolska-Ciszewska Zakład Radiologii i Diagnostyki Obrazowej prof. Barbara Bobek-Billewicz dr Justyna Rembak-Szynkiewicz Zakład Medycyny Nuklearnej i Endokrynologii Onkologicznej prof. Barbara Jarząb mgr Małgorzata Kowalska mgr Tomasz Tyszkiewicz dr Michał Jarząb (obecnie III Klinika Radioterapii i Chemioterapii) Zakład Radioterapii

16 Badania nowotworowego krążącego DNA we krwi Grant Nr N N ( ); Ocena przydatności oznaczania krążącego DNA i poszukiwania w nim mutacji somatycznych genów EGFR i KRAS w rakach płuc oraz głowy i szyi. Kierownik projektu Agnieszka Mazurek

17 Detekcja mutacji za w cfdna osocza 160 chorych na raka płuca: rak płaskonabłonkowy (51), gruczolakorak (41), rak niedrobnokomórkowy bez podziału na podtypy (39), rak drobnokomórkowy (16), w 13 przypadkach nie określono podtypu. metoda detekcji TaqMan/PCR

18 Badania mutacji w genie KRAS A. Fiszer Kierzkowska KRAS mut

19 Badania mutacji w genie EGFR A. Mazurek EGFR EGFR mut del EGFR (p.e746 A750del) #127 (squamous carcinoma) #164 (adenocarcinoma)

20 Współpraca II Klinika Radioterapii: prof. Rafał Suwiński lek. med. Monika Giglok lek. med. Urszula Dworzecka Zakład Radioterapii: dr Grzegorz Głowacki dr Grzegorz Woźniak lek. med. Rafał Kawczyński

21

22

23 Detekcja HPV w cfdna chorych na raka regionu głowy i szyi A. Mazurek 200 chorych z nowotworem regionu głowy i szyi (gardło środkowe, nosogardło, krtań) oznaczanie HPV16 i HPV18 specyficzna sonda do HPV16 specyficzna sonda do HPV18 metoda detekcji TaqMan PCR

24 Współpraca I Klinika Radioterapii: dr Tomasz Rutkowski dr hab. Andrzej Wygoda prof. Krzysztof Składowski

25 Badanie mutacji - Zespół Lyncha A. Mazurek, A. Fiszer-Kierzkowska Dziedziczny rak jelita grubego niezwiązany z polipowatością, (ang. hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC) Dziedziczenie autosomalne dominujące Charakterystyka badanej grupy Pacjenci zakwalifikowani na podstawie danych rodowodowo-klinicznych Poradnia Genetyki Onkologicznej i Diagnostyki Molekularnej, IO-Gliwice

26 Współpraca Zakład Patologii Nowotworów dr Ewa Chmielik Poradnia Genetyki Onkologicznej i Diagnostyki Molekularnej dr Magdalena Budryk

27 Badanie immunohistochemiczne (IHC) 14 pacjentów MLH1 (+) MSH2 (-) MLH1(+) MSH2(+) 60% 23% zdegradowana tk. 6% MLH1(-) MSH2(+) 12% MLH1(+) MSH2(-)

28 Zastosowanie HRM do wykrywania mutacji w genach MSH2 i MLH1 c G/G c A/G c A/A Ryc. Wykrywanie częstych polimorfizmów w intronie 14 MLH1 Próbki są grupowane na 3 klastry na podstawie różnic w temperaturach topnienia powstałych z powodu obecności SNP - c (A/A, A/G, G/G). W badaniu amplikonu eksonu 15 wymagane są zatem 3 kontrole.

29

30 Perspektywiczny kierunek badań nowych możliwości metodologicznych takich jak oznaczania KRAS HPV16 Badania mikrorna Mikromacierze SNP Badanie ekspresji (mrna???)

31 Perspektywiczny kierunek badań c.d. Badanie HPV16 w osoczu Weryfikacja wybranych przypadków na skrawkach bipsyjnych Jaki jest cel badania, poza monitorowaniem efektów leczenia?

32 Perspektywiczny kierunek badań c.d. nieinwazyjna metoda, materiał łatwo dostępny umożliwiającego wielokrotną analizę jakim jest krew Obecność krążących komórek nowotworowych (CTC) w diagnostyce i prognozowaniu nowotworów.