Haploidyzacja rzepaku: badania podstawowe i zastosowania

Tom XIX Rośliny Oleiste 1998 Hanna Kruczkowska, Helena Pawłowska, Barbara Skucińska Akademia Rolnicza w Krakowie, Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa Haploidyzacja rzepaku: badania podstawowe i zastosowania Haploid plant production of oilseed rape: basic aspects and applications Androgenetyczne dihaploidy rzepaku są już wykorzystywane w hodowli krzyżówkowej i mieszańcowej. Prace genetyczne i indukowanie mutacji przy użyciu haploidów mogą przyczynić się do dalszego postępu w hodowli tego gatunku. Wyjaśnienie mechanizmu działania stresów prowadzących do zmiany drogi rozwojowej mikrospory pozwoli na zwiększenie wydajności haploidyzacji i ograniczenie jej zmienności. Androgenetic dihaploids of oilseed rape already find their application in cross- and hybrid breeding. Genetic research and induction of mutation with the help of haploids may contribute to further progress in the breeding of this species. Understanding the mechanics of the stresses which lead to the change of microspore developmental pathway will make it possible to increase the efficiency of haploidy and to limit its variability. Wstęp Indukcja androgenetycznych dihaploidów rzepaku osiągnięta najpierw przez wykładanie niedojrzałych pylników na pożywkę in vitro (Keller, Armstrong 1978), a następnie przez pobudzanie do embriogenezy zawiesiny mikrospor (Lichter 1982) stosunkowo szybko została wprowadzona do programów hodowlanych. U wielu innych gatunków, dla których również opracowano sposób indukowania androgenezy, przedział czasu między badaniami a praktycznym zastosowaniem był dłuższy lub w ogóle metoda haploidyzacji nie została wykorzystana przez hodowców. Szybkie zastosowanie linii DH w hodowli rzepaku miało kilka przyczyn, głównie jednak wynikało ze znacznego wzrostu zainteresowania rzepakiem po wprowadzeniu odmian podwójnie ulepszonych, a następnie z potrzeby dalszego postępu hodowlanego dzięki kreowaniu odmian mieszańcowych. W hodowli in vitro ulepszone metody indukcji mikrospor do podziałów (Keller, Armstrong 1983; Chuong, Beversdorf 1985) okazały się dostatecznie wydajne dla dawców rosnących zarówno w fitotronie, jak i w szklarni czy w polu, a manipulowanie mikrosporami chronionymi grubą warstwą egzyny było łatwiejsze niż u innych gatunków, np. zbóż. W Polsce pierwsze wydajne kultury mikrospor rzepaku uzyskano w 1992 roku w Katedrze Hodowli i Nasiennictwa AR w Krako-

344 Hanna Kruczkowska... wie stosując metodę opracowaną w Kanadzie (Coventry i in. 1988). Po zbadaniu kilku odmian (tab. 1) okazało się, że mimo mniejszej skłonności do embriogenezy in vitro form ozimych w porównaniu z jarymi (badania metodyczne prowadzono głównie na rzepaku jarym), wśród polskich odmian rzepaku ozimego znaleziono dawców o dobrej wydajności androgenezy jak odmiana Mar (Kruczkowska i in. 1994). Tabela 1 Wydajność embriogenezy w polskich odmianach i liniach DH pochodzących z odmiany Mar The frequency of embryo production in Polish cultivars and DH lines developed from cv. Mar Dawca Donor Liczba zarodków No. of embryos na 10 5 mikrospor per 10 5 microspores z 1 pylnika per anther Bolko 13 2 Polo 97 15 Mar Linie DH DH lines silnie embriogeniczne highly embryogenic słabo embriogeniczne weakly embryogenic 167 powyżej 400 more than 400 do 30 not more than 30 25 60 4 Badania podstawowe Mechanizm skierowujący mikrosporę lub niedojrzały pyłek z drogi rozwoju gametofitycznego na sporofityczny nadal pozostaje nie wyjaśniony. Wiadomo, że dla indukcji androgenezy potrzebne są dwa czynniki stresowe: stres wysokiej temperatury, co najmniej przez 6 8 godzin, i stres osmotyczny pożywki o podwyższonej zawartości cukru. Nie wiadomo jednak, dlaczego tylko część mikrospor znajdujących się w pylniku reaguje na warunki stresowe i przekształca się w zarodki, i dlaczego tylko część tych zarodków ma zdolność pełnej konwersji w kwitnące i wydające nasiona rośliny. Na kilkanaście tysięcy mikrospor znajdujących się w pylniku przeciętnie ok. 40% podejmuje podziały, 5 10% tworzy dojrzałe zarodki (Custers i in. 1994), z których 50 70% ulega konwersji (Foisset i in. 1997; Cegielska-Taras, Szała 1997). Zgodnie z badaniami Hause, Hause (1996) w warunkach in vitro są możliwe 2 ścieżki rozwoju. Jeśli indukcja nastąpi w fazie mikrospory, zaburzenia mikrotubularnego cytoszkieletu powstałe pod wpływem stresu prowadzą do symetrycznego podziału jądra. Jeśli indukcja ma miejsce w pyłku dwujądrowym, tuż po mitozie, stres powoduje powrót komórki wegetatywnej do cyklu komórkowego i również jej podział symetryczny. Jądra pochodzące z symetrycznego podziału mogą ulec fuzji dając początek zarodkowi o podwojonej liczbie chromosomów.

Haploidyzacja rzepaku: badania podstawowe i zastosowania 345 Opisano również inną możliwość fuzji: jąder lub komórek wegetatywnej i generatywnej (Cebrat i in. 1994b). Różnicowanie się zarodka musi nastąpić w obrębie ściany pyłku; jeśli ściana pęknie wcześniej, tworzy się haploidalny kalus zamiast zarodka. Według Nitta i in. (1997) gruba ściana pyłku może również powstrzymać zarodek przed wydostaniem się i dalszym rozwojem. Te przyczyny oraz wzajemny wpływ rozwijających się mikrospor, o czym świadczą doświadczenia z gęstością zawiesiny i kondycjonowaniem pożywek, mogą ograniczać liczbę powstałych zarodków w stosunku do mikrospor, które podjęły podziały. Stymulowanie androgenezy jest możliwe przez zastosowanie niskich dawek mutagenów na początku kultury mikrospor. Najczęściej zalecana jest kolchicyna, która, podobnie jak podwyższona temperatura, powoduje zaburzenia mikrotubularnego szkieletu (Zaki, Dickinson 1995). Stymulację androgenezy przez mutageny fizyczne (promienie UV i gamma, prędkie neutrony) oraz kolchicynę i MNH (N-nitrozo-N-metylomocznik) wykazano również w materiałach polskich (tab. 2). Stwierdzono przy tym współdziałanie stymulacji z genotypem (tab. 3) i gęstością zawiesiny mikrospor (rys. 1). Ze wzrostem dawek mutagenów wzrasta liczba zarodków źle wykształconych (Jędrzejaszek i in. 1994; Kruczkowska, Pawłowska 1997). Tabela 2 Stymulacja embriogenezy pod wpływem różnych mutagenów Stimulation of embryogenesis under the influence of various mutagens Mutagen Dawki stymulujące Stimulating Stymulacja [% kontroli] Stimulation [per cent of control] doses średnio mean maksimum Zarodki nienormalne [%] Abnormal embryos Promienie γ 10 30 Gy 128 450 Nf 1 5 Gy 350 800 0 100 MNH 0,1 0,5 mm 168 351 33 65 Kolchicyna 50 mg/l 142 162 16 62 UV 10 30 s 180 207 37 57 Wpływ kolchicyny na embriogenezę (liczba zarodków na 10 5 mikrospor) The effect of colchicine on embryogenesis (embryos/10 5 microspores) Genotyp Genotype Kontrola Control Tabela 3 Kolchicyna Colchicine 50 mg/l [% kontroli] [per cent of control] Mar 214 163 Linia DH F 399 39 Linia DH W 283 178 Linia DH Z 46 250

346 Hanna Kruczkowska... Rys. 1. Zależność między gęstością zawiesiny mikrospor a reakcją na kolchicynę (linia DH F) Relation between microspore density and reaction to colchicine (DH line F) Rozwój zarodków w pożywce nie jest synchroniczny. Za gotowe do konwersji uważa się dobrze wykształcone zarodki w stadium liścieniowym, które osiągnęły wielkość co najmniej 2 mm i są dojrzałe fizjologicznie do regeneracji. Krótki okres dojrzewania (kilka dni) jest porównywalny z okresem spoczynku zarodków zygotycznych (Iwanowska i in. 1997). Konwersji sprzyja podsuszenie zarodków i wzrost w niskiej temperaturze (Coventry i in. 1988). Podwajanie liczby chromosomów, o ile nie nastąpiło spontanicznie przez fuzję jąder, dokonuje się za pomocą kolchicyny zastosowanej we wczesnym okresie kultury in vitro (Zhao i in. 1996) lub przed przeniesieniem roślin do ziemi albo przez kolchicynowanie młodych roślin, które wykształciły kilka liści (Cebrat i in. 1994c). Jak wynika z analizy androgenezy, potencjalna wydajność haploidyzacji pozostaje tylko częściowo wykorzystana, chociaż dla celów hodowlanych jest na ogół wystarczająca. Do najważniejszych czynników, które mają wpływ na wydajność androgenezy zalicza się genotyp i stan fizjologiczny rośliny dawcy (tab. 4). Różnice genotypowe są widoczne na każdym etapie androgenezy, jednak u rzepaku zazwyczaj nie spotyka się genotypów całkowicie opornych na indukcję. Stan fizjologiczny rośliny jest pojęciem mało precyzyjnym, jednak jest źródłem zmienności osobniczej nawet w obrębie linii homozygotycznej. Dawcy o tym samym genotypie rosnący w jednakowych, kontrolowanych warunkach różnią się

Haploidyzacja rzepaku: badania podstawowe i zastosowania 347 zdolnością do embriogenezy, optymalnym terminem pobrania pąków i innymi cechami (tab. 5). Pamięć zegara biologicznego również może mieć wpływ na efekt androgenezy (Kruczkowska i in. 1997). Tabela 4 Czynniki, od których zależy wydajność haploidyzacji i podwojenia liczby chromosomów u rzepaku Factors influencing the effectiveness of haploidy and chromosome doubling in oilseed rape Genotyp Genotype Stan fizjologiczny rośliny dawcy Physiological state of donor plant wiek age stadium kwitnienia flowering stage położenie pąka na roślinie bud position on the plant temperatura temperature promieniowanie świetlne: natężenie, fotoperiod light radiation: intensity, photoperiod sezon season odżywianie nutrition zdrowotność freedom from disease and pests Stadium rozwojowe mikrospory Stage of microspore development Warunki kultury Culture conditions skład pożywki (stres osmotyczny) composition (osmotic stress) temperatura (stres temperatury) temperature (thermal stress) promieniowanie świetlne light radiation gęstość zawiesiny microspore density stymulacja (mutageny) stimulation (mutagens) Konwersja Conversion dojrzałość morfologiczna i fizjologiczna zarodków morphological and physiological maturity of embryos stymulacja (temperatura, podsuszanie) stimulation (temperature, dessication) Podwojenie liczby chromosomów Chromosome doubling spontaniczne spontaneous stymulacja (temperatura, kolchicyna) stimulation (temperature, colchicine) Należy zwrócić uwagę, że z czynników środowiskowych największy wpływ na proces androgenezy rzepaku ma temperatura. Korzystne jest, aby rośliny dawcy rosły w niskiej temperaturze, 15/10 10/5 o C (Keller i in. 1987), stres temperatury 30 35 o C przyczynia się do zmiany drogi rozwoju mikrospor, niska temperatura, 4 o C, sprzyja konwersji zarodków, zamrożenie mikrospor zwiększa spontaniczną diploidyzację. Wiadomo, że temperatura wpływa na poziom endogennych regulatorów wzrostu i odżywienie komórek, jednak nie wykazano dotąd możliwości zastąpienia wpływu temperatury przy pomocy fitohormonów i innych czynników.

348 Hanna Kruczkowska... Tabela 5 Wpływ stanu fizjologicznego dawcy na embriogenezę (liczba zarodków na 10 5 mikrospor) The influence of physiological state of the donor plant on embryogenesis (No. of embryos/10 5 microspores) Roślina dawca Linie DH DH lines Donor plant A B C G H W Z 1 256 101 43 126 45 9 0 2 109 294 583 0 36 104 0 3 247 254 25 143 127 160 11 Zastosowanie w hodowli i pracach genetycznych Podwojone haploidy rzepaku (linie DH) są stosowane w hodowli krzyżówkowej, heterozyjnej i mutacyjnej (tab. 6). Główną zaletą haploidyzacji jest możliwość bardzo szybkiego uzyskania homozygot z mieszańców, bez oczekiwania na ujawnienie efektu segregacji w kolejnych pokoleniach. Ponadto w ten sposób otrzymuje się rozszczepienie w korzystniejszych dla selekcji stosunkach liczbowych. W kilku pracach zwrócono jednak uwagę, że segregacja w populacjach androgenicznych odbiega od mendlowskiej. Przyczyną może być sprzężenie z genami sprzyjającymi haploidyzacji lub sposób podwajania haploidów (Foisset i in. 1997). Zarodki lub zregenerowane rośliny, zarówno w formie haploidalnej jak i podwojonej, mogą być selekcjonowane pod względem różnych cech agronomicznych, w tym cech jakościowych (Cegielska-Taras i in. 1997) i odporności na choroby (Starzycki i in. 1996). Skuteczną selekcję można przeprowadzić nawet w małej populacji, jak to miało miejsce w przypadku żółtonasiennych form rzepaku (Henderson, Pauls 1992). W hodowli heterozyjnej linie DH pozwalają uniknąć długotrwałego chowu wsobnego. Linie DH były też używane do zablokowania autogamii, zarówno przy wykorzystaniu samoniezgodności (Havel 1997) jak i genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności. W tym ostatnim przypadku przy poszukiwaniu termostabilnych genotypów dopełniających dla linii CMS-polima (Bartkowiak-Broda i in. 1997) oraz restorerów o niskiej zawartości glukozynolanów dla linii CMS ogura (Cegielska-Taras i in. 1997). Haploidy mogą być wykorzystane w hodowli mutacyjnej na dwa sposoby: przez indukowanie mutacji w kulturze mikrospor, a następnie wyszukiwanie homozygotycznych mutantów oraz przez działanie mutagenem na nasiona i selekcję zmutowanych linii DH wyprowadzonych z roślin M1. Należy jednak wziąć pod uwagę, że mimo dużej odporności mikrospor i tkanek rzepaku na czynniki mutagenne (Cebrat i in. 1994a), zdolność do androgenezy i konwersji przy obu sposobach indukcji może być znacznie upośledzona (tab. 7).

Haploidyzacja rzepaku: badania podstawowe i zastosowania 349 Tabela 6 Wykorzystanie dihaploidów rzepaku Utilization of oilseed rape dihaploids A) w hodowli roślin in plant breeding w hodowli krzyżówkowej: szybkie otrzymanie homozygot, w korzystniejszych dla selekcji rozszczepieniach in crossbreeding: fast production of homozygous lines with gametic segregation suitable for selection purposes w hodowli heterozyjnej: szybkie otrzymanie (bez chowu wsobnego) homozygotycznych linii potrzebnych do wytworzenia mieszańców in hybrid breeding: fast obtaining (without inbreeding) of homozygous components required for hybrid production w hodowli mutacyjnej: szybki efekt fenotypowy in mutation breeding: fast phenotypic effect B) w pracach genetycznych in genetic applications badanie kariotypu, aberracji chromosomowych i otrzymywanie aneuploidów research on karyotype, chromosome aberrations and aneuploids production badanie filogenezy i resynteza rzepaku studies of oilseed rape phylogenesis and resynthesis przechowywanie materiału genetycznego germplasm storage mieszańce somatyczne somatic hybrids trasformowanie genomu genome transformation Tabela 7 Regeneracja młodych roślin z kultur mikrospor poddanych działaniu mutagenów oraz mikrospor pochodzących z roślin M1 Regeneration of young plants obtained from microspore cultures treated with mutagens and from microspores of M1 plants Mutagen Dawki Doses Regeneracja [% kontroli] Regeneration [per cent of control] Traktowane mikrospory Microspores treated Promienie γ Nf UV MNH 10 Gy 10 16 Gy 15 30 s 0,5 1,5 mm Traktowane nasiona Seeds treated 213,4 96,1 34,3 38,0 MNH 2,5 mm 2,8

350 Hanna Kruczkowska... Wydaje się, że haploidy rzepaku są dotąd wykorzystywane w pracach genetycznych w mniejszym zakresie niż w hodowli. Dysponowanie roślinami o gametycznej liczbie chromosomów na pewno ułatwia badanie kariotypu, aberracji chromosomowych i otrzymywanie aneuploidów. U rzepaku, który jest gatunkiem alloploidalnym, haploidy mogą mieć duże znaczenie w badaniach filogenetycznych oraz resyntezie tego gatunku z odpowiednio dobranych komponentów. Fuzja haploidalnych protoplastów pozwala na uniknięcie zaburzeń chromosomalnych, często występujących przy fuzji komórek somatycznych. Zwiększenie ograniczonej hodowlą odmian ulepszonych zmienności rzepaku jest też możliwe przez indukowanie i wykorzystanie zmienności gametoklonalnej. Mikrospory i zarodki haploidalne rzepaku doskonale nadają się do przechowywania materiału genetycznego. Dobrze znoszą zamrażanie, które nawet wzmaga skłonność do spontanicznej diploidyzacji (Chen, Beversdorf 1992). W normalnej temperaturze można przechowywać wysuszone zarodki haploidalne w stadium liścieniowym (Brown i in. 1993, cyt. za Palmer i in. 1996). Obie te możliwości mają znaczenie dla ewentualnej produkcji sztucznych nasion rzepaku. Wykorzystanie haploidów do transformacji rzepaku wskazuje na znaczną przewagę tego systemu nad trasformowaniem tkanek somatycznych: haploidy mają duży potencjał regeneracyjny i transgeny można łatwo przeprowadzić w stan homozygotyczny, szczególnie jeśli przenosiłoby się je wprost do mikrospor. Najczęściej stosowaną dotychczas metodą u rzepaku jest transformacja tkanek haploidalnych, np. fragmentów zarodka przy pomocy Agrobacterium tumefaciens. Bezpośrednie przenoszenie DNA do mikrospor przy pomocy różnych metod jest jeszcze mało zaawansowane (Palmer i in. 1996). Podsumowanie 1. Haploidyzacja rzepaku in vitro znalazła już szerokie zastosowanie w hodowli krzyżówkowej i heterozyjnej. 2. Małe zróżnicowanie odmian podwójnie ulepszonych wskazuje na potrzebę większego wykorzystania zmienności gametoklonalnej i indukcji zmienności mutacyjnej przy użyciu haploidów. 3. Prace genetyczne nad fuzją protoplastów, filogenezą i resyntezą gatunku oraz transformacją przy zastosowaniu mikrospor, komórek czy tkanek haploidalnych mogą stanowić źródło dalszego postępu w hodowli rzepaku. 4. Wyjaśnienie mechanizmu powodującego zmianę kierunku rozwoju mikrospory z gametofitycznego na sporofityczny oraz rozszerzenie badań fizjologicznych i biochemicznych nad tym zjawiskiem przyczyni się do zwiększenia wydajności androgenezy i jej powtarzalności.

Haploidyzacja rzepaku: badania podstawowe i zastosowania 351 Literatura Bartkowiak-Broda I., Popławska W., Liersch A., Gazecka B. 1996. Badania nad genowo-cytoplazmatyczną męską niepłodnością typu CMSpol u rzepaku ozimego. Rośliny Oleiste XVII: 21-32. Cebrat J., Kruczkowska H., Skucińska B. 1994a. Wpływ napromieniowania na embriogenezę w kulturach pylników rzepaku ozimego. Rośliny Oleiste XV: 55-60. Cebrat J., Kruczkowska H., Pawłowska H., Skucińska B. 1994b. Effect of irradiation on embryogenesis in microspore culture of rapeseed. Abstr. VIIIth Internat. Congr. Plant Tiss. and Cell Cult., Firenze 12-17 VI 1994: 83. Cebrat J., Pawłowska H., Skucińska B. 1994c. Podwajanie liczby chromosomów u dihaploidów rzepaku ozimego. Rośliny Oleiste XV: 61-66. Cegielska-Taras T., Szała L. 1997. Regeneracja roślin z mikrosporowych zarodków rzepaku ozimego Brassica napus L. Rośliny Oleiste XVIII: 21-30. Cegielska-Taras T., Szała L., Gazecka B., Liersch A., Popławska W., Bartkowiak-Broda I. 1997. Wczesna selekcja androgenicznych linii rzepaku ozimego z genem restorerem dla systemu CMS ogura i niską zawartością glukozynolanów. Z. Nauk. AR w Krakowie, s. Sesja Naukowa 50: 329-332. Chen J. L., Beversdorf W. D. 1992. Production of spontaneous diploid lines in isolated microspores following cryopreservation of spring rapeseed (Brassica napus L.). Plant Breed. 108: 324-327. Chuong P. V., Beversdorf W. D. 1985. High frequency embryogenesis through isolated microspore culture of B. napus and B. carinata Braun. Plant Sci. 39: 219-226. Coventry J., Kott L., Beversdorf W. D. 1988. Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dept. of Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489, Univ. of Guelph, Guelph. Custers J. B. M., Cordewener J. H. G., Nöllen Y., Dons H. J. M., Van Lookeren Compagne M. M. 1994. Temperature controls both gametophytic and sporophytic development in microspore cultures of Brassica napus. Plant Cell Rep. 13: 267-271. Foisset N., Delourme R., Lucas M. O., Renard M. 1997. In vitro androgenesis and segregation distortion in Brassica napus L.: spontaneous versus colchicine-doubled lines. Plant Cell Rep. 16: 464-468. Hause G., Hause B. 1996. Induction of embryogenesis in microspores and pollen of Brassica napus L. cv. Topas. Diss. in Agric. Univ. of Wageningen, the Netherlands. Havel J. 1996. Hodowla roślin oleistych w Republice Czeskiej. Rośliny Oleiste XVII: 107-112. Henderson C. A. P., Pauls K. P. 1992. The use of haploidy to develop plants that express several recessive traits using light-seeded canola (Brassica napus) as an example. Theor. Appl. Genet. 83: 476-479. Iwanowska A., Tykarska T., Chomicz B., Kuraś M. 1997. Development and conversion of microspore-derived embryos of Brassica napus L. cv. Topas. Z. Nauk. AR w Krakowie, s. Sesja Naukowa 50: 321-324. Jędrzejaszek K., Kruczkowska H., Pawłowska H., Skucińska B. 1994. Stymulujący wpływ mutagenów na regenerację roślin rzepaku ozimego in vitro. Prace Ogrodu Botanicznego PAN 5/6: 245-256. Keller W. A., Armstrong K. C. 1978. High frequency production of microspore-derived plants from Brassica napus anther cultures. Z. Pflanzenzüchtg. 80: 100-108.

352 Hanna Kruczkowska... Keller W. A., Armstrong K. C. 1983. Production of Brassica napus haploids through anther and microspore culture. Proc. of 6th International Rapeseed Congress, Paris, 17-19 V: 239-245. Keller W. A., Arnison P. G., Cardy B. K. 1987. Haploids from gametophytic cells recent development and future prospects. In: Plant Tissue and Cell Culture. Green C. E., Somers D. A., Nackett W.P. and Biesboer D.D. (eds.), Allan R. Liss, New York, 233-241. Kruczkowska H., Pawłowska H., Skucińska B. 1994. Kultury mikrospor w polskim materiale rzepaku ozimego. Rośliny Oleiste XV: 51-54. Kruczkowska H., Pawłowska H., Skucińska B. 1997. Wpływ stanu fizjologicznego roślin donorów na wydajność embriogenezy w kulturach mikrospor rzepaku ozimego. Mat. II Ogólnop. Konf. Zastosowanie kultur in vitro w fizjologii roślin, Kraków, 21-23 XI 1996: 113-118. Kruczkowska H., Pawłowska H. 1997. Czy można zwiększyć wydajność kultur mikrospor? Z. Nauk. AR w Krakowie, s. Sesja Naukowa 50: 325-328. Lichter R. 1982. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus. Z. Pflanzenphysiol. 105: 427-434. Nitta T., Takahata Y., Kaizuma N. 1997. Scanning electron microscopy of microspore embryogenesis in Brassica spp. Plant Cell Rep. 16: 406-410. Palmer C. E., Keller W. A., Arnison P. G. 1996. Utilization of Brassica haploids. In: In Vitro Haploid Production in Higher Plants. Jain S.H., Sopory S. K. and Veilleux R. E. (eds.), vol. 3, Kluwer Academic Publishers, the Netherlands, 173-192. Starzycki M., Starzycka E., Pszczoła J., Pakos T. 1996. Porównanie skuteczności różnych metod hodowli odpornościowej rzepaku ozimego na porażenie powodowane przez Phoma lingam. Rośliny Oleiste XVII: 179-184. Zaki M., Dickinson H. 1995. Modification of cell development in vitro: The effect of colchicine on anther and isolated microspore culture in Brassica napus. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 40: 255-270. Zhao J., Simmonds D. H., Newcomb W. 1996. High frequency production of doubled haploid plants of Brassica napus cv. Topas derived from colchicine induced microspore embryogenesis without heat shock. Plant Cell Rep. 15: 668-671.