Ćwiczenie1,2. Podstawowe zasady działania układu immunologicznego. Odporność nieswoista.

Transkrypt

1 Ćwiczenie1,2. Podstawowe zasady działania układu immunologicznego. Odporność nieswoista. A/ Ocena układu dopełniacza Dopełniacz pośredniczy w wielu reakcjach ogólnoustrojowych jak: odczyn zapalny, fagocytoza, fibrynoliza, wykrzepianie wewnątrznaczyniowe, cytoliza. Prawidłowa funkcja układu dopełniacza zależy od poszczególnych jego składowych oraz inhibitorów. Ocenę układu dopełniacza przeprowadza się celem wykrycia wrodzonych niedoborów składników dopełniacza oraz w diagnostyce chorób, w których dochodzi do jego pobudzenia. Określa się poziom poszczególnych składników dopełniacza oraz jego aktywność, nie mniej prawidłowy poziom składowych nie przesądza o ich funkcjonalnej aktywności. Oznaczanie całkowitego stężenia składowych w surowicy - najczęściej C3, C4, C1 inhibitora, czynnika B, czynnika P (properdyna). Wykorzystuje się metody serologiczne z wykorzystaniem swoistych przeciwciał: immunodyfuzja radialna, ELISA, RIA lub metody turbidymetryczne i nefelometryczne. Studenci oznaczają poziom C3c i C4 metodą immunodyfuzji radialnej (płytki NOR Partigen): mierzą średnicę i ustalają poziom w g/l wg tablic. Poziomy Znaczne obniżenie C3c jest obserwowane w chorobach autoimmunizacyjnych (lupus erythematosus, glomerulonephritis), niewielki spadek w schorzeniach wątroby (przewlkełe zapalenie, marskość poalkoholowa), wzrost u chorych w ostrych i przewlekłych zakażeniach. C4 (wchodzi w skład konwerttazy C5) jest obniżony w lupus erythematosus i wrodzonym obrzęku naczyniowym. Wrodzony brak C1inhibitora (reguluje klasyczną drogę aktywacji hamuje aktywność proteazy serynowej C1s i C1r) prowadzi do obrzęku naczynioruchowego, nabyty występuje w zaburzeniach B limfocytów (przewlekłe białaczki, szpiczak mnogi). Oznaczanie aktywności dopełniacza *Metoda 50% hemolizy CH50 Określa ona aktywność hemolityczną surowicy i pozwala ocenić całkowity przebieg klasycznej drogi aktywacji dopełniacza. Ustala się stężenie surowicy, przy którym dochodzi do lizy 50% wystandaryzowanej zawiesiny erytrocytów barana opłaszczonych swoistymi przeciwciałami królika (amboceptor). Test ten wykonuje się w probówkach lub w mikrostudzienkach. Mniej dokładna jest metoda 100% hemolizy CH100, oparta na tej samej zasadzie. Studenci oglądają metodę probówkową CH100. Prawidłowa aktywność 20 j. *Hemoliza radialna W płytce z agarem, który zawiera erytrocyty opłaszczone przeciwciałami wycina się studzienki, do których dodaje się surowicę badaną. Wokół dołków powstają strefy hemolizy, których średnice są proporcjonalne do ilości dopełniacza. Jeżeli stwierdza się obniżoną aktywność można określić, którego składnika brakuje. Wykorzystuje się wtedy krwinki opłaszczone przeciwciałem i tzw. odczynnikiem dopełniaczowym. Jest to surowica świnki morskiej czy myszy, w której brakuje składowej dopełniacza będącej przedmiotem testu. Następnie oddajemy surowicę badaną. Jeżeli wystąpi hemoliza, to oznacza, że składowa jest obecna. Brak hemolizy wskazuje na niedobór tego składnika dopełniacza w badanej surowicy. B/ Ocena funkcji komórek fagocytujących Granulocyty, monocyty i makrofagi stanowią pierwszą linię obrony organizmu przed obcymi antygenami. Biorą udział w odporności nieswoistej a także w wielu mechanizmach swoistej

2 odpowiedzi immunologicznej. Podstawowe funkcje biologiczne to: zdolność chemotaksji, fagocytozy (pochłaniania) i wewnątrzkomórkowego zabijania. Ocena chemotaksji Zdolność do chemotaksji tj. ukierunkowanego ruchu w odpowiedzi na bodziec chemotaktyczny (składowe C3a, C5a, C567; produkty mikororganizmów: endotoksyna, peptydopglikan, kwasy tejchojowe, zymozan; fibrynogen, PAF, LTB4, IL 1, IL 8) można badać: *metoda agarozowa. Na płytkę Petriego (podłoże odżywcze z 0,75% agarozą) do odpowiednio wyciętych studzienek nanosi się zawiesinę badanych komórek, do innych chemoatraktanty. Po 2,5 godz. inkubacji, w temp. 37 o C i w 5% CO 2i płytki utrwala się formaliną. Po zdjęciu agarozy i wybarwieniu przyklejonych do szkła komórek, mierzy się zasięg (w mm) migracji komórek w kierunku czynnika chemotaktycznego i migrację spontaniczną do medium kontrolnego i oblicza indeks chemotaktyczny. *metoda Boydena. Stosuje się specjalne komory z filtrem miliporowym (błona nitrocelulozowa) o wielkości porów 3 5 um (dla granulocytów) i 8 um (dla makrofagów). Po inkubacji i zabarwieniu liczy się komórki, które przechodzą przez błonę w kierunku bodźca chemotaktycznego. Ocena zdolności fagocytarnych Ważnym etapem fagocytozy jest rozpoznanie cząsteczki fagocytowanej przez receptory fagocyta: FcR (dla przeciwciała) i CR (dla C3b dopełniacza). Zdolność fagocytarną komórek żernych najczęściej określa się w stosunku do bakterii (Staphylococcus aureus, pałeczki Gram-ujemne) lub grzybów (Candida), rzadziej cząstek mineralnych (lateks). *metoda Wrighta (probówkowa) do 1 ml pełnej krwi (zawiera opsoniny) pobranej na cytrynian sodu dodaje się odpowiedniej gęstości zawiesinę bakterii lub grzybów (mogą być żywe lub zabite). Inkubuje 30 min. w temp. 37 o C, odwirowuje, z kożuszka krwinek białych sporządza rozmaz na szkiełku podstawowym, barwi metodą Giemsy i w mikroskopie świetlnym oblicza: odsetek komórek fagocytujących (liczy się granulocyty obojętnochłonne, ale fagocytują też monocyty) oraz indeks fagocytarny tj. średnią liczbę drobnoustrojów sfagocytowanych przez jeden fagocyt. Wyższe wskaźniki fagocytarne uzyskuje się stosując żywe zawiesiny drobnoustrojów. W modyfikacji można zastosować izolowane np. na Gradisolu fagocyty oraz inkubowane wcześniej z surowicą drobnoustroje. Studenci oglądają preparaty barwione z fagocytozą gronkowców. Fagocytują przede wszystkim granulocyty obojętnochłonne (PMN) oraz monocyty. Wartości u zdrowych dorosłych osób: odsetek fagocytujących PMN 60 80%, indeks fagocytarny 5-10 gronkowców sfagocytowach przez jeden PMN. Wartości podwyższone występują w ostrych zakażeniach bakteryjnych, obniżone występują w niedoborach układu fagocytarnego, w przewlekłych zakażeniach bakteryjnych. Ocena wewnątrzkomórkowego zabijania (killing) Do badania stosuje się tylko żywe zawiesiny. Testy pozwalają określić kinetykę zabijania. *metoda biologiczna zawiesinę leukocytów inkubuje się z opsonizowanymi bakteriami. Po np. 15, 30, 60 min. doprowadza się do lizy fagocytów i uwolnione nie zabite bakterie wysiewa na agar a następnie liczy wyrośnięte kolonie c.f.u. (colony forming units). Znając ilość wyjściowej zawiesiny można obliczyć % zabijania. Metoda bardzo pracochłonna. *z oranżem akrydyny po inkubacji fagocytów z żywymi bakteriami dodaje się oranżu akrydyny i w mikroskopie fluorescencyjnym liczy % zabitych (czerwone) i żywych (zielone) bakterii wewnątrz fagocyta. Metoda pozwala ocenić zdolność pochłaniania i zdolność zabijania.

3 *metoda izotopowa opiera się na wiązaniu znakowanej trytem tymidyny przez bakterie niepochłonięte przez fagocyty. W teście można oceniać fagocytozę i zabijanie. W liczniku scyntylacyjnym mierzy się stopień radioaktywności samych bakterii oraz sfagocytowanych i oblicza indeks fagocytarny oraz indeks zabijania. Ocena wewnątrzkomórkowego metabolizmu fagocytów Wewnątrzkomórkowe zabijanie i degradacja pochłoniętych cząstek odbywa się na drodze zależnej od tlenu, związanej z wybuchem tlenowym komórki żernej (generacja rodników ponadtlenkowych) i tlenowo niezależnej. Do oceny służą następujące testy: * Test NBT w przebiegu procesów tlenowych wzrasta poziom nukleotydów NADH i NADPH. Nukleotydy wykazują zdolność redukcji pochłoniętego błękitu nitrotetrazoliowego (NBT) do formazanu. Przy prawidłowej funkcji metabolicznej w fagocytach odkładaja się w cytoplazmie nierozpuszczalne ciemnoniebieskie złogi formazanu. - Test spontaniczny roztwór NBT dodaje się do heparynizowanej krwi żylnej, 20 min. inkubuje, wykonuje rozmazy, barwi Giemsą lub safraniną i oblicza w mikroskopie liczbę komórek NBT (+). Wartości prawidłowe: 0 14% komórek NBT (+). Wartości podwyższone przemawiają za toczącą się infekcją bakteryjną (pasożyty zewnątrzkomórkowe), wartości obniżone wymagają wykonanie testu pobudzonego. - Test pobudzony do pobudzenia możemy użyć zawiesinę lateksu, bakterii, endotoksynę. Wartości poniżej 40% mogą wskazywać na defekt metaboliczny lub obecność zakażenia przebiegającego z uszkodzeniem granulocytów. Studenci oglądają preparaty i szukają formazano-dodatnich komórek. * chemiluminescencja zjawisko chemiluminescencji (Cl) polega na emisji fotonów przez nietrwałe wzbudzone cząsteczki, np. wolne rodniki tlenowe. Liczbę emitowanych fotonów można mierzyć przy użyciu chemiluminometru lub licznika scyntylacyjnego i wyraża się jako liczbę zliczeń przypadających na jednostkę czasu lub w postaci krzywych. Ponieważ naturalna Cl jest mało wydajna, celem jej wzmocnienia stosuje się tzw. luminofory (luminol, lucygenina, estry forbolu, opsonizowane bakterie...). Luminol odzwierciedla reakcje zależne od mieloperoksydazy, lucygenina poziom aniomu ponadtlenkowego. Studenci oglądają wykresy chemiluminiscencji makrofagów otrzewnowych. Wykresy są zależne od odpowiednich proporcji komórek fagocytujących, luminolu,substancji aktywujących. Krzywe CL układają się indywidualnie u poszczególnych chorych i nie zawsze korelują z innymi testami., np. NBT, fagocytarnymi czy killing. Poszczególne testy badają nieco odmienne mechanizmy. Dla pełnej oceny wydolności układu fagocytarnego powinno się wykonać kilka testów równolegle a interpretacja powinna być ściśle powiązana z danymi klinicznymi pacjenta. Uwaga!!! Brak jest ścisłych norm dla większości testów. Laboratoria winny dysponować własnymi normami opracowanymi dla poszczególnych grup wiekowych.

4 ĆWICZENIE 3 Swoista odpowiedź immunologiczna komórkowa Komórki biorące udział w odpowiedzi immunologicznej tzw. komórki immunologicznie kompetentne najczęściej uzyskuje się z krwi obwodowej, rzadziej z płynów ustrojowych i tkanek litych (migdałki, węzły). Krew wciąż zasilana jest komórkami pochodzącymi ze szpiku i stanowi drogę stałej migracji komórek pomiędzy narządami limfatycznymi. Należy jednak pamiętać, że układ odpornościowy reaguje kompleksowo, posiada szereg mechanizmów regulujących i miarodajna ocena komórek wymaga zarówno badania składu ilościowego jak i poszczególnych funkcji. Wstępnym badaniem komórek układu immunologicznego jest określenie liczby krwinek białych w 1 mm 3 (leukocytoza) i ocena wzoru Schillinga odsetkowy skład krwinek białych (limfocyty, monocyty, neutrofile, eozynofile, bazofile, ewentualnie inne) Metody izolacji komórek Najczęściej pobiera się krew z żyły łokciowej na antykoagulanty: heparyna (20-50 IU/ml krwi), 3,8% cytrynian sodu, 4mM wersenian sodu (EDTA), rzadziej na perełki szklane (krew odwłókniona). *metoda spontanicznej sedymentacji - najprostsza, wykorzystuje zróżnicowaną szybkość opadania różnych krwinek, 1 2 godz. 37 o C. Opadanie można przyspieszyć dodając roztwór dekstranu czy 3% żelatyny lub poprzez wirowanie na niewielkich obrotach. Uzyskujemy: w osadzie krwinki czerwone, w supernatancie (nadsączu) krwinki białe, które można dalej izolować celem uzyskania czystych populacji, np. limfocytów, granulocytów, eozynofili... * metoda izolacji w gradientach gęstości wykorzystuje różnice w wielkości i ciężarze właściwym poszczególnych komórek. Stosuje się mieszaniny rozdzielające: Ficoll (Percoll) Isopaque (Uropolina) [metoda Boyum,a], Limfoprep, Gradisol (mieszanina Uropoliny i dekstranu) o różnej gęstości. Krew z antykoagulantem nawarstwia się na warstwę gradientu w probówce plastikowej. Probówkę wiruje w temp. pokojowej, 400xg, 20 min. i zbiera w interfazie komórki. W wielostopniowym, odpowiednio przyrządzonym gradiencie można izolować różne populacje komórek, np. limfocyty T i B, granulocyty, eozynofile, monocyty, NK. Studenci nawarstwiają bardzo delikatnie po 2 ml krwi pobranej na EDTA na Gradisol G (2 probówki), oglądają sedymentację spontaniczną a z drugiej po odwirowaniu i próbują zebrać krwinki białe z interfazy. *metoda adherencji służy do izolacji komórek adherujących do szkła: monocyty, granulocyty. Niezależnie od metody izolacji zawsze należy sprawdzić żywotność komórek w mikroskopie (wykorzystuje się przepuszczalność błony komórkowej po dodaniu np. 0,1% błękitu trypanu martwe komórki są niebieskie), czystość frakcji (np. metoda Giemsy) oraz wielkość odzysku komórek (liczy się komórki w komorze w stosunku do zawiesiny wyjściowej). Oznaczanie markerów powierzchniowych Celem zróżnicowania komórek immunologicznie kompetetnych (rodzaj, odsetek) izolowanych z krwi obwodowej (najczęściej dotyczy to limfocytów) określa się za pomocą przeciwciał monoklonalnych obecne na komórkach antygeny różnicowania CD (cluster of differentiation). Należy jednak pamiętać, że ekspresja na błonie komórkowej markera nie zawsze odpowiada funkcji komórki. Dodatkowe markery mogą się ujawniać w czasie aktywacji komórki, dlatego ostrożnie należy interpretować uzyskane wyniki. * testy rozetkowe mają już dzisiaj znaczenie historyczne. Różnicowały limfocyty T, które charakteryzują się zdolnością tworzenia rozetek z erytrocytami barana test E (wiązanie poprzez CD2) oraz limfocyty B test EA (erytrocyty opłaszczone przeciwciałem wiązały się poprzez receptor Fc na limfocycie B) oraz test EAC (erytrocyty opłaszczone przeciwciałem i

5 dopełniaczem wiązały się poprzez receptor C3). U dorosłej osoby wartości testu E: 60 75%, testów EA i EAC: 20 25%. Studenci oglądają test E przygotowany wcześniej w mikroskopie oraz na zdjęciach. * metody immunofluorescencyjne pozwalają określić antygeny powierzchniowe (molekuły o różnym ciężarze cząsteczkowym) żywych komórek ocenia się metodą IF bezpośredniej wykorzystując swoiste przeciwciała monoklonalne mysie lub IF pośredniej (dodatkowo dodaje się surowicę antyglobulinową mysią), np. - anty-cd3 wykrywa limfocyty T CD3(+), tj. receptor odpowiedzialny za przekazywanie sygnału antygenowego do limfocytów T, - anty-cd4 wykrywa limfocyty Th CD4(+) receptor dla MHC kl.ii i HIV - anty-cd8 wykrywa limfocyty Tc/Ts CD8(+) oraz niektórych NK - anty-cd19 wykrywa limfocyty B i pre-b, receptor odpowiedzialny za aktywację i proliferację B Normy w krwi obwodowej: T CD % T CD % T CD % B CD % Wskaźnik CD4/CD8 1,7 2,0 Studenci oglądają prospekty z przeciwciałami monoklonalnymi mysimi oraz wykrywanie subpopulacji limfocytów metodą IF pośredniej. Świecenie, w zależności od stosunków biochemicznych w komórce może być regularne pierścieniowe (równomierne rozmieszczenie antygenu, duże stężenie przeciwciał), kropkowe (duże rozcieńczenie przeciwciał, najczęściej występuje) lub obraz czapeczki (capping antygeny zgrupowane na biegunie komórki). Ocena funkcji limfocytów Rozwój odpowiedzi immunologicznej związany jest z proliferacją określonej subpopulacji limfocytów, które normalnie znajdują się w stanie spoczynku. Dochodzi do przeniesienia sygnału prze błonę cytoplazmatyczną i aktywacji wewnątrzkomórkowych przemian enzymatycznych. Morfologicznie małe limfocyty przekształcają się w duże komórki blastyczne (duże jądro o luźnej chromatynie, widoczne jąderka, podziały mitotyczne, chromosomy, rzadsza cytoplazma..). Pobudzone limfocyty syntetyzują i uwalniają do środowiska różne cytokiny. *test transformacji blastycznej ocenia zdolność limfocytów do proliferacji. Limfocyty stymuluje się swoistymi antygenami, np. oczyszczona tuberkulina - PPD, anatoksyna tężcowa, drożdżaki, gronkowce... (w przypadku pierwotnej stymulacji transformuje kilka % limfocytów, przy wtórnej ok. 15%) lub tzw. nieswoistymi mitogenami, które mogą być pochodzenia roślinnego (lektyny) lub bakteryjnego, np. fitohemaglutynina (PHA stymuluje limfocyty T i B), konkanawalina A (ConA limfocyty T), mitogen szkarłatki PWM (limfocyt B), lipopolisacharyd (LPS limfocyty B), białko A gronkowca (limfocyty B). Pod wpływem mitogenów transformuje 70 90% komórek. Stosuje się: * metoda morfologiczna odsetek komórek blastycznych ocenia się w mikroskopie świetlnym, w preparacie wykonanym z osadu 3-5 dniowej hodowli izolowanych limfocytów z mitogenem lub antygenem. Studenci oglądają preparaty z tranformacji blastycznej limfocytów pod wpływem PHA barwione metodą May-Grunwalda-Giemsy, zwracając uwagę na odsetek i wygląd transformowanych komórek. * metoda izotopowa proliferację ocenia się przez pomiar włączania tymidyny znakowanej trytem do DNA jąder dzielących się intensywnie komórek blastycznych po stymulacji mitogenem czy antygenem. Określa się indeks stymulacyjny w stosunku do kontroli (hodowla limfocytów bez stymulacji).

6 * test mieszanej hodowli limfocytów limfocyty pochodzące od różnych genetycznie dawców, hodowane razem, ulegają proliferacji ze względu na różnice w składzie antygenów zgodności tkankowej. Im większa zgodność, tym mniejsza proliferacja. (przy przeszczepie szpiku). * test hamowania migracji leukocytów MIF - ocenia on zdolność limfocytów do produkcji pod wpływem mitogenu lub antygenu cytokin (głównie IFN- ), które hamują migrację komórek fagocytujących (makrofagi, granulocyty). Określa się wskaźnik zahamowania migracji w stosunku do kontroli. Proliferacja oraz zahamowanie migracji może być upośledzone w niedoborach pierwotnych i wtórnych, oparzeniach, chorobach autoimmunizacyjnych, immunosupresji, zakażeniach HIV. Laboratoria powinny mieć swoje normy. * pomiar stężenia cytokin stosuje się komercyjne testy ELISA, zawierające swoiste przeciwciała monoklonalne przeciwko danej cytokinie, np. Il-2, IFN- (charakterystyczne dla odpowiedzi komórkowej), Il-4, Il-6 (charakterystyczne dla odpowiedzi humoralnej), TNF- (pobudzenie makrofagów). W chorobach o podłożu autoimmunologicznym czy alergicznym dochodzi do zaburzonego uwalniania cytokin. Brak jest jednak uniwersalnego zakresu norm dla poszczególnych cytokin i badania są wykonywane głównie w celach naukowych. Studenci oglądają prospekty do oznaczania cytokin oraz oznaczanie cytokin metodą ELISA i ocenę stężenia w komputerze. * testy cytotoksyczne wykorzystywane są do oceny bezpośredniej cytotoksyczności limfocytów T i NK oraz w mechaniźmie ADCC (komórki cytotoksyczne musza posiadać receptor Fc). Komórki efektorowe inkubuje się z celem (inne limfocyty, komórki nowotworowe, przeszczepu, zakażone wirusem, komórki opłaszczone przeciwciałem mechanizm ADCC). Po kilkugodzinnej inkubacji (ok. 4 godz. dla limfocytów, godz. dla makrofagów) dodaje się barwnika, np. eozyny czy błękitu trypanu, który wnika do martwych komórek liczy się odsetek martwych komórek pod mikroskopem. Ocenę martwych komórek można ocenić stosując chrom 51 i mierząc radioaktywność. Studenci oglądają testy limfocytotoksyczne w układzie: komórki Tc zabijające komórki białaczki limfatycznej L-1210 (na płytkach Terasaki). Cytometria przepływowa wykorzystuje się aparat o nazwie FACS (aktywowany fluorescencyjnie sorter komórek fluorescence-activated cell sorter). Stosując laser argonowy o długości fali 488 nm jako źródło światła oraz detektor rozpraszania światła i detektor fluorescencji, analizuje się i rozdziela przepływające komórki. Poszczególne komórki wykazują zróżnicowaną autofluorescencję i rozproszenie światła. W zależności od stosowanych przeciwciał monoklonalnych znakowanych fluorochromami oraz typu analizy (mogą być wieloparametrowe) można badać zaburzenia ilościowe i jakościowe w subpopulacjach, obecność i gęstość pojedynczych epitopów na komórce, współzależności, monitorować leczenie a także przeprowadzać badania czynnościowe komórek układu odpornościowego (odpowiedź proliferacyjną pod wpływem mitogenów, stan aktywacji limfocytów poprzez określanie ekspresji antygenów charakterystycznych tylko dla pobudzonych komórek, np. receptora dla Il-2 (CD25), zdolność produkcji i uwalniania cytokin, cytotoksyczność T i NK, apoptozę, fagocytozę i wybuch tlenowy granulocytów). Badanie można przeprowadzić z krwi, szpiku, węzłów chłonnych, guzów nowotworowych, płynów ustrojowych itp. Cytometria najczęściej jest wykorzystywana do diagnostyki i monitorowania chorób limfoproliferacyjnych, a także w diagnostyce pierwotnych niedoborów immunologicznych, chorób autoimmunizacyjnych, chorych HIV(+), w transplantologii, Koszty badania są jednak bardzo wysokie, wymuszają jednakowe zasady pracy i standaryzację stosowanych metod celem ustalenia norm w zależności od wieku, płci.

7 ĆWICZENIE 4 Swoista odpowiedź immunologiczna humoralna Odpowiedź humoralna wiąże się z aktywacją i klonalną proliferacją limfocytów a następnie produkcją swoistych przeciwciał przez komórki plazmatyczne. W ocenie odpowiedzi humoralnej bada się więc poziom limfocytów B (na podstawie markerów powierzchniowych) i ich zdolność do proliferacji (pod wpływem mitogenów), stężenie immunoglobulin i ich podklas a także oznacza poziomy swoistych przeciwciał dla różnych antygenów. Do oceny poziomu immunoglobulin oraz poziomów swoistych przeciwciał wykorzystuje się różne odczyny serologiczne (przebiegające in vitro) oparte na reakcji antygen-przeciwciało. (Generalnie reakcje antygen-przeciwciało są szeroko wykorzystywane w diagnostyce klinicznej i służą do identyfikacji oraz oznaczeń ilościowych zarówno antygenów jak i przeciwciał. W zależności od stanu fizycznego antygenu (komórka bakteryjna, krwinka, fragmenty komórki, białko, polisacharyd...) i charakteru interakcji wyróżnia się dwie zasadnicze grupy metod: oparte na aglutynacji i precypitacji. Poszczególne metody mają różną czułość i swoistość. Reakcje antygen-przeciwciało, które zachodzą in vivo lub można badać tylko w organizmie żywym (żywa komórka)to: opsonizacja, neutralizacja toksyny, neutralizacja virusa. Metody oparte o zjawisko aglutynacji Przeciwciała łączą się z nierozpuszczalnym antygenem/antygenami znajdującymi się na powierzchni cząstki stałej (komórka bakteryjna, krwinka, cząstki lateksu), prowadzą do zlepiania się tych cząstek i powstawania widocznych gołym okiem tzw. aglutynatów. Mówimy o aglutynacji bakteryjnej, lateksowej, hemaglutynacji. Odmiany testów: * aglutynacja szkiełkowa test jakościowy, najczęściej służy do wykrywania nieznanych antygenów przy pomocy znanych przeciwciał swoistych. Stosowany jest rutynowo w identyfikacji szczepów, tzw. typowaniu serologicznym, np. Salmonella, Shigella, E. coli. Pozwala określić gatunek lub serotyp. Wykonanie: na szkiełko podstawowe daje się kroplę surowicy zawierającej swoiste przeciwciała, następnie rozprowadza ezą identyfikowany szczep bakterii. W ciągu 1 2 min. powstaje aglutynacja. Obowiązkowo należy zrobić kontrolę szczepu w fizjologicznym roztworze NaCl nie powinna powstać aglutynacja (szczep gładki), jeżeli powstaje jest to szczep szorstki, z którym nie można wykonać aglutynacji, bo daje tzw. pseudoaglutynację. W przypadku użycia krwinek (oznaczanie grup krwi) mówimy o hemaglutynacji. Studenci wykonują aglutynację szkiełkową typują enteropatogenne szczepy E. coli oraz krwinki barana *aglutynacja probówkowa służy najczęściej do wykrycia i ustalenia miana przeciwciał w surowicy przy pomocy znanych antygenów. Wykonuje się kolejne rozcieńczenia surowicy w fizjologicznym roztworze NaCl, np. 1:10, 1:20, 1:40, 1:80...(rozcieńczenia ustala się w zależności od spodziewanego miana). Następnie do probówek dodaje się stałą zawiesinę antygenu, inkubuje 18 godz. w temp. 37 o C i odczytuje w aglutynoskopie. Miano przeciwciał jest to najwyższe rozcieńczenie surowicy, w której stwierdza się jeszcze aglutynację. Klasycznym przykładem wykorzystania aglutynacji probówkowej jest odczyn Widala, stosowany w diagnostyce duru brzusznego i paradurów. Wykrywamy przeciwciała przeciwko antygenom somatycznym O (aglutynacja grudkowa) i antygenom rzęskowym H (aglutynacja obłoczkowa). Inne odczyny: Wrighta w diagnostyce brucelozy, Wiel-Felixa w diagnostyce duru plamistego. Studenci oceniają aglutynację probówkową, grudkową i rzęskową S. typhi oraz miano przeciwciał (odczyn Widala) *aglutynacja pośrednia polega na reakcji przeciwciał z antygenem opłaszczonym na nośniku, którym może być lateks. W przypadku opłaszczenia lateksu przeciwciałami

8 możemy wykryć antygen na tej zasadzie oparte są testy lateksowe, służące do różnicowania paciorkowców hemolizujących (Strepto-kit). *hemaglutynacja bierna odczyn wykonuje się na płytkach z zagłębieniami, do których najpierw daje się rozcieńczenia surowicy a następnie krwinki opłaszczone antygenem. Po 2 godz. inkubacji w temp. pokojowej występuje hemaglutynacja i można określić miano. Odmianą tego odczynu jest zahamowanie hemaglutynacji biernej, kiedy wstępnie materiał inkubuje się z surowicą wzorcową zawierającą przeciwciała a następnie dodaje krwinek opłaszczonych homologicznym antygenem. Metody te są stosowane do wykrywania antygenów wirusowych, hormonów. *odczyn Coombsa służy do wykrycia tzw. przeciwciał niekompletnych (zwykle IgG), które są zbyt krótkie i nie mogą przyłączyć antygenów na różnych komórkach i wytworzyć widocznej sieci, opłaszczają tylko pojedyncze komórki. Aby uwidocznić reakcję dodaje się surowicy antyglobulinowej, zawierającej przeciwciała przeciwko białkom immunoglobulinowym (stanowią antygen), które doprowadzają do aglutynacji. Odczynem tym (pośredni) wykrywa się przeciwciała anty-rhd w surowicy matki w przypadku konfliktu serologicznego. Natomiast u dziecka wykonuje się tzw. bezpośredni odczyn Coombsa dodaje się surowicy antyglobulinowej do krwinek dziecka, ponieważ są one już opłaszczone przeciwciałami. W niektórych chorobach, np. w brucelozie powstają przeciwciała niekompletne, które można wykryć pośrednim odczynem Coombsa. Metody oparte o zjawisko precypitacji Metody te oparte są o zasadę, że tzw. antygeny rozpuszczalne (białka, polisacharydy, glikoproteiny..) łączą się z wolnym przeciwciałem i tworzą agregaty/strąt/precypitat. W zależności stężenia antygenu i przeciwciał powstają większe lub mniejsze kompleksy antygen-przeciwciało. Wpływa to na intensywność reakcji największe kompleksy powstają w tzw. strefie równowagi. Ma to istotne znaczenie również w organizmie, kiedy dochodzić może do odkładania się kompleksów w tkankach i niekorzystnych reakcji zapalnych. *precypitacja pierścieniowa wyłącznie jakościowy odczyn, na surowicę zawierającą przeciwciała nawarstwia się delikatnie antygen lub odwrotnie. W miejscu zetknięcia się i równowagi (strefa ekwiwalencji) powstaje pierścień precypitacyjny. Studenci wykonują delikatnie precypitację pierścieniową, wykrywają w roztworze obecność np. toksyny jadu kiełbasianego *podwójna dyfuzja (immunodyfuzja) w żelu - metoda Outcherlony,ego, jakościowa. W agarze wycina się studzienki, do których odpowiednio nanosi się roztwór antygenu i przeciwciał, które dyfundują w agarze. Po inkubacji powstają łuki precypitacyjne. Studenci oglądają wykrywanie przeciwciał dla kwasów tejchojowych(antygen) w badanych próbkach surowicy *immunodyfuzja radialna Mancini,ego można oznaczyć niewielkie ilości antygenu. Używa się płytek, pokrytych agarem zmieszanym z przeciwciałami. Do wyciętych studzienek dodaje się surowicę/płyn w którym szuka się antygenu. Kompleksy antygen przeciwciało tworzą w zależności od ilości antygenu, różnej średnicy pierścienie precypitacyjne. Stężenie antygenu obliczamy z krzywej standardowej dla antygenów wzorcowych. Tą metodą oznacza się stężenia immunoglobulin ludzkich, składników dopełniacza, inne białka. Studenci oceniają poziom immunoglobulin w surowicy *immunoelektroforeza jest połączeniem elektroforezy i immunodyfuzji. Służy do oceny białek surowicy. Mieszaninę białek, np. surowicy krwi rozdziela się w elektroforezie, następnie dodaje surowicy odpornościowej. Przeciwciała dyfundują w żelu i tworzą łuki precypitacyjne o odpowiednim kształcie i grubości. Brak niektórych linii świadczy o niedoborze, linie pogrubiałe o nadprodukcji, np. w szpiczaku. Przy zastosowaniu wybiórczych przeciwciał można oznaczać obecność pojedynczych białek.

9 Studenci oglądają immunoelektroforezę białek surowicy krwi * immunoelektroforeza rakietkowa elektroforezę antygenu prowadzi się w żelu zawierającym stałe stężenie przeciwciała. Kompleksy antygen-przeciwciało tworzą w strefie ekwiwalencji linie precypitacyjne przypominające kształtem rakietki. Wysokość rakietki jest wprost proporcjonalna do stężenia antygenu. Studenci oglądają wykrywanie białek układu krzepnięcia metodą imm. rakietkowej. Złożone techniki serologiczne Do oceny reakcji antygen przeciwciało wymagane są dodatkowe czynniki-znaczniki immunodetekcji, systemy wykrywające czy specjalistyczna aparatura. *odczyn lizy wykorzystuje zdolność wiązania dopełniacza przez kompleks antygenprzeciwciało i doprowadzenie do lizy (uszkodzenia) antygenu. Studenci wykonują odczyn lityczny: do dwóch probówek dają: 2 krople 5% krwinek barana lub krwinek ludzkich, dodają 4 krople surowicy z przeciwciałami,(tworzy się aglutynacja), następnie dodają 6 kropli dopełniacza i inkubują w temp.ciała (ktoś trzyma w ręku). Liza występuje w układzie homologicznym. *odczyn wiązania dopełniacza (OWD)- wykorzystuje się zdolność dopełniacza do lizy kompleksu: krwinka czerwona + swoiste przeciwciało. Odczyn jest dwustopniowy i zawiera układ testujący: surowica badana pozbawiona własnego dopełniacza (podgrzana wcześniej do temp. 56 o C) + antygen + dopełniacz, inkubacja, następnie dodaje się system wykrywający: krwinki czerwone owcy + przeciwciała swoiste (amboceptor króliczy). Brak hemolizy świadczy o obecności poszukiwanych przeciwciał odczyn dodatni, obecność hemolizy odczyn ujemny. Prawidłowe wykonanie odczynu wymaga odpowiednich kontroli i precyzyjnej standaryzacji. Do niedawna był stosowany w diagnostyce kiły jako tzw. odczyn Wassermana (jakosciowy) lub Kolmera (ilościowy) Studenci ogladają schemat wykonania odczynu Wassermana. *odczyny immunofluorescencyjne wykorzystuje się znaczniki fluorescencyjne (np. izotiocjanian fluoresceiny) widoczne w mikroskopie fluorescencyjnym. Można znakować antygen lub przeciwciało odczyn bezpośredni lub do kompleksu antygen-przeciwciało dodawać znakowanej surowicy antyglobulinowej odczyn pośredni. Odczyny bezpośrednie częściej stosuje się szeroko do wykrycia antygenów bakteryjnych (Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae..) i wirusowych (wirus wścieklizny, grypy, paragrypy...) w komórkach zakażonych i tkankach. Odczyny pośrednie stosuje się do wykrycia przeciwciał swoistych w kile a także do wykrycia przeciwciał przeciwjądrowych. *odczyny immunoenzymatyczne ELISA (enzyme linked immuno-sorbent assay) antygeny lub przeciwciała opłaszcza się (adsorbuje) na fazie stałej (płytka polipropylenowa, polistyrenowa, kuleczki). Jako znacznika dodaje się enzymu związanego z przeciwciałem (peroksydaza chrzanowa, fosfataza zasadowa). Następnie dodaje się substratu dla enzymu, dającego w reakcji z enzymem barwny produkt (badanie jakościowe). Zmianę zabarwienia można mierzyć ilościowo w specjalnym czytniku należy wtedy każdorazowo ustalić graniczną wartość dodatnią cut-off-value. Metoda ta jest bardzo prosta technicznie posiada wysoką czułość i swoistość. Stosowana jest bardzo szeroko w diagnostyce wirusologicznej, do wykrywania autoprzeciwciał, różnych białek, hormonów itp. Powstało wiele modyfikacji metody ELISA Studenci oglądają wykrywanie antygenu HbsAg metodą ELISA *odczyny RIA (radioimmunoassay) do wykrycia reakcji antygen-przeciwciało wykorzystuje się znaczniki radioizotopowe, np.jod 125 czy jod 131 i mierzy radioaktywność powstałego kompleksu lub supernatantu powstałego po oddzieleniu utworzonego kompleksu. *techniki immunoblotting (Western-blotting) b. czułe, pozwalają wykryć antygeny lub przeciwciała poniżej 0,01 ug/ml. Składa się z 3 etapów: elektroforezy białek na żelu,

10 elektrotransferu rozdzielonych białek na nitrocelulozę, wykrycia białek na nitrocelulozie z zastosowaniem surowicy mającej przeciwciała oraz surowicy antyglobulinowej znakowanej enzymem (np. peroksydaza chrzanowa). Po dodaniu substratu dla enzymu powstaje produkt barwny widoczny jako prążek. Jest to często metoda weryfikująca, np. test potwierdzający dla metody ELISA przy wykrywaniu przeciwciał anty-hiv czy przeciwciał anty-h. pylori. Studenci oglądają oznaczanie przeciwciał anty-helicobacter pylori. ĆWICZENIE 6 Reakcje nadwrażliwości, Reakcje nadwrażliwości typu I (anafilaksja) powstają w wyniku powtórnego podania antygenu/alergenu i krzyżowego(sieciowego) wiązania się z przeciwciałami IgE opłaszczonymi na komórce tucznej lub bazofilu a następnie uwolnieniu aktywnych mediatorów. W zależności od drogi wniknięcia alergenu może być wstrząs anafilaktyczny, astma atopowa, katar sienny, alergie pokarmowe (atopowe zapalenie skóry). Rozpoznanie alergii atopowej (uwarunkowanej genetycznie) opiera się głównie na wywiadzie i badaniu klinicznym oraz testach skórnych. W praktyce dodatkowo mierzy się in vitro poziom całkowitego IgE, poziom swoistych przeciwciał IgE oraz wykonuje się testy świadczące o aktywacji komórek. * oznaczanie całkowitego IgE stężenie IgE w surowicy osób zdrowych jest bardzo niskie, poniżej 0,005% wszystkich Ig. Do oznaczania wykorzystuje się testy radioizotopowe RIST (radioimmunosorbent test - kompetencyjny), PRIST (paper immunosorbent test kanapkowy), testy ELISA wykorzystujące znaczniki immunofluorescencyjne lub chemiluminescencyjne. Normy dla ludzi zdrowych wynoszą IU/ml. Podwyższenie całkowitego IgE obserwuje się szczególnie w atopowym zapaleniu skóry i alergii wieloważnej, ale także w innych stanach patologicznych. 30% chorych na astmę i 60% na alergiczny nieżyt nosa a także uczuleni na pojedynczy alergen, penicylinę czy jady owadów błonkoskrzydłych mogą mieć stężenia prawidłowe. *oznaczanie swoistego IgE wykorzystuje się czułe techniki radiodetekcji RAST (radioimmunosorbent test) i CAO-RIA lub enzymatyczne ze znacznikiem fluorescencyjnym FAST czy luminescencyjnym MAST-CLA. Często stosowane są panele do oznaczania przeciwciał dla najczęstszych alergenów wziewnych czy pokarmowych. Pewnym uproszczeniem są testy paskowe, oparte o zasadę immunoenzymatyczną (Visagnost, Allergo- Dip). Jednak niewykrycie swoistych IgE w surowicy chorego, mimo ewidentnych objawów klinicznych nie przesądza o ich braku w narządzie wstrząsowym (mogą być zwiaząne z komórkami, mogą tworzyć kompleksy). Podstawową metodą badania swoistych IgE są testy skórne. *testy skórne alergen może być podawany śródskórnie, naskórnie lub metodą prick. Równocześnie można badać reakcje na wiele alergenów. Co najmniej 24 godziny przed wykonaniem testu nie należy podawać leków przeciwhistaminowych. W zależności od charakteru odczynu i czasu odczytu można określić typ nadwrażliwości lub jej brak. - odczyn wczesny powstaje w ciągu sekund lub minut (należy odczytać po min.) i charakteryzuje się wystąpieniem obrzęku, zaczerwienienia i tzw. bąbla pokrzywkowego, co spowodowane jest miejscowym uwolnieniem mediatorów zapalenia gł. histaminy, po min. zanika. Mogą być wyniki fałszywie dodatnie jak i fałszywie ujemne. Celem kontroli można wykonać test z histaminy w rozcieńczeniu 1: Odczyn dodatni bąbel powinien być większy niż 5 mm średnicy - odczyn opóźniony powstaje po 6-8 godz. i świadczy o tworzeniu się kompleksów antygenprzeciwciało (gł. IgG) i odkładaniu się ich w ścianie naczyń. Obserwuje się zaczerwienienie i obrzęk, nie ma bąbla. - odczyn późny powstaje po godz. i jest przykładem nadwrażliwości typu późnego (komórkowej). Początkowo powstaje zaczerwienienie i naciek neutrofili a następnie komórek

11 jednojądrzastych (limfocyty, makrofagi), które powodują stwardnienie w miejscu podania antygenu. Klasycznym przykładem nadwrażliwości typu późnego jest reakcja na tuberkulinę. Reakcje późne mogą dawać inne bakterie (brucella, listeria, gronkowce..), grzyby, alergeny kontaktowe, np. chrom, nikiel. *oznaczanie eozynofilów może być miarą zapalenia alergicznego ale nie tylko. Można oceniać w krwi (we wzorze Schillinga prawidłowo 1 3%, wyniki powinny być podawane w wartościach bezwzględnych) lub w wymazach z nosa, popłuczynach pęcherzykowooskrzelowych, bioptatach śluzówki. Studenci oceniają preparatyi zdjęcia z BAL-u od różnych pacjentów (alergia naciek eozynofilów, sarcoidoza - limfocytoza, infekcja bakteryjna - granulocyty, prawidłowe przewaga makrofagów) pod kątem obecności eozynofili i innych komórek zapalnych. *metody oceny aktywacji komórek - oznaczanie tryptazy w surowicy - w procesie degranulacji komórki tucznej, w mniejszym stopniu bazofila 100x mniej, z ziarnistości uwalniana jest oprócz histaminy także tryptaza, pozostająca w kompleksie z heparyną i proteoglikanem chondroityny, co powoduje późniejsze pojawienie się w surowicy. Można oznaczać metodą RIA i ELISA we krwi w uogólnionej reakcji anafilaktycznej a także w popłuczynach oskrzelowych, ślinie, wydzielinie z nosa. - uwalnianie histaminy z bazofilów testy stosowane w celach naukowych, pomiar stężenia histaminy można oceniać fluorymetrycznie, radioenzymatycznie i immunoenzymatycznie. - uwalnianie leukotrienów test CAST-ELISA ĆWICZENIE 7 Choroby z autoimmunizacją Związane są z występowaniem w organizmie autoreaktywnych przeciwciał oraz limfocytów skierowanych przeciwko własnym antygenom gospodarza. Autoprzeciwciała mogą być skierowane przeciwko antygenom występującym powszechnie (antygeny jądrowe DNA, RNA, histony, antygeny cytoplazmatyczne, występujące w organellach, błonie komórkowej) lub specyficznym dla określonej tkanki czy narządu. Stąd mówimy o chorobach narządowoswoistych (choroba Hashimoto, Gravesa-Basedowa, Adisona, cukrzyca typu I, miastenia gravis), i narządowo-nieswoistych - układowych (reumatoidalne zapalenie stawów-rzs, toczeń rumieniowaty układowy-sle, zespół Sjogrena, twardzina układowa). Wśród przyczyn chorób z autoimmunizacji wymienia się: nieprawidłowa selekcja klonów autoreaktywnych, zaburzenia mechanizmów regulacji, poliklonalna stymulacja przez superantygeny wirusowe, bakteryjne, leki, enzymy, powstawanie krzyżowo-reagujących przeciwciał pod wpływem antygenów drobnoustrojów wykazujących podobieństwo w strukturze I-rzędowej z antygenami gospodarza (mimikra antygenowa). U chorych można stwierdzić w surowicy: podwyższone stężenie gamma-globulin, obniżone stężenie dopełniacza i komórek Ts, kompleksy odpornościowe, uszkodzenia w bioptatach (np. kłębuszki nerkowe) powstałe w wyniku odkładania się kompleksów. Diagnostyka immunologiczna polega głównie na wykrywaniu autoprzeciwciał, rzadziej przeciwciał przeciw antygenom drobnoustrojów a także na oznaczaniu antygenów zgodności tkankowej choroby są uwarunkowane genetycznie i związane z występowaniem genów kodujących antygeny HLA kl. I i częściej II klasy. Chorzy mogą mieć więcej niż jeden rodzaj autoprzeciwciał i kilka chorób autoimmunizacyjnych. Poziom autoprzeciwciał wzrasta z wiekiem, mogą być wykrywane w innych chorobach, np. gruźlicy, nowotworach. Znanych jest kilkadziesiąt autoprzeciwciał, z których tylko kilkanaście ma znaczenie w diagnostyce różnicowej i uznawane jest za markery choroby. Związane jest to z niską częstością występowania w danej chorobie, występowaniem w innych jednostkach a także

12 zróżnicowanymi metodami wykrywania, co prowadzi do uzyskiwania różnych jakościowo wyników, nietrafnych rozpoznań i niewłaściwego leczenia. Standardową, przeglądową techniką rozpoczynającą diagnostykę autoprzeciwciał jest: *metoda immunofluorescencji pośredniej daje ona duże możliwości poprzez zastosowanie różnych substratów tkankowych i komórkowych i pozwala na dokładną mikroskopową ocenę rozłożenia barwnika (fluoresceina) w jądrze czy cytoplazmie. Każde z autoprzeciwciał ma typowy wzór fluorescencji, np. homogenny, brzeżny, jąderkowy, drobnoplamisty czy typy pośrednie.. Najczęściej stosowane są ludzkie komórki nabłonkowe z raka krtani Hep-2, służące przede wszystkim do wykrywania przeciwciał przeciwjądrowych ANA (antinuclear antibody). Ponieważ komórki Hep-2 są w różnych stadiach rozwoju można wykryć przeciwciała dla białek centromerowych, wrzeciona kariokinetycznego. Innym substratem są skrawki wątroby małpy czy szczura, które wykrywają przeciwciała przeciwko cytoplazmie granulocytów (canca, panca) a także specyficznym antygenom wątrobowym. Substraty te można łączyć jednocześnie. Badanie rozpoczyna się zwykle od rozcieńczenia surowicy 1:10 1:100 w zależności od testu.. Wysokość miana niektórych przeciwciał odzwierciedla aktywność procesu chorobowego i może mieć znaczenie prognostyczne. Do ostatecznego różnicowania używa się metody ELISA (do różnicowania ANCA, SCL 70, SSA, SSB, SM/RNP), bloki tkankowe (głównie do wykrywania przeciwciał ANA, AMA, ASMA, APCA) lub westernblot. Do określania narządowo-swoistych przeciwciał stosowane są odpowiednie substraty narządowe. Studenci oglądają przeciwciała przeciwjądrowe na Hep-2 oraz przeciwciała dla natywnego DNA na Crithidia lucilla (pierwotniak) i zwracają uwagę na różne formy świecenia.

13 ĆWICZENIE 8 Niedobory odpornościowe W przebiegu choroby angażującej układ odpornościowy lub w przypadkach niedoborów pierwotnych (wrodzone) czy wtórnych (nabyte) upośledzenie (np. brak przeciwciał czy komórek) czy zaburzenia normalnych funkcji (np. produkcja autoprzeciwciał) układu odpornościowego może obejmować mechanizmy odporności wrodzonej (fagocytoza, dopełniacz) jak i nabytej (przeciwciała, zaangażowane komórki), humoralnej i komórkowej. Ponadto ciągły ruch komórek (układ limfatyczny, krew, tkanki), obecność różnych receptorów, cząstek adhezyjnych, cytokin... stwarza duże możliwości badawcze ale i ograniczenia. Do oceny immunologicznej stosowana jest krew ocena komórek, surowica lub osocze (przeciwciała, antygeny, dopełniacz, cytokiny, kompleksy immunologiczne, rozpuszczalne cząstki adhezyjne...), inne płyny (stawowy, mózgowo-rdzeniowy, opłucnowy, BAL, mocz...), rozmazy komórkowe z biopsji, skrawki tkanek. Można przeprowadzać ocenę jakościową (np. wykrycie czynnika reumatoidalnego), półilościową (miano przeciwciał w surowicy), ilościową (immunoglobuliny, subpopulacje komórek), czynnościową (transformacja blastyczna limfocytów), badać antygeny zgodności tkankowej (genetyczne uwarunkowania niektórych chorób), testy skórne (określenie typu odpowiedzi immunologicznej/nadwrażliwości lub jej brak) a także oceniać wpływ stosowanych metod leczniczych czy rokowanie. Zestawy testów często są dostosowane do rodzaju choroby, nie mniej wszystkie badania laboratoryjne powinno się rozpoczynać od badań podstawowych. Niektóre objawy kliniczne wskazujące na upośledzenie funkcji immunologicznych to: nawracające lub przewlekłe infekcje, często florą oportunistyczną lub normalną, powolne zdrowienie, zła odpowiedź na leczenie, przewlekłe biegunki, wyprysk atopowy, brak prawidłowego rozwoju i wzrostu, hepatosplenomegalia, autoprzeciwciała, choroby autoimmunizacyjne. Badania podstawowe zlecane przez lekarza rodzinnego: *morfologia krwi spadek lub wzrost ilościowy leukocytów, przesunięcia we wzajemnych proporcjach krwinek białych. Limfocytoza poza zakażeniami wirusowymi i przewlekłymi stanami zapalnymi może sugerować proces autoimmunizacji, eozynofilia z nadwrażliwością typu I lub chorobami pasożytniczymi *stężenie białka całkowitego i rozdział elektroforetyczny z podaniem odsetka poszczególnych frakcji. Hyperglobulinemia może sugerować choroby z autoimmunizacji, brak gammaglobulin lub ich niskie stężenie niedobory wrodzone lub nabyte. *ocena ilościowa IgG, IgM i IgA pozwala wykryć niedobory Ig. W zespole Brutona stwierdza się śladowe stężenia surowiczych IgG, IgM, IgA, co wynika z ich upośledzonej syntezy. W pospolitym zmiennym niedoborze odporności (CVID) stężenia IgG i IgA są niskie, IgM często niewykrywalne. W niedoborze IgA (poniżej 5 mg/dl) IgG i IgM mogą być w normie ale u 20% chorych nie ma podklas IgG2 i IgG4. *ocena białka C-reaktywnego świadczy o toczącym się procesie zapalnym *test NBT ujemny lub obniżony wskazuje na upośledzoną zdolność bójczą neutrofilów *testy skórne najczęściej wykonywana i najważniejsza jest próba tuberkulinowa, oceniająca nadwrażliwość typu późnego DTH. Odczyn ujemny lub bardzo słaby po godz wskazuje na upośledzenie mechanizmów odpowiedzi komórkowej i anergii na dany antygen limfocytów T (wszystkie noworodki są szczepione BCG). Można wykonać również Multitest zawierający 7 wystandaryzowanych antygenów (tężec, błonica, paciorkowiec gr. C, tuberkulina, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Proteus mirabilis). Testów skórnych nie wykonuje się u dzieci poniżej 1 roku życia. Dodatkowo w specjalistycznych ośrodkach można określać odsetek/liczby bezwzględne limfocytów T i B, subpopulacje T, odpowiedź proliferacyjną limfocytów pod wpływem mitogenów (np. PHA), przeciwciał anty-cd3, anty-tcr, chemotaksję neutrofilów,

14 chemiluminescencję, obecność ekspresji różnych receptorów CD na powierzchni neutrofilów, cytotoksyczność NK, badanie obecności i aktywności enzymów ADA dezaminaza adenozyny, PNP fosforylaza nukleozydów purynowych, ZAP-70 kinaza tyrozynowa, stężenie składowych dopełniacza, aktywność hemolityczną układu dopełniacza. W ciężkim złożonym niedoborze odporności (SCID) w zależności od rodzaju zaburzenia może być: SCID T-B-, T-B+, TCD8-, TCD4-, odpowiedź proliferacyjna: brak lub bardzo słaba. Przypadek kliniczny 1: S.K. Chłopiec lat 2, poród o czasie, cięcie cesarskie, waga 4750 g, w czasie pobytu na oddziale wystąpiły nieliczne potówki, dziecko rozwija się bardzo dobrze, ma nadwagę, nie choruje, jednak od 3 tygodnia życia pojawiają się okresowo ropnie w różnych miejscach: tułów, przedramię, twarz, nos, spojówki. Leczenie antybiotykiem bez efektu. Matka zdrowa, ojciec od lat ma okresowo czyraczność. Badania: wydzielina z ropnia Staphylococcus aureus MSSA. Badanie ogólne moczu bez zmian Poziom cukru 94 mg/dl Morfologia i rozmaz: w załączeniu (granulocytopenia). Rozpoznanie: ropnie mnogie Postępowanie: wobec utrzymywania się procesu ropnego wykonano autoszczepionkę. Test skórny wykonany z zawiesiny własnych gronkowców: wczesny ujemny, późny słabo dodatni ok. 5 mm Wskazane leczenie autoszczepionką ojca. Przypadek kliniczny 2: H.T. Młodzieniec lat 20, szczupły, od 8 miesięcy czyraczność, zmiany występują 1 2 razy w miesiącu. W wywiadzie w dzieciństwie kilkakrotnie zapalenie płuc i oskrzeli. Od roku pracuje fizycznie w warsztacie samochodowym. Wywiad rodzinny bez znaczenia. Leczony chirurgicznie (nacięcia) i antybiotykami bez efektu. Wykonano autoszczepionkę. W okresie 3 miesięcznego leczenia wystąpił jeden czyrak, który bardzo szybko się zagoił. Pacjent będzie brał przypominające dawki autoszczepionki do pół roku, winien zwrócić uwagę na większą higienę w pracy. Badania: w posiewie Staphylococcus aureus MSSA Badanie ogólne moczu: w normie Poziom glukozy: 100mg/100 Morfologia: w załączeniu (przed leczeniem granulocytopenia, po podaniu autoszczepionki wyraźny wzrost odsetka granulocytów) Test skórny z zawiesiny własnych gronkowców: wczesny ujemny, późny naciek ok. 7 mm Przypadek kliniczny 4: Chłopiec 8 miesięcy, poród o czasie, siłami natury, 3350 g, początkowo dziecko rozwijało się prawidłowo, ostatnio słabo przybywa na wadze, karmione cały czas piersią, od 4 miesiąca utrzymują się infekcje dróg oddechowych, początkowo o lekkim przebiegu, ostatnio średnio ciężkie zapalenie ucha środkowego z ropnym wyciekiem, dwukrotnie wystąpiło zapalenie płuc, utrzymuje się ropny katar, leczenie antybiotykami początkowo skuteczne, obecnie bez wyraźnej poprawy. Po szczepieniu DiTePer i Polio (tylko jedna dawka) w 2. miesiącu życia dziecko miało stany podgorączkowe i wolne stolne. Wywiad rodzinny: siostra 5 lat rozwija się prawidłowo. Brat ojca zmarł w wieku 4 miesięcy. Badania dodatkowe: Posiew z nosa: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus

15 Badanie ogólne moczu: ślad białka, 5 10 leukocytów w osadzie Morfologia: E 3,9 L 10,2 rozmaz: neutrofile 54%, eozynofile 5%, limfocyty 35% monocyty 6%, OB 10 Immunoefektroforeza białek surowicy: bardzo słabo zaznaczona frakcja gamma-globulin Immnuglobuliny: IgG wyraźnie obniżone (30mg/dl), IgA i IgM - brak Miano przeciwciał przeciwtężcowych ujemne Odsetek limfocytów CD19 - O%, CD3 75% Rozpoznanie: zespół Brutona, występuje tylko u chłopców, defekt chromosomu X brak genu dla kinazy tyrozynowej warunkującej dojrzewanie limfocytów pre-b w B, siostra zdrowa, objawy nasilają się po wyczerpaniu przeciwciał IgG pochodzących od matki, zakażenia bakteriami ropotwórczymi, które niszczone są w procesie fagocytozy przez granulocyty, wspomaganej swoistymi przeciwciałami. Leczenie: co 4 tygodnie dożylnie lub podskórnie podaje się preparaty immunoglobuliny G celem uzyskania stężenia ochronnego mg/dl, unikanie zakażeń, leczenie celowanym antybiotykiem Przypadek kliniczny 5: Dziewczynka 2 lata, ciąża, poród bez powikłań, psychicznie rozwija się prawidłowo, je dość dobrze, jest szczupłe, od ok. 6-7 miesiąca życia, wg matki po zamieszkaniu w mieście, często się przeziębia zwłaszcza po kontaktach z innymi dziećmi, okresowo miewa wolne stolce. Od 2 tygodni ma stany podgorączkowe, katar śluzowo-ropny, kaszle. Fizykalnie lekko zaczerwieniona tylna ściana gardła, płuca bz. Badania dodatkowe: Morfologia: Hb - 12,3 E - 3,9 L - 12,3 (neutrofile 32%, eozynofile 2%, bazofile 1%, limfocyty 60%, monocyty 5%), płytki 225 tys. IgG 750mg/dl, IgA 15 mg/dl, IgM 81 mg/dl Limfocyty B 20%, limfocyty T 64%, stosunek CD4/CD8 1,8 W posiewie z nosa: Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis Rozpoznanie: Znaczne obniżenie IgA, przy prawidłowym poziomie innych klas, limfocytoza, częste infekcje błon śluzowych (najprawdopodobniej wirusowe) przemawiają za selektywnym niedoborem IgA. Jest to najczęstsza hypogammaglobulinemia (1 na 700 osób), może ustąpić samoistnie, u niektórych chorych może nie być objawów. Immunoglobulin nie podaje się ponieważ w handlowych preparatach nie ma IgA. Unikać kontaktów z chorymi, stosować leczenie celowanym antybiotykiem. Przypadek kliniczny 6: Mężczyzna 30 letni, po studiach, pracuje w dużej firmie, często wyjeżdża za granicę. Stan wolny. Od roku czuje się bardzo zmęczony, miewa stany podgorączkowe. Wcześniej raczej nie chorował. Przyznaje się do przebycia rzeżączki przed 7 laty oraz do kontaktów homoseksualnych. Stałego partnera nie ma. Narkotyków nie bierze. Nie zgadza się na wykonanie testów w kierunku HIV. Po roku zgłasza się ponownie: od 2 miesięcy ma stały kaszel, odpluwa niewiele, zauważył powiększone węzły chłonne szyjne i pachwinowe, nie może pracować, każdy wysiłek go męczy. Zgadza się na wykonanie badań. Badania dodatkowe: Test Elisa w kierunku HIV dodatni, w teście Western blot prążki p24, gp 41, gp 120. Stosunek CD4/CD8 1,0 Rtg klatki piersiowej: rozlane nacieki w płucach. W plwocinie: preparat barwiony metodą Grama w granicach fizjologii, metodą Ziehl-Neelsena ujemny, metodą IF wykryto trofozoidy Pneumocystis carinii.

16 Rozpoznanie: Zakażenie HIV, obecność p24 wskazuje na aktywną replikację HIV, zmiany w płucach i powiększone węzły są objawem rozwijania się zespołu AIDS. ĆWICZENIE 9 Immunologia transplantacyjna Antygeny zgodności tkankowej inaczej zwane antygenami transplantacyjnymi występują na powierzchni komórek i warunkują zgodność lub niezgodność przeszczepionej tkanki z tkankami biorcy. Najważniejsze antygeny transplantacyjne (silne) są kodowane przez geny tzw. głównego układu zgodności tkankowej major histocompatibility complex - MHC. U ludzi ściśle sprzężony kompleks genów MHC znajduje się na krótkim ramieniu 6 chromosomu a antygeny tego układu nazwane zostały ludzkimi antygenami leukocytarnymi - human leucocyte antigens HLA, inaczej cząsteczkami MHC. Istnieją antygeny HLA kl. I HLA-A, HLA-B, HLA-C, klasy II HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR. Antygeny klasy I występują na wszystkich komórkach jednojądrzastych i płytkach krwi, klasy II głównie na powierzchni limfocytów B, makrofagów, monocytów, komórek dendrytycznych, komórek Langerhansa, mogą się pojawić dodatkowo na komórkach aktywowanych cytokinami: limfocyty T, komórki śródbłonka, nabłonka jelitowego, tarczycy i inne. Najważniejszą rolą cząsteczek klasy I i II jest prezentacja antygenu limfocytom T. Antygeny kl. I reagują z cząsteczką CD8, kl. II z CD4 tzw. restrykcja MHC. Układ HLA jest wybitnie polimorficzny, istnieje wiele alleli w obrębie pojedynczego locus, co daje w populacji bardzo dużą liczbę kombinacji. Geny HLA są kodominujące, dziedziczone wg praw Mendla. Każdy osobnik posiada 2 haplotypy genów, każdy dziedziczony od jednego z rodziców, może być heterozygotą (obydwa allele tego locus ulegają ekspresji) lub homozygotą. Metody identyfikacji antygenów HLA - metody serologiczne: wykonuje się test limfocytotoksyczny - z krwi lub węzła chłonnego izoluje się limfocyty (do badania kl. I wszystkie, do badania kl. II tylko limfocyty B), kapie do płytki Tarasaki i inkubuje się z zestawem surowic zawierających przeciwciała monoklonalne o znanej swoistości, np. anty-hla- B8, które wiążą się z antygenem na powierzchni komórki, dodaje dopełniacz, inkubuje (dopełniacz uszkadza komórki pokryte antygenem+przeciwciało) a następnie błękit trypanu lub eozynę. Komórki martwe pochłaniają barwnik, są ciemne co świadczy, że posiadały one testowany antygen B8. Komórki żywe nie pobierają barwnika świecą. Na tej podstawie można wykazać, czy dana kombinacja surowicy z dopełniaczem jest cytotoksyczna dla limfocytów. Antygeny HLA na komórkach oznacza się na podstawie obserwacji, która z surowic spowodowała perforację błony badanych limfocytów. W przypadku typowania antygenów HLA używa się przeciwciał monoklonalnych, w przypadku testów cross-match limfocyty dawcy pozyskane z węzła chłonnego inkubuje się z surowicami biorcy oceniając liczbę zabitych limfocytów. Studenci oglądają płytkę Tarasaki z typowaniem antygenów HLA klasy I ( kontrola dodatnia i ujemna, przykładowe reakcje dodatnie) oraz protokół z przeprowadzania badania. - metody molekularne: *hybrydyzacyjna - PCR-SS0, zwana oligotypowaniem, stosuje się sondy molekularne wyznakowane dla odpowiednich alleli HLA, które hybrydyzują i wiążą się tylko z tym allelem, który jest obecny w DNA izolowanym z komórek testowanej osoby. Wcześniej DNA amplifikuje się z użyciem metody PCR *PCR-SSP wyizolowane DNA amplifikuje się z odpowiednimi sondami i po amplifikacji wykrywa się produkty PCR metodą elektrofortyczną. Na podstawie układu prążków ustala się obecne antygeny np. DR. Prezentacje ww metod w Pracowni biologii molekularnej oraz w ciemni (elektroforeza w żelu ocena prążków- oznaczenie antygenów np DR).

17 Identyfikację antygenów HLA przeprowadza się przy doborze dawcy i biorcy przeszczepu, przy wykluczeniu ojcostwa (obecnie rzadziej) oraz w diagnostyce wielu chorób, np. autoimmunizacyjne. Dobór dawcy i biorcy nerki Aby zoptymalizować przeżycie przeszczepu i zminimalizować reakcję odrzucenia ustala się (poza wskazaniami klinicznymi): - nerki od dawcy < 15 r życia powinny być przeszczepiane dzieciom do 15 r - zgodność w układzie ABO - zgodność w zakresie HLA oblicza się wg punktów: 6 wspólnych antygenów priorytet przeszczepienia HLA-A 1 punkt za każdy zgodny antygen HLA-B 4 punkty za każdy zgodny HLA-DR 7 punktów za każdy zgodny antygen - obecność w surowicy biorcy przeciwciał limfocytotoksycznych przeciwko antygenom HLA dawcy) w tzw. próbie krzyżowej cross-match (powinna być ujemna), przeciwciała te powstają w wyniku wcześniejszych przetoczeń krwi, transplantacji, ciąży, surowice do cross-match pobiera się co 6 tygodni, wcześniej u każdego potencjalnego biorcy nerki wykonuje się co 12 tygodni test limfocytotoksyczny z jego surowicą i panelem limfocytów (20 dawców) celem określenia PRA (panel reactive antibody), wysoki procent PRA zwiększa szansę odrzucenia przeszczepu sa one odpowiedzialne za nadostre odrzucenie przeszczepu - czas tzw. zimnego niedokrwienia gdy są duże odległości korzystniej jest przeszczepić nerkę choremu nieco gorzej dobranemu tkankowo, lecz znajdującemu się bliżej Studenci oglądają cross-match - test limfocytotoksyczny wykonany z surowicami oczekujących biorców nerek a limfocytami dawcy i oceniają reakcje o różnym stopniu nasilenia.

18 Prezentacja przykładowego protokołu z doboru najodpowiedniejszego biorcy dla dawcy o danych antygenach HLA przy użyciu programu HLAMATCH oraz oceną testu limfocytotoksycznego. Przeszczepianie serca, wątroby, trzustki wykonuje się bez dobierania biorców w zakresie HLA, jedynie w zakresie układu ABO. Tkanki uprzywilejowane, które nie są odrzucane to: kość, chrząstka, ścięgno, odcinki głównych naczyń krwionośnych oraz tkanki nieunaczynione rogówka.

19 ĆWICZENIE 11 Immunologia rozrodu Immunoterapia kobiet z samoistnymi poronieniami nawykowymi (co najmniej trzecie następujące po sobie poronienie przed upływem 28 tygodnia ciąży) Istnieje kilka hipotez tłumaczących współistnienie immunologiczne matka-płód i istniejącą tolerancję na odmienne antygeny transplantacyjne płodu pochodzące w połowie od ojca. Mimo, że początkowo sądzono, że macica nie podlega kontroli immunologicznej, ciążę należy potraktować jako przeszczep allogeniczny. W ciąży pojawiają się przeciwciała cytotoksyczne skierowane przeciw antygenom transplantacyjnym płodu, nie powodując jednak widocznych skutków, Ilość ich wzrasta u wieloródek (kiedyś surowice wieloródek były źródłem przeciwciał anty-hla stosowanych w typowaniu tkankowym). Powstają również przeciwciała typu blokującego, które wydają się mieć znaczenie biologiczne nie powstają one u pacjentek, które ronią. Przeciwciała te mają ograniczoną zdolność wiązania dopełniacza i opłaszczają powierzchnię trofoblastu nie wywołując jego uszkodzenia, chronią przy tym przed działaniem limfocytów cytotoksycznych wobec antygenów ojcowskich. Poronienia samoistne częściej występują u par posiadających wspólne allele HLA Kl. I i II a także homozygotyzm u matki i płodu. Próbuje się podawać podskórnie kobietom roniącym wyizolowane z krwi obwodowej limfocyty męża w celu wytworzenia u żony przeciwciał blokujących działających protekcyjnie wobec płodu. Konflikt serologiczny matczyno-płodowy (choroba hemolityczna noworodków) Obejmuje głównie antygeny układu Rh, ABO (słabszy przebieg), rzadko inne. Klasyczny konflikt: antygen D (Rh+) występuje na erytrocytach dziecka, nie ma go matka, która wytwarza przeciwciała anty-d. W czasie trwania ciąży ok. 0,1 0,2 ml krwi dziecka przedostaje się do matki, więcej w czasie porodu zwłaszcza zabiegowego. U matki przeciwciała anty-d powstają od 6 tygodni do 3 miesięcy po porodzie. Każda następna ciąża zwiększa ich miano. Obecnie matce po urodzeniu dziecka Rh+ podaje się przeciwciała anty- D. (Zmniejsza to ryzyko powikłań u dziecka o 90%, a dodatkowe podanie surowicy anty-d w 28 tygodniu ciąży zmniejsza wystąpienie choroby hemolitycznej do 0,1%). Przeciwciała anty- D łącza się z erytrocytami Rh+ pochodzącymi od dziecka. Powstałe kompleksy są wiązane przez swoiste limfocyty B i przekazują sygnały supresyjne. Diagnostyka konfliktu serologicznego test antyglobulinowy (odczyn Coombsa). Studenci oglądają odczy Coombsa bezpośredni (wykrywa przeciwciała opłaszczone na krwinkach badanego np. choroba hemolityczna noworodków, niedokrwistości autohemolityczne, odczyny potransfuzyjne) i pośredni odczyn Coomsba (wykrywa przeciwciała u matki przeciwko antygenom krwinkowym płodu lub u biorcy przeciwko krwinkom dawcy)