17α-etynyloestradiol, biodegradacja, farmaceutyki, ekotoksyczność Katarzyna AFFEK, Monika ZAŁĘSKA-RADZIWIŁŁ * BADANIE BIODEGRADACJI I EKOTOKSYCZNOŚCI METABOLITÓW BIOCHEMICZNEGO ROZKŁADU 17α-ETYNYLOESTRADIOLU W niniejszej pracy dokonano oceny efektywności biodegradacji 17α-etynyloestradiolu (EE2) w wodzie w warunkach tlenowych przy pomocy testu OECD MITI(I) 301C, zalecanego do badań substancji słabo rozpuszczalnych w wodzie. Wykonano kontrolne badania chemiczne i mikrobiologiczne oraz dokonano oceny ekotoksyczności produktów pośrednich rozkładu EE2. Zaobserwowano spadek BZT o ~54% po 28 dniach. Częściowy rozkład substancji aktywnej potwierdziły oznaczenia CHZT i RWO. W badaniach mikrobiologicznych stwierdzono czterokrotny wzrost liczby bakterii w okresie 14 dni testu. Badania toksykologiczne obejmowały test bioluminescencji z bakteriami Vibrio fisheri, enzymatyczny (Fluotox) ze skorupiakami Daphnia magna oraz przeżywalności z rybami Lebistes reticulatus, skorupiakami Daphnia magna i Artemia salina (Artoxkit M). Stwierdzono niewielką szkodliwość EE2 podczas 28-dniowej biodegradacji w stosunku do bakterii V. fisheri i skorupiaków A. salina. EE2 w wyjściowym stężeniu powodował natomiast 100% śmiertelność skorupiaków D. magna i ryb L. reticulatus zarówno w czasie 0, jak i 14 dni. Spadek śmiertelności tych organizmów nastąpił po 28 dniach procesu. W teście enzymatycznym Fluotox po 14 dniach biodegradacji EE2 stwierdzono największą liczbę organizmów trwale uszkodzonych, które nie wykazywały fluorescencji. Przebieg biodegradacji EE2 zależy od warunków prowadzenia procesu, stąd też problematyka ta wymaga dalszych kompleksowych badań. 1. WSTĘP Estrogeny stanowią zagrożenie dla środowiska głównie ze względu na powszechne użycie w tabletkach antykoncepcyjnych i hormonalnej terapii zastępczej. Tak jak wiele innych substancji farmaceutycznych, należący do estrogenów syntetyczny hormon 17α-etynyloestradiol (EE2) dostaje się do ścieków szpitalnych, komunalnych * Politechnika Warszawska, Wydział Inżynierii Środowiska, Zakład Biologii, ul. Nowowiejska 20, 00-653 Warszawa.
10 K. AFFEK, M. ZAŁĘSKA-RADZIWIŁŁ i przemysłowych wraz z moczem. Fakt wykrycia EE2 w wodach powierzchniowych i wodzie przeznaczonej do spożycia świadczy o tym, że eliminacja w procesach oczyszczania ścieków i samooczyszczania wód zachodzi w niewielkim stopniu. Pomimo, że w procesach biotransformacji estrogeny przekształcane są w formy nieaktywne hormonalnie, o większej rozpuszczalności w wodzie, uważa się, że procesy mikrobiologiczne zachodzące w oczyszczalniach ścieków przywracają im aktywną pierwotną formę [7]. Szkodliwy wpływ na układ hormonalny ryb odpływu z oczyszczalni ścieków zaobserwowano w latach dziewięćdziesiątych [12]. Od tamtej pory obecność związków zaburzających działanie układu hormonalnego (w tym estrogenów należących do hormonów sterydowych) w środowisku wzbudza zainteresowanie na całym świecie. Odbiorniki i odpływy z oczyszczalni ścieków zawierają stężenia EE2 wyższe niż ustalone laboratoryjnie stężenia nie wywołujące efektów NOEC (ang. no observed effect concentration) [8, 12]. Stężenia wykrywane w odpływach z miejskich oczyszczalni wahają się od 0,017 do 0,45 μg/l, w wodach powierzchniowych wykryto nawet stężenie 0,831 μg/l, a w wodzie do spożycia - 0,0024 μg/l [5, 8]. Tymczasem wyznaczone przez Załęską-Radziwiłł najniższe wartości NOEC spośród wybranych bioindykatorów zwierzęcych i roślinnych wynosiły w testach wzrostowych narybku Danio rerio 0,38 μg/l [18]. Do szkodliwych zmian wywołanych przez EE2 w stosunku do ryb można zaliczyć, m.in.: obniżoną płodność, niedorozwój gonad, zmiany w stosunku samców do samic w populacjach i pojawienie się osobników interseksualnych [16]. W konwencjonalnej oczyszczalni ścieków biodegradacja stanowi główną ścieżkę eliminacji estrogenów, a jej szeroki zakres (0-98%) może wynikać, m.in. z różnic w składzie ścieków i warunków oczyszczania, a także z błędów pomiarowych wynikających z bardzo niskich mierzonych stężeń EE2 [17]. Baronti i wsp. wyznaczyli współczynnik eliminacji EE2: 85% i stwierdzili, że związek ten jest usuwany wydajnie osadem czynnym [2]. Jednak Ternes i wsp. nie zaobserwowali znacznego ubytku w stężeniach EE2 w serii testów w warunkach tlenowych z wykorzystaniem rozcieńczonego osadu z oczyszczalni ścieków w Niemczech [14]. Jürgens i wsp. wykazali, że EE2 jest bardziej oporny na biodegradację, niż jego naturalne odpowiedniki: 17βestradiol i estron. Wynika to najprawdopodobniej z braku u mikroorganizmów wodnych wykształconych w toku ewolucji enzymów rozkładających EE2. Wyznaczone czasy półtrwania w wodach powierzchniowych wahają się od 10 [7] do 81 dni [13]. Na wyniki badań biodegradacji ma wpływ zróżnicowanie mechanizmów procesów mikrobiologicznych rozkładu związków organicznych oraz czynników abiotycznych. Zrozumienie mechanizmów biodegradacji estrogenów pomoże przewidzieć los tych związków w ekosystemach wodnych i pozwoli udoskonalić metody usuwania ich ze ścieków zanim dostaną się do środowiska. Stąd też celem niniejszej pracy była ocena podatności 17α-etynyloestradiolu na biodegradację w warunkach tlenowych przy pomocy standaryzowanego testu OECD MITI(I) 301C, zalecanego do badań substancji
Badanie biodegradacji i ekotoksycznych metabolitów biochemicznego rozkładu 11 słabo rozpuszczalnych w wodzie. Dokonano także oceny wpływu produktów rozkładu EE2 na bioindykatory wodne: mikroorganizmy, skorupiaki i ryby. 2. MATERIAŁY I METODY 17α-Etynyloestradiol (Sigma) o czystości > 98% uzyskano z firmy Sigma-Aldrich. Podstawowe informacje o związku podano w tabeli 1. Nr CAS (ang. chemical abstacts services) Tabela 1. 17α-etynyloestradiol podstawowe informacje Masa molowa [g/mol] Wzór sumaryczny Wzór strukturalny log K ow Rozpuszczalność w wodzie w 20 O C [mg/l] 57-63-6 296,41 C 20 H 24 O 2 4,15 4,8 2.1. OCENA BIODEGRADACJI WYBRANYCH FARMACEUTYKÓW W WODZIE Test biodegradacji wykonano według procedury OECD MITI(I)-301C [15]. Roztwór EE2 (10 mg/l) przygotowano stosując dezintegrator ultradźwiękowy, uzupełniono podłożem mineralnym do 428 cm 3 i zaszczepiono mieszaniną bakterii pochodzących z oczyszczalni ścieków (2*10 6 jtk/ml). Kontrolę abiotyczną stanowił roztwór EE2 (10 mg/l) w wodzie. Ślepa próba zawierała wyłącznie pożywkę z zaszczepieniem. Badania prowadzono przez 28 dni w warunkach tlenowych bez dostępu światła z ciągłym mieszaniem cieczy w temperaturze 20 o C. W czasie trwania eksperymentu wykonano: badania chemiczne: - RWO oznaczenie ogólnego węgla organicznego wykonano metodą spektrofotometryczną w aparacie TOC-5000 (Shimadzu); - ChZT oznaczenie chemicznego zapotrzebowanie tlenu wykonano zgodnie z PN-ISO 6060:2006 [11]; Przed przystąpieniem do analiz chemicznych próby wirowano (9000 rpm, 10 min). mikrobiologiczne - oznaczenie ogólnej liczby bakterii metodą płytkową Kocha na podłożu agarowym odżywczym MPA (posiew głębinowy); ocenę ekotoksyczności roztworu po czasie 0, 14 i 28 dni procesu biodegradacji: - Test immobilizacji ze skorupiakami Daphnia magna i Artemia salina - Daph-
12 K. AFFEK, M. ZAŁĘSKA-RADZIWIŁŁ toxkit F i Artoxkit M wykonano zgodnie z metodyką zawartą w instrukcjach wykonawczych firmy Microbiotests [1, 2]. Organizmy inkubowano w roztworach po biodegradacji odpowiednio 48 i 24 godziny w temperaturze 25 o C, po czym liczono unieruchomione skorupiaki; - Test inhibicji fluorescencji Fluotox (IQ toxicity test) ze skorupiakami Daphnia magna przeprowadzono zgodnie z metodyką opracowaną przez Espiritu i wsp. [4]. Organizmy nie wykazujące fluorescencji liczono po jednej godzinie kontaktu z toksykantami; - Test enzymatyczny z bakteriami Vibrio fisheri Lumistox wykonano zgodnie z metodyką zawartą w instrukcjach wykonawczych firmy Dr Lange (Niemcy) [9]. Oceny inhibicji bioluminescencji dokonano po 0,5 h kontaktu bakterii z badanymi roztworami. - Test przeżywalności z rybami Lebistes reticulatus wykonano wg metodyki zawartej w PN-C-04610-04:1990 [10]. Ryby umieszczano w roztworze po biodegradacji i inkubowano w temperaturze 20-22 o C. Martwe osobniki liczono po 96 godzinach testu. 2.2. PROCEDURY OBLICZENIOWE Obliczenia wykonano zgodnie z Wytyczną OECD Zmodyfikowane badanie MITI (I) 301-C [15]. Procent biodegradacji obliczono wg wzoru (1): BZT ( mg O % biodegrada cji TZT ( mg O 2 / mg substancji) / mg substancji) 2 100 (1) gdzie: BZT biochemiczne zapotrzebowanie tlenu TZT teoretyczne zapotrzebowanie tlenu Dodatkowo procent biodegradacji zasadniczej EE2 po upływie 28 dni obliczono na podstawie wartości ChZT i RWO. 3. WYNIKI BADAŃ Badania nad biodegradacją EE2 wykazały, że ulega on biochemicznemu rozkładowi w okresie 28 dni w około 54%, względem TZT (tabela 2). Przebieg BZT dla 17α-etynyloestradiolu przedstawiono na rysunku 1. Końcowa wartość tego wskaźnika wyniosła ~33 mg O 2 /l po 28 dniach, natomiast w próbce podłoża z zaszczepieniem (bez dodatku związku) wyniosła ~18 mg O 2 /l.
Badanie biodegradacji i ekotoksycznych metabolitów biochemicznego rozkładu 13 Tabela 2. Wyniki badań biodegradacji 17α-etynyloestradiolu w roztworze wodnym Doby [d] BZT [mg/l] EE2 w stężeniu 10 mg/l BZT po czasie [d] [mg O 2 /mg związku] % biodegradacji 1 16,5 0,85 31,60 2 18,3 0,93 34,39 3 19,8 1,05 39,03 4 21,3 1,18 43,68 5 22,4 1,24 46,10 6 23,3 1,27 47,21 7 24,5 1,27 47,21 8 25,4 1,32 48,88 9 26,6 1,38 51,12 10 26,9 1,33 49,44 11 27,5 1,35 50,00 12 27,8 1,35 50,00 13 28 1,32 49,07 14 28,3 1,32 49,07 15 28,6 1,34 49,63 16 28,9 1,33 49,44 17 29,2 1,36 50,56 18 29,5 1,36 50,56 19 29,8 1,36 50,56 20 30,4 1,39 51,67 21 30,7 1,41 52,23 22 31 1,42 52,79 23 31,3 1,42 52,79 24 31,3 1,42 52,79 25 31,9 1,42 52,79 26 32,5 1,45 53,90 27 32,5 1,45 53,90 28 32,8 1,45 53,90 Rys. 1. Przebieg zmian BZT dla 17α-etynyloestradiolu w ciągu 28 dni
14 K. AFFEK, M. ZAŁĘSKA-RADZIWIŁŁ Oznaczenia ChZT i RWO w próbce zawierającej 10 mg/l substancji aktywnej leku potwierdziły jego częściowy rozkład; po 28 dniach ChZT obniżyło się o 32%, a RWO o 23% (tabela 3). Tabela 3. Wyniki badań chemicznych podczas biodegradacji EE2 Rodzaj próbki Czas [d] ChZT [mg O 2 /l] RWO [mg O 2 /l] EE2 (10 mg/l) 0 100 11,100 28 68 8,529 kontrola 0 66,7 5,842 28 57,5 8,529 Badania mikrobiologiczne wykazały, że liczebność bakterii w próbach zawierających EE2 wzrosła czterokrotnie po 14 dniach testu, po czym obniżyła się o dwa rzędy wielkości po 28 dniach. Po tym czasie stwierdzono również wyraźny spadek liczebności bakterii w próbie kontrolnej. Wynika to prawdopodobnie z braku substratów pokarmowych w podłożu. Badania ekotoksyczności EE2 przeprowadzono w procesie biodegradacji tego związku po czasie 0, 14 i 28 dni. EE2 hamował bioluminescencję bakterii V. fisheri w czasie 0 we wszystkich badanych rozcieńczeniach. Inhibicja bioluminescencji osiągnęła po 30 minutach testu 9,5% przy stężeniu związku 5 mg/l, a następnie stopniowo obniżała się do 3,6% przy stężeniu 0,0195 mg/l. W czasie trwania procesu hamowanie luminescencji zmniejszyło się w próbkach zawierających ~ 5 mg/l do 5,1% po 28 dniach. W pozostałych rozcieńczeniach związku inhibicja w czasie 0 była równa lub niższa, aniżeli w próbie kontrolnej (tabela 4). Tabela 4. Wyniki badań inhibicji bioluminescencji bakterii Vibrio fisheri podczas biodegradacji EE2 Rodzaj próby stopień rozcieńczenia Inhibicja bioluminescencji [%] po czasie [d] próby 0 14 28 2 9,5 8,5 5,1 4 6,3 3,2 2,3 8 5,1 3,1 3,9 16 5,8 4,1 1,2 EE2 32 4,9 2,7 1,9 64 5 1,3 1,6 128 5,1 1 1,7 256 4,8 1,3 1,3 512 3,6 2 1,9 kontrola 0 2,17 2,75 2,18 Badany związek okazał się toksyczny dla skorupiaków D. magna w stężeniach 5 i 10 mg/l w czasie 0, przy czym w 10 mg/l obserwowano 100% śmiertelności osob
Badanie biodegradacji i ekotoksycznych metabolitów biochemicznego rozkładu 15 ników. W czasie procesu biodegradacji szkodliwość roztworu EE2 obniżyła się wynosząc po 28 dniach zaledwie 10% w dwukrotnie rozcieńczonej próbie (tabela 5). Tabela 5. Wyniki przeżywalności skorupiaków D. magna (48h) podczas biodegradacji EE2 Rodzaj próby Stopień rozcieńczenia % śmiertelności Daphnia magna po czasie [d] 0 14 28 0 100 100 100 2 60 50 10 EE2 4 10 10 0 8 0 0 0 16 0 0 0 kontrola 0 0 0 0 Inhibicję fluorescencji skorupiaków (test Fluotox) zaobserwowano po 14 dniach biodegradacji związku w próbkach bez rozcieńczenia i 2 i 4-krotnie rozcieńczonych (100-40%). W końcowym okresie badań, po 28 dniach procent organizmów nie wykazujących fluorescencji obniżył się do 50-20% odpowiednio dla próbek nierozcieńczonych i 4-krotnie rozcieńczonych (tabela 6). Tabela 6. Wyniki badań inhibicji fluorescencji skorupiaków D. magna (test Fluotox) podczas biodegradacji EE2 Rodzaj próby Stopień rozcieńczenia % organizmów nie wykazujących fluorescencji po czasie [d] 0 14 28 0 0 100 50 2 0 50 30 EE2 4 0 40 20 8 0 0 0 16 0 0 0 kontrola 0 0 0 0 Znacznie mniejszy szkodliwy wpływ EE2 stwierdzono wobec A. salina. W czasie 0 śmiertelność tych organizmów wynosiła 30% w próbce nierozcieńczonej, a w czasie po 14 i 28 dniach obniżyła się do 10% (tabela 7). Tabela 7. Wyniki przeżywalności skorupiaków A. salina (48h) podczas biodegradacji EE2 Rodzaj próby Stopień rozcieńczenia % śmiertelności A. salina po czasie [d] 0 14 28 0 30 10 10 2 0 0 0 EE2 4 0 0 0 8 0 0 0 16 0 0 0 kontrola 0 0 0 0
16 K. AFFEK, M. ZAŁĘSKA-RADZIWIŁŁ Ryby L. reticulatus okazały się wrażliwe na stężenie związku od 5-10 mg/l w czasie 0, podobnie jak D. magna. Toksyczność roztworów leku utrzymywała się do 14 dnia, a zanikła po 28 dniach trwania biodegradacji (tabela 8). Tabela 8. Wyniki badań przeżywalności ryb L. reticulatus (96h) podczas biodegradacji EE2 Rodzaj próby Stopień rozcieńczenia % śmiertelności Lebistes reticulatus po czasie [d] 0 14 28 0 100 100 0 2 70 40 0 EE2 4 20 10 0 8 0 0 0 16 0 0 0 kontrola 0 0 0 0 4. PODSUMOWANIE I WNIOSKI Przeprowadzone w niniejszej pracy badania oraz dane z piśmiennictwa pozwoliły na sformułowanie następujących wniosków: Właściwości fizyko-chemiczne 17α-etynyloestradiolu sprawiają, że jest on związkiem trudno rozkładalnym, ulegającym sorpcji na kłaczkach osadu czynnego i w kumulacji w drobnocząsteczkowym osadzie dennym [6]. Badania nad biodegradacją EE2 prowadzone w niniejszej pracy wykazały, że ulega on biochemicznemu rozkładowi w okresie 28 dni w około 54%, względem TZT. Nie dokonano jednakże oceny sorpcji EE2 na komórkach bakterii, co mogło rzutować na ostateczny wynik eliminacji tego związku. W dalszych badaniach należałoby wykonać odpowiednie oznaczenia analityczne w tym zakresie. Biodegradacja EE2 zależy od warunków środowiskowych i rodzaju mikroorganizmów wykazujących zdolność do jego biochemicznego rozkładu, m.in. grzybów, a także od stężenia wyjściowego związku. W niniejszej pracy stężenie wyjściowe było około 10 7 razy wyższe od stężeń wykrywanych w środowisku, dlatego należy rozważyć jego obniżenie w dalszych badaniach. Szkodliwość ostra EE2 w granicach 1-10 mg/l plasuje ten związek w grupie toksycznych wg kryteriów UE, przy czym wśród badanych bioindykatorów najbardziej wrażliwe na działanie substancji aktywnej leku okazały się skorupiaki D. magna. Dane uzyskane w niniejszej pracy należy traktować jako wstępne. Problematyka biodegradacji i ekotoksyczności EE2 wymaga dalszych, kompleksowych badań.
Badanie biodegradacji i ekotoksycznych metabolitów biochemicznego rozkładu 17 LITERATURA [1] ARTOXKIT M, Estuarine and marine waters toxicity screening test. Standard operational procedure, MicroBioTests Inc., Belgium. [2] BARTONI C., CURINI R., d ASCENZO G., DiCORIA A., GENTILI A., SAMPERI R., Monitoring natural and synthetic estrogens at activated sludge sewage treatment plants and in receiving river water, Environmental Science and Technology, 2000, Vol. 34, 5059-5066. [3] DAPHTOXKIT F, Freshwater toxicity screening test. Standard operational procedure, MicroBio- Tests Inc., Belgium. [4] ESPIRITU E.Q., C.R. JANSEN, G. PERSOONE, Cyst-based toxicity tests VII. Evaluation of the 1 hour enzymatic inhibition test (Fluotox) with Artemia nauplii, Environmental Toxicology and Water Quality, 1995, Vol. 10, 25-34. [5] HEBERER T., Occurrence, fate and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment: a review of recent research data, Toxicology Letters, 2002, Vol. 131, 5-17. [6] HOLTHAUS K.I.E, JOHNSON A.C., JÜRGENS M.D., WILLIAMS R.J., SMITH J.J.L., CARTER J.E, The potential for estradiol and ethinylestradiol to sorb to suspended and bed sediments in some English rivers, Environmental Toxicology and Chemistry, 2002, Vol. 21, No. 12, 2526-2535. [7] JÜRGENS M.D., HOLTHAUS K.I.E, JOHNSON A.C., SMITH J.J.L., M. HETHERIDGE, WILLIAMS R.J., The potential for estradiol and ethinylestradiol degradation in English rivers, Environmental Toxicology and Chemistry, 2002, Vol. 21, No. 3, 480-488. [8] KOLPIN D.W., FURLONG E.T., METER M.T., THURMAN E.M., ZAUNGGS.D., BARBER L.B., BUXTON H.T., Pharmaceuticals, hormones and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance, Environmental Science and Technology, 2002, Vol. 36, 1202-1211. [9] LUMISTOX Bedienungsanleitung Manual, Dr Lange, Niemcy 1994. [10] PN-C-04610-04:1990: Woda i ścieki. Badania toksyczności zanieczyszczeń dla organizmów wodnych. Oznaczanie toksyczności ostrej na gupiku Lebistes reticulatus Peters. [11] PN-ISO 6060:2006: Jakość wody Oznaczanie chemicznego zapotrzebowania tlenu. [12] PURDOM C.E., HARDIMAN P.A., BYE V.J., ENO N.C., TYLER C.R., SUMPTER J.P., Estrogenic effects of effluents form sewage treatment works, Journal of Chemical Ecology, 1994, Vol. 8, 275-285. [13] SARMAH A.K., NORTHCOTT G.L., Laboratory degradation studies of four endocrine disruptors in two environmental media, Environmental Toxicology and Chemistry, 2008, Vol. 27, No. 4, 819-827. [14] TERNES T.A., KRECKEL P., MUELLER J., Behavior and occurrence of estrogens in municipal sewage treatment palnts II. Aerobic batch experiments with activated sludge, Science of the Total Environment, 1999, Vol. 225, 91-99. [15] Wytyczne OECD do badań substancji chemicznych, Zmodyfikowane badanie MITI (I) 301 C, OECD, Paryż 1993. [16] XIE L., SAPOZHNIKOVA Y., BAWARDI O., SCHLENK D., Evaluation of wetland and tertiary wastewater treatments for estrogenicity using in vivo and in vitro assays, Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2004, Vol. 48, 81-86. [17] XU N., JOHNSON A.C., JÜRGENS M.D., LLEWELLYN N.R., HANKINS N.P., DARTON R.C., Estrogen concentration affects its biodegradation rate in activated sludge, Environmental Toxicology and Chemistry, 2009, Vol. 28, No. 11, 2263-2270. [18] ZAŁĘSKA-RADZIWIŁŁ M., ŁEBKOWSKA M., AFFEK K., ZARZECZNA A., Environmental risk assessment of selected pharmaceuticals present in surface waters in relation to animals, Archives of Environmental Protection, 2011, Vol. 37, 31-42.
18 K. AFFEK, M. ZAŁĘSKA-RADZIWIŁŁ BIODEGRADATION OF 17α-ETHINYLESTRADIOL AND ECOTOXICITY STUDIES OF ITS BIOCHEMICAL DEGRADATION METABOLITES In this paper the effectiveness 17α-ethinylestradiol (EE2) biodegradation under aerobic conditions in water was assessed by OECD MITI (I) 301C test, recommended for substances poorly soluble in water. Control chemical and microbiological tests and ecotoxicity assessment of EE2 degradation intermediates were performed. Reduction of BOD was ~ 54% after 28 days. The partial degradation of the active substance were confirmed by COD and TOC designation. Microbiological tests revealed a fourfold increase in the number of bacteria within 14 days of the test. Toxicological studies included bioluminescence test on Vibrio fisheri, enzymatic test (Fluotox) on Daphnia magna and survival tests on Lebistes reticulatus, Daphnia magna and Artemia salina (Artoxkit M). EE2 was not harmful to V. fisheri and A. salina during the 28-day biodegradation. However in the initial concentration EE2 caused 100% mortality of D. magna and L. reticulatus, both at T 0 and after 14 days. The decrease in mortality of these organisms occurred after 28 days of the process. The largest number of organisms permanently damaged (which showed no fluorescence) in Fluotox test was after 14 days. EE2 biodegradation depends on the process conditions, and therefore requires further comprehensive studies.