WPŁYW R02NYCH ROZPUSZCZALNIKOW NA AKTYWNOŚC BIOLOGICZNĄ PROPOLISU

PSZCZELNICZE ZESZYTY NAUKOWE Rok XXXV 1991 WPŁYW R02NYCH ROZPUSZCZALNIKOW NA AKTYWNOŚC BIOLOGICZNĄ PROPOLISU H e l e n a R y b a k-c h m i e l e w s k a, T e r e s a S z c z ę s n a Oddział Pszczelnictwa ISK w Puławach Streszczenie W latach 1985-87 przeprowadzono badania aktywności antybakteryjnej propolisu w stosunku do testowego szczepu bakterii BaciHus subtilis ATCC 663 B w zależności od zastosowanych rozpuszczalników: 960/0 alkoholu etylowego, 70% alkohelu etylowego, octanu etylu, acetonu, eteru etylowego i układu rozpuszczalników: woda-tween 20 (9:1). Wykazano, że najwyższą aktywność posiada propolis rozpuszczony w 70% alkoholu etylowym. Po rocznym okresie przechowywania propolisu w takiej postaci jego aktywność anty bakteryjna nie obniżyła się. Stwierdzono ponadto" że propolis wykazuje różną aktywność antybakteryjną w zależności od pochodzenia roślinnego. WPROWADZENIE Na podstawie literatury można powiedzieć, że stosunkowo najlepiej została zbadana aktywność antybakteryjna. propolisowych ekstraktów etanolowych i wodnych (W a c h o n i n a - 1976, S c h e 11er i in. - - 1977, S t oj k o - 1978, L a v i e - 1980). Kilku autorów wykazało aktywność biologiczną eterowych ekstraktów propolisu oraz jego frakcji uzyskiwanych z rozpuszczenia tego ekstraktu w innych rozpuszczalnikach (E 11n a i n - Woj t a s z e k i in. - 1985, H ł a d o ń i in. - 1985). Stwierdzono także zdolność hamowania wzrostu bakterii działając frakcjami: octanu etylu, eterowo-benzenową i benzenową etamolowego ekstraktu propolisu - EEP (J ó ź w i k - 1985). Wskazano również na występowanie aktywności antybakteryjnej frakcji Tweenowych tego ekstraktu (S c h e 11e r i in. - 1968). W zakresie oceny aktywności antybakteryjnej ekstraktów propolisu ciekawy materiał przedstawiają prace M e r e s t ów (M e r e s t a i M e r e s t a - 1980, 1982, 1983, 1985). Autorzy ci badając różne rozpuszczalniki (ekstrahenty) stwierdzili, że najbardziej przydatna do uwalniania związków biologicznie czynnych propolisu okazała się mieszanina alkoholu etylowego lub metylowego, eteru, acetonu i octanu etylu. Poziom aktywności biologicznej ekstraktów propolisu określany przez 55

wymienionych wyżej autorów najczęściej siłą antybakteryjną przedstawia się bardzo różnie. Powodem tego poza pochodzeniem propolisu jest stosowanie: odmiennych testów aktywności biologicznej, różnych metod uzyskiwania badanych frakcji czynnych, a w tym różnych rozpuszczalników. Tematem niniejszej pracy było zbadanie przydatności kilku najczęściej stosowanych rozpuszczalników organicznych propolisu: 96% alkoholu etylowego, 70% alkoholu etylowego, octanu etylu, acetonu, eteru etylowego i układu rozpuszczalników: woda-tween 20. MATERIAŁ I METODY BADAŃ Próbki propolisu uzyskano w 1985 r. z pięciu różnych pasiek. Przebadano 6 rozpuszczalników organicznych: 960/0 alkohol etylowy. 70 /0 alkohol etylowy, octan etylu, aceton, eter etylowy i układ rozpuszczalników: woda-tween 20 (9: l). Sporządzono 10% roztwory propolisu w tych rozpuszczalnikach uzyskując w efekcie 30 próbek do badań. Aktywność antybakteryjną roztworów propolisu oznaczano zaraz po ich przygotowaniu. Sprawdzano ponadto aktywność antybakteryjną próbek propolisu nr l, 2, 5 przechowywanych w temperaturze pokojowej bez dostępu światła przez 1 rok w postaci roztworów w 70% alkoholu etylowym, Ocenę aktywności antybakteryjnej roztworów propolisu przeprowadzano stosując test mikrobiologiczny z wykorzystaniem wzorcowego szczepu bakteryjnego Baciiius subtilis ATCC 663B. Do hodowli płynnych zastosowano pożywkę bulionową Bacto Nutrient Broth firmy Difco, a do hodowli na podłożu stałym pożywkę agarową Bacto Nutrient Agar firmy Difco. Test mikrobiologiczny z płynnymi hodowlami statycznymi szczepu bakterii polegał na liczeniu przeżywających bakterii w pożywce po wprowadzeniu propolisu do hodowli. Stosowano następujące stężenia propolisu w pożywkach: 60, 100, 200, 400, 600 ug/cm", Równolegle wykonywano 2 próby kontrolne: - z samym rozpuszczalnikiem dodawanym w ilości 0,03 cmvcm" pożywki (maksymalne stężenie rozpuszczalników w pożywkach w próbach właściwych), - bez rozpuszczalnika i propolisu. Po kilkunastogodzinnej inkubacji w temperaturze 37 C przeżywające bakterie w pożywkach z propolisem oraz w hodowlach kontrolnych liczono stosując metodę kolejnych rozcieńczeń i posiewów na pożywki stałe (agarowe). W pływ propolisu na przeżywalność testowego szczepu bakterii Bacil- Lus subtilis dla poszczególnych próbek przedstawiono w postaci wykresów. Na osi odciętych zaznaczono stężenie propolisu w płynnej hodowli bakteryjnej w ug/em", a na osi rzędnych logarytm z liczby bakterii po- 56

zostałych w pożywce. Jako wskaźnik aktywności antybakteryjnej propolisu przyjęto logarytm z Iiczby zniszczonych bakterii przy stężeniu propolisu w pożywce 600 ug/crn". WYNIKI W badaniach wstępnych wykluczono wpływ samych rozpuszczalników na wzrost testowego szczepu bakteryjnego. W hodowlach kontrolnych z dodatkiem samych rozpuszczalników występowały bakterie w ilości rzędu 10 8, 10 9, a więc tyle ile w hodowlach kontrolnych bez propolisu i rozpuszczalnika. Najwyższą spośród badanych aktywnością antybakteryjną wykazała się próba nr 1 (ryc. 1.). Największy wpływ na testowy szczep bakteryjny posiadał roztwór propolisu w 700/0 alkoholu etylowym. Niszczył on całkowicie hodowle bakteryjne złożone z ilości bakterii rzęlog Z licz balcterii 7 6 5 4-... -;....)~ ~. ',,", S.. _.....l... _::..-T _ -,,._,_.,._". _..., \. ".. ~ \. 3'.-.-.~.... 4 --.... --~'"...... "..... ','.........,....... ~-, -.-.... -.-..0 -.;,,~. 3 2 1 o 60 100 Ryc. 1. Wpływ propolisu na przeżywalność wzorcowego szczepu bakteryjnego 3aci!!us subtilis ATCC 663B - próbka nr 1 (1-70% alkohol etylowy, 2 _ 96 0 /, alkohol etylowy, 3 - octan etylu, 4 - aceton, 5 - układ rozpuszczalników: woda-tween 20 (9:1» Effect of propolis on survival rat e of standard strain of Bacillus subtilis ATCC '(;133B - sample 1 (1-70% ethyl alcohol, 2-96% ethyl alcohol, 3 - acetate ethyl, 4 - acetone, 5 ~ solventsystem: water-tween 20 (9:1» du los, 10 9 już przy stężeniu 200 ug/cmspożywki. Ten sam propolis rozpuszczony w 960/0 alkoholu etylowym, octanie etylu i acetonie posiadał już niższą aktywność. Nie zostały zniszczone hodowle bakteryjne nawet przy przyjętym za maksymalne w naszych badaniach stężeniu propolisu 600 ug/cm". Przy tym stężeniu w pożywkach pozostawały nadal żywe ba- 57

kterie w ilości rzędu od 10 3 do 10 5 Natomiast propolis rozpuszczony w układzie rozpuszczalników: woda-teen 20 (9: 1) posiadał najmniejszy wpływ na przeżywalność wzorcowego szczepu bakteryjnego. Przy stężeniu 600 ug/cm" w pożywce pozostawały nadal nie zniszczone bakterie w ilości rzędu 10 8 Stosując jako rozpuszczalnik eter etylowy próbka propolisu nr 1 nie niszczyła w ogóle hodowli bakteryjnych. Przy stężeniu propolisu w powyżce 600 ug/cm" pozostawały nadal bakterie w ilości rzędu 10 8, 10 9, a więc tyle ile w hodowlach bakteryjnych bez propolisu (kontrolnych). Próbka nr 4 charakteryzowała się niską aktywnością antybakteryjną w stosunku do Bacillus subtilis ATCC 663B (ryc. 2.). W tym przypadku największy wpływ na przeżywalność badanych bakterii posiadał roztwór propolisu w 70% alkoholu etylowym. Jednakże nie niszczył on całkowicie hodowli bakteryjnych nawet przy maksymalnym stężeniu 600 /lg/cm 3 Przy tym stężeniu w pożywkach pozostawały nadal bakterie w ilości rzędu 10 4-10 5 Aktywność antybakteryjna pro- 101 % liczby bakterii 10 9 8 7 6 5 4 --. -.:.'-' -'...",.,.......:..~._._._._._... ł :-::-.~.-:~-:-.,..._.- _._. '3 '~":':""""'''' 4...... '........ 2. 1 3 2. 1 o 60100 200 400 Ryc. 2. Wpływ propolisu na przeżywalność wzorcowego szczepu bakteryjnego BacilZus subtilis ATCC 663B - próbka nr 4 (1-70% alkohol etylowy, 2 _ 96"/., alkohol etylowy. 3 - octan etylu, 4 - aceton) Effect of propolis on survival rate of standard strain of Bacillus subtilis ATCC 663B - sample 4 (1-700f0 ethyl alcohol, 2-960f0 ethyl alcohol, 3 - acetate ethyl, 4 - acetone) polisu rozpuszczonego w 96% alkoholu etylowym, octanie etylu i acetonie była jeszcze niższa. Przy stężeniu propolisu 600 ug/cm" w pożywkach pozostawały nadal żywe bakterie w ilości rzędu 10 5-107. Ta sama próbka propolisu rozpuszczona w układzie rozpuszczalników: woda-tweera 58

20 (9: 1) i w eterze etylowym nie niszczyła w ogóle testowego szczepu bakterii w hodowlach. Dla roztworów propolisu w 70% alkoholu etytowym uzyskano najwyższe wartości wskaźnika aktywności antybakteryjnej, od 8,8 dla próbki nr 1 do 3,7 dla próbki nr 4 (tab. 1). Znacznie niższe dla roztworów w 96% alkoholu etylowym od 4,7 dla próbki nr 1 do 1,5 dla próbki nr 3, Tabela 1 Wskaźnik aktywności antybakteryjnej propolisu (logarytm z liczby zabitych bakterii w pożywce - stężenie propolisu 600 ~g/cm3) Index of antibacterial activity of propolis (logarithm of number of bacteria killed in culture -concentration of propolis 600 ~g/cm3) Rozpuszczalnik Solvent 70% alkohol etylowy 70&/0 ethyl alcohol 96 /0 alkohol etylowy 96% ethyl alcehol Octan etylu Acetate ethyl Aceton Acetone Układ rozpuszczalników: woda-tween 20 (9:1) Solvent system: water-tween 20 (9:1) Eter etylowy Ethyl ether Nr próbki propolisu No. of propolis samples l 2 3 4 5 8,8 8,7 4,8 3,7 5,5 4,7 2,9 1,5 3,4 4,5 4,4 1,4 1,4 1,7 3,6 4,1 1,1 1,6 1,9 1,1 o 0,4 o o o o o o o w octanie etylu od 4,4 dla próbki nr 1 do 1,4 dla próbki 2 i 3 i w acetonie od 4,1 dla próbki nr 1 do 1,1 dla próbki nr 3. Bardzo niskie wskażki uzyskano dla roztworów w układzie rozpuszczalników: woda-tween 20 (9: 1). Tylko 2 próbki spośród 5 badanych (nr 1 i 3) wykazały niewielką aktywność - 1,1 i 0,4. Pozostałe próbki były nie aktywne ze wskaźnikiem aktywności O. Podobne wskaźniki aktywności O uzyskiwano dla wszystkich próbek rozpuszczonych w eterze etylowym. Ponieważ najbardziej aktywne okazały się próbki propolisu nr 1, 2 i 5 rozpuszczone w 70% alkoholu etylowym zbadano ponownie ich aktywność po rocznym okresie przechowywania w temperaturze pokojowej bez dostępu światła (ryc. 3.). Wskaźniki aktywności antybakteryjnej dla badanych próbek zachowały swoje wartości na poziomie zbliżonym do wartości początkowych (dla propolisu świeżego). 59

WskainIk I aklly...ności ~ Il 10 D b 1 9 2 8 7 fi.5 '+ :5 2 '1 Ryc. 3. Porównanie wskaźnika aktywności antybakteryjnej propolisu a - świeżego i b - przechowywanego w temperaturze pokojowej przez 12 miesięcy w postaci roztworu w 700/0 alkoholu etylowy-m {l, 2, 5 - numer próbki propolisu) Comparision of index of arrtibacter ial activity of a - fresh propolis and b - after stor ing for 12 months at room temperature as 70% ethyl alcohol solutlon (1, 2, 5 - number of propolis sam pies) DYSKUSJA Wyniki naszych badań znacznie różnią się od wyników uzyskiwanych w podobnych badaniach przez innych autorów. Jest to spowodowane stosowaniem odmiennych metod określania siłyantybakteryjnej i odmiennych sposobów uzyskiwania badanych ekstraktów. Nie bez znaczenia jest źródło pozyskiwania propolisu. Na rozbieżności w wynikach badań aktywności antybakteryjnej propolisu zwrócił uwagę L a v i e (1980). Wykazał on jak i my niejednakowo silne działanie bakteriobójcze alkoholowych i wodnych ekstraktów propolisu pochodzącego z różnych źródeł. M e r e s t o w i e (1980) uzyskali wysoką aktywność ekstraktów propolisu w 70% alkoholu etylowym (MI C = 60, MBC = 120 dla ph podłoża płynnego 6,8) podobnie jak w naszych badaniach, ale test biologiczny przeprowadzali na Staphylococcus aureus 209 P (Oxford), a my na Bacillus subtilis A TCC 663B. J ó ź w i k (1985) badał aktywność różnych frakcji EEP w stosunku do saprofitycznych prątków kwasoopornych. Do ekstrakcji stosował układy różnych rozpuszczalników. Największe strefy zahamowania wzrostu prątków gruźlicy uzyskał działając frakcjami octanu etylu, eterowo-benzenową i benzenową. Średnice stref zahamowania wzrostu Mycobacterium 60

sp. 279 w milimetrach wynoszące dla frakcji octanowych 29 i 30 były bardzo zbliżone do otrzymanych dla samego EEP (30 mm) zastosowanego przez autora. Uzyskana przez nas aktywność propolisu rozpuszczonego w octanie etylu w stosunku do bakterii BacilLus subtilis kształtowała się również na poziomie zbliżonym do aktywności propolisu rozpuszczonego w 960f0alkoholu etylowym. W przypadku badania aktywności biologicznej EEP rozpuszczonego w roztworach Tween 20 różni autorzy uzyskują wysoce zróżnicowane wyniki, od bardzo niskiej do aktywności równej roztworom w alkoholu etylowym. W naszych badaniach roztwory te miały bardzo niską aktywność antybakteryjną lub były w ogóle nieaktywne. Na niską aktywność w stosunku do testowego szczepu bakteryjnego Bacillus subtilis zwrócił uwagę Scheller i in. (1968). Zastanawiająca również jest uzyskana w naszych badaniach zerowa aktywność antybakteryjna roztworów eterowych propolisu. Tym bardziej że w badaniach przeprowadzonych przez E 11 n a i n-woj t a s z e k i in. (1985) eterowy roztwór propolisu otrzymany poprzez ekstrakcję w aparacie Soxhleta wykazywał wysoką aktywność w stosunku do wzorcowego szczepu bakteryjnego Streptococcus aureus - wartość stężenia hamującego wzrost 60!J,g/cm s.również i w tym przypadku różnice w wynikach są spowodowane prawdopodobnie odmienną metodą ekstrakcji i stosowaniem różnych organizmów testowych. W a c h o n i n a (1976) podaje, że propolis przetrzymywany zarówno w temperaturze OOCjak i wokoło 20 C w ciągu kilku lat zachowuje właściwości antybakteryjne na zbliżonym poziomie. Według S c h e l- I e r a (1968) zarówno surowiec jak i frakcje etanolowe propolisu zachowują w temperaturze 4 C właściwości antybakteryjne na poziomie aktywności początkowej przez 8-9 miesięcy. Natomiast według S t oj k i (1978) propolis niezależnie od warunków przechowywania zachowuje właściwości antybakteryjne na podobnym poziomie przez 18 miesięcy. Nasze badania wykazały, że okres 1 roku jest bezpiecznym okresem przechowywania propolisu w postaci roztworu w 70% alkoholu etylowym. WNIOSKI l. Najwyższą aktywnością w stosunku do Bacillus subtiiis ATCC 663B charaktyryzował się roztwór propolisu w 70% alkoholu etylowym. Niższą aktywnością i na zbliżonym poziomie charakteryzowały się roztwory w 96% alkoholu etylowym, octanie etylu i acetonie. Słabą aktywnością lub jej brakiem charakteryzowały się roztwory w układzie rozpuszczalników: woda-tween 20 (9: 1) i w eterze etylowym. 2. Roztwór propolisu w 700/0 alkoholu etylowym zachowuje aktywność na prawie nie zmienionym poziomie przez około 12 miesięcy. 3. Propolis wykazuje różną aktywność antybakteryjną w stosunku 61

Bacillus subtilis ATCC 663B w zależ- do testowego szczepu bakteryjnego ności od jego pochodzenia. LITERATURA E 11 n a i n-woj t a s z e k M., B Y l k a W., S k r z y p c z a kl., K o wal e w- s k i U., H ł a d o ń B., C h o d e r a A. (l985) Badania fitochemiczne biologicznie czynnych frakcji propolisu. Międzynarodowe Sympozjum Apiterapii. Zagadnienia Wybrane. Kraków: 43-48 Hładoń B., Ellnain-Wojtaszek M., Bylka W., Zdanows'ki M., S'k r z y p cz ak L., Chodera A., Kowalewski Z. (l985) Aktywność Cytostatyczna propolisu in vitro: badania frakcji eterowych ekstraktów DEEP i ich sekwencyjnych podfrakcji. Międzynarodowe Sympozjum Apiterapii. Zagodnienia Wybrane. Kraków: 60-66 J ó ź w i k Z. (19185) Wpływ ektraktów propolisowych zawierających flowonoidy na wzrost saprofitycznych prątków kwascepornych. Międzynarodowe Sympozjum Apiterapii. Zagadnienia Wybrane. Kraków: 71-77 L a v i e P. (1980) Ant ibiotische, fungizide und phytoinhibierende Eigrnschaften der Propolis. Apiacta 15(3):108-116 M e r e s t a L., M e r e s t a T. (1980) Effect of ph on bacter leidal activity of propolis. Bul1etin oi the Veterinary Institute in Puławy. 24(1-4):21-25 M e r e s t a L., M e r e s t a T. (1982) Usefulness of varoius solvents for extracttng biologically active substances from propolis. Bulletin of the Veterinary Institute in Puławy. 35(1-4):12-14 M e r e s t a L., M e r e s t a T. (1983) Research on in vitro antibacterial activity of propolis extracts. Bulletin oi the Veterinary Institute in Puławy, 26(1-4):77-80 M e r es t a L., M e r e s t a T. (1985) Zagadnienia oceny aktywności antybakteryjnej ekstraktów propolisu. Międzynarodowe Sympozjum Apiterapil. Zagadnienia Wybrane. Kraków: 103-107 S c h e 11 e r S., N a l e waj k o E., P a n a s i e w i c z M., D z i e k a n o w s k a D., T us t a n o w s k i J., S to j k O A. (1977) Biolog ical and clinioal applicat ion of propolis. The action of et hanol extract of propolis (EEP)on cells cultured in vitro. Arzneim.-Forsch. Drua Res. 27(2),8:1547-1549 Scheller S., Rogala D.,. Stasiak E., Zurek H. (1968) Antibacterial properties of propolis. Polskie Archiwum Weterynaryjne. 11(3): 391-398 S t o j k o A. (1978) Doświadczalne i kliniczne badania nad.zastosowaniem ekstraktów propolisu. Rozprawa habilitacyjna. Instytut Weterynarii w Puławach Wa c h o n i n a T. V. (1976) Propolis - sostav, svojstva i vozmożnosti prakticeskovo ispolzovania: 67-68, 70-71 EFECT OF VARIOUS SOLVENTS ON THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF PROPOLIS H. R y b a k-c h m i e l e w s k a, T. S z c z ę s n a Summary Experiments of antibacterial activity of propolis in different solvents were made in 1985-87 in Puławy. The following organie solvents: 96010ethyl alcohol, 70010 ethyl alcohol, acetate ethyl, acetone, solvent system: water-tween 20 (9:1) and ethyl ether we re tested using the standard stram of BacilLus subtilis ATCC 663 B. The results of these studies presented in table 1 show that antibacterial adivity of propolis deperided to a,big degree on the used solvents. Propolis dissolved in 70% ethyl alcohol had the best antibacterial act ivity, 62