PODSTAWY INTERPRETACJI WIDM MASOWYCH
1. Ustalanie masy cząsteczkowej Metody: widmo EI 7 ev i np. 12 ev; łagodne metody jonizacji (FAB, LSIMS, CI, ESI, APCI, MALDI, FI) w celu otrzymania jonu molekularnego.
TERMINOLOGIA Jon molekularny: jon o masie równej masie cząsteczkowej badanego związku (z dokładnością do masy elektronu) powstający w wyniku oderwania lub (znacznie rzadziej) przyłączenia elektronu przez cząsteczkę. Jon pseudomolekularny, quasimolekularny lub jon typu jonu molekularnego: jon powstający w wyniku przyłączenia prostego jonu (najczęściej H +, Na +, Cl - ) do cząsteczki badanego związku lub oderwania jonu H + od tej cząsteczki. Obecnie zaleca się stosowanie nazw typu: protonowana cząsteczka, deprotonowana cząsteczka itp.
REGUŁA AZOTOWA Parzysta liczba atomów azotu = = parzysta masa cząsteczkowa (nominalna) Nieparzysta liczba atomów azotu = = nieparzysta masa cząsteczkowa (nominalna) W spektrometrii mas dotyczy jonów nieparzystoelektronowych. Dla jonów parzystoelektronowych jest na odwrót. Jony parzystoelektronowe: M + H +, M H +, M + Na +, M + Cl itp. powstają w wyniku jonizacji ESI, APCI, MALDI Jony nieparzystoelektronowe: M + powstają w wyniku jonizacji EI i FI
LICZBA MIEJSC NIENASYCENIA Dla cząsteczki o wzorze C x H y N z O n liczba miejsc nienasycenia N wynosi: N = x z 1 y + 1 + 2 2 Ogólniej: typ x: C,Si typ y: typ z: 1 H, F, Cl, Br, I N, P typ n: O, S Dla cząsteczek obojętnych i kationo- lub anionorodników liczba miejsc nienasycenia musi być całkowita i dodatnia lub równa. Dla jonów parzystoelektronowych ułamkowa i nie mniejsza niż.5.
Warunki, które musi spełnić jon molekularny w widmie EI (konieczne, ale nie wystarczające) 1. Musi być jonem o najwyższej masie w danym widmie (z uwzględnieniem jonów izotopowych). 2. Musi być jonem nieparzystoelektronowym, czyli odpowiadający mu wzór sumaryczny musi spełniać regułę azotową. 3. Masy najbliższych mu jonów fragmentacyjnych (czyli fragmentów o najwyższych masach) muszą dać się wyjaśnić utratą fragmentów obojętnych (cząsteczek lub rodników) o logicznych masach.
5. W przypadku próbek o charakterze amfoterycznym (np. peptydy) dodatni jon pseudomolekularny powinien mieć masę o dwie jednostki większą niż ujemny jon pseudomolekularny (dotyczy jonów M + H + i M H + ). Warunki, które musi spełnić jon pseudomolekularny w widmie LSIMS, ESI lub APCI 1. Musi być jonem parzystoelektronowym, a odpowiadający mu wzór sumaryczny musi spełniać regułę azotową po odjęciu lub dodaniu jonu odpowiedzialnego za jonizację (najczęściej H +, Na +, Cl - itp.). 2. Jego masa musi umożliwić wyjaśnienie obecności ewentualnych klasterów typu (nm+ Kat) +, (nm Kat) lub (nm+ A), a także klasterów z matrycą (w LSIMS) lub rozpuszczalnikiem (w ESI). 3. Jego masa musi być zgodna z masami obserwowanych jonów naładowanych wielokrotnie (w ESI, czasem także w LSIMS). 4. W większości przypadków zakwaszenie próbki powinno spowodować wzrost intensywności jonu M + H +, a dodanie soli sodowej jonu M + Na +.
Zależność wyglądu widma EI octanu etylu od energii elektronów 43 61 7 88 M + O C H 3 C O CH 2 CH 3 M = 88
PROFILE IZOTOPOWE JONÓW W FUNKCJI ICH MASY C 3 H 7 NO 2 C 6 H 12 N 2 O 3 C 15 H 33 N 5 O 9 C 3 H 68 N 1 O 19 C 6 H 138 N 2 O 39 C 15 H 348 N 5 O 99 89 89.5 89.9 16 16.9 16.17 Masa nominalna 427 427.23 427.43 872 872.47 89.93 1762 1762.94 1763.87 4432 4434.37 4436.69 Masa monoizotopowa Masa średnia
Przykład widma związku cynoorganicznego Sn,1 111.94823,.95, 1 113.92781,.65, 1 114.933441,.34, 1 115.917435, 14.24, 1 116.929536, 7.57, 1 117.91666, 24.1, 1 118.93312, 8.58, 1 119.92199, 32.97, 1 121.9344, 4.71, 1 123.95271, 5.98, 1 Sn M = 236 M +
Widmo ESI związku o małej cząsteczce (M = 397, MeOH, jony dodatnie) Spec #1[BP = 817.4, 2132] 1 2M + Na + 817.3 2132 9 Ph O 8 N O Ph % Intensity 7 6 5 M + H + M + Na + 42.2 398.2 OH M = 397 O 818.4 4 3 M + K + 436.2 2 1 616.3 623.7 819.4 3 42 54 66 78 9 Mass (m/z)
Widma ESI aldehydu o M = 269 Da w MeOH i EtOH Mariner Spec /27:32 (T /1.39:1.82) ASC[BP = 324.1, 611] 1 9 Widmo w MeOH 324.1 M + MeOH + Na + 611.2 R Aldehydy często tworzą hydraty i hemiacetale: O H + R' OH % Intensity 8 7 6 5 4 3 2 1 M + MeOH + H + 32.2 M + H 2 O + Na + M + H + M + Na + 31.1 325.1 173.1 217.1 27.1 292.1 239.2 325.5 349.2 15 2 25 3 35 4 Mass (m/z) R OH H OR' 1 9 8 Mariner Spec /7:26 (T /.38:2.) ASC[BP = 338.2, 355] 338.2 Widmo w EtOH M + EtOH + Na + 354.9 7 % Intensity 6 5 4 3 2 1 M + H 2 O + Na + M + Na + 31.1 339.2 185.1 217.1 292.1 15 2 25 3 35 4 Mass (m/z)
Widma ESI trietylenotetraminy w różnych rozpuszczalnikach N H 2 H N Aminy mogą reagować z formaldehydem (powstającym w wyniku anodowego utleniania metanolu), dając kationy imoniowe: N H NH 2 % Intensity 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Widmo w MeOH Mariner Spec /9:18 (T /.42:.88) ASC[BP = 147.1, 4623] 13.1 147.1 5 9 13 17 21 25 Mass (m/z) M + H + M + Na + 169.1 19.2 4622.6 H O R N R + CH 2 OH R N R H C H + H + - H 2 O CH 2 R N + R % Intensity 1 9 8 7 6 5 4 Widmo w MeOH/H 2 O/NaOAc Mariner Spec /2:42 (T /.5:2.13) ASC[BP = 147.1, 26] 147.1 M + H + 159.1 M + CH 2 O - H 2 O + H + formalnie: [M + CH] + 25.9 Taka reakcja jest dość rzadko spotykana w ESI, ale trzeba się z nią liczyć. 3 2 1 5 9 13 17 21 25 Mass (m/z)
2. Jaki jest skład elementarny związku (wzór sumaryczny)? Metody: dokładny pomiar masy jonu molekularnego lub peudomolekularnego i komputerowe dopasowanie możliwych składów elementarnych; badanie profilu izotopowego.
H, 2 Dokładne masy atomowe i składy izotopowe najlżejszych pierwiastków 1.78254, 99.985 2.141179,.15 He, 2 3.16293,.13 4.26325, 99.99987 Li, 2 6.151232, 7.52 7.1645, 92.48 Be, 1 9.121825, 1. B, 2 1.12938, 18.98 11.9353, 81.2 C, 2 12., 98.892 13.335484, 1.18 N, 2 14.3741, 99.635 15.1898,.365 O, 3 15.99491464, 99.759 16.999136,.37 17.99915939,.24 F, 1 18.9984325, 1. Ne, 3 19.9924391, 9.92 2.9938453,.257 21.9913837, 8.82 Na, 1 22.9897697, 1. Mg, 3 23.98545, 78.6 24.9858392, 1.11 25.9825954, 11.29 Al, 1 26.9815413, 1. Si, 3 27.9769284, 92.18 28.9764964, 4.71 29.9737717, 3.12 P, 1 3.9737634, 1. S, 4 31.972718, 95.18 32.9714591,.75 33.96786774, 4.215 35.96779,.17 Cl, 2 34.96885273, 75.4 36.9659262, 24.6
Definicje zdolności rozdzielczej spektrometru mas R 1% = M M M FWHM = M M h M h,5 h,1 h M,5 h 1%-owa dolina (R 1% ) - odpowiada szerokości na poziomie 5% M Szerokość połówkowa (FWHM Full Width at Half Maximum)
Wpływ definicji zdolności rozdzielczej spektrometru na wygląd widma R 1% FWHM Widma dla takiej samej nominalnie rozdzielczości R 1% i FWHM
Przykład wymagań dotyczących rozdzielczości niezbędnej dla rozróżnienia pików M M R CO 27,9949,113 2478 N 2 28,62,25 112 C 2 H 4 28,312
Wpływ zdolności rozdzielczej spektrometru na wygląd widma 1 8 6 4 2 R = 1 1 8 6 4 2 R = 5 1 8 6 4 2 R = 3 M 1 =1, M 2 =1,2
Wpływ masy jonów przy stałej różnicy masy i rozdzielczości na wygląd widma 1 8 6 4 2 R = 1 M = 1 M =,2 1 8 6 4 2 R = 1 M = 2 M =,2 1 8 6 4 2 R = 1 M = 35 M =,2
Ważne: Dokładny pomiar masy - wymagania Dokładny pomiar masy nie zastępuje analizy elementarnej, ponieważ nie dostarcza informacji o czystości próbki. Pozwala jedynie na stwierdzenie, że w widmie masowym badanej próbki znajduje się pik pochodzący od jonu o masie odpowiadającej założonemu wzorowi sumarycznemu. Czystość związku należy udowodnić w inny sposób. Wymagania większości czasopism odnośnie dokładnych pomiarów masy są następujące: 1. Pomiar musi dotyczyć jonu molekularnego lub pseudomolekularnego (a nie jonów fragmentacyjnych). 2. Dokładność pomiaru powinna wynosić 5 ppm (w niektórych czasopismach dopuszcza się 1 ppm, zwłaszcza dla wyższych mas). 3. Można mierzyć masy nie przekraczające 8 u.
Wpływ dokładności pomiaru masy na liczbę możliwych wzorów sumarycznych Elements: C12:2 H1:3 N14:4 O16:6 S32:l Tolerance window: 2 mmu (ok. 8 ppm) Mass Deviation Formula (u) (mmu) 26.836. C:1 H:16 N:2 O:4 S:l -.7 C:16 H:1 N:3 O:l S:.7 C:18 H:12 N: O:2 S: Elements: C12:2 H1:3 N14:4 O16:6 S32:l Tolerance window: 5 mmu (ok. 19 ppm) Mass Deviation Formula (u) (mmu) 26.836-4. C:5 H:16 N:4 O:6 S:l. C:1 H:16 N:2 O:4 S:l -3.4 C:13 H:12 N:2 O:4 S: 2.7 C:13 H:14 N:3 O:1 S:l 4. C:15 H:16 N: O:2 S:l -.7 C:16 H:1 N:3 O:1 S:.7 C:18 H:12 N: O:2 S:
Wpływ wyboru pierwiastków na liczbę możliwych wzorów sumarycznych Elements: C12:12 H1:3 N14:4 O16:4 S32:l Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) 26.836. C:1 H:16 N:2 O:4 S:l Elements: C12:16 H1:3 N14:4 O16:4 S32:l Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) 26.836. C:1 H:16 N:2 O:4 S:l -3.4 C:13 H:12 N:2 O:4 S: 2.7 C:13 H:14 N:3 O:1 S:l 4. C:15 H:16 N: O:2 S:l -.7 C:16 H:1 N:3 O:1 S: Elements: C12:16 H1:3 N14:4 O16:4 Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) 26.836-3.4 C:13 H:12 N:2 O:4 -.7 C:16 H:1 N:3 O:1 Elements: C12:2 H1:2 O16:2 S32:l Tolerance window: 5 mmu Mass Deviation Formula (u) (mmu) 26.836 4. C:15 H:16 O:2 S:l.7 C:18 H:12 O:2 S:
Profile izotopowe kombinacji pospolitych pierwiastków dwuizotopowych typu M+2
Porównanie profilu izotopowego zmierzonego i obliczonego 1 9 8 782.2 Widmo zmierzone Intensity (%age) Intensity (%age) 7 6 5 4 3 2 1 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 776 778 78 782 784 786 788 79 792 Low Resolution M/z 776.1762 776.2 777.1 778.2 778.17517 779.2 779.1754 78.1 781.2 781.17543 783.1 782.17345 784 784.17414 785.1 Widmo obliczone dla składu: C 35 H 38 F 6 N 2 O 5 Ru 786.1844 787.18277 789.19169 776 778 78 782 784 786 788 79 792 Mass
3. Czy związek jest czysty? Metody: zachowanie próbki podczas parowania w źródle jonów (w EI); stwierdzenie obecności więcej niż jednego jonu molekularnego; stwierdzenie wzajemnej niezgodności widm jonów dodatnich i ujemnych.
Badanie zachowania próbki podczas parowania w źródle jonów EI 278 35-3 255 255 27 27 278 295 295
4. Jaka jest budowa cząsteczki związku (wzór strukturalny)? Metody: analiza fragmentacji w standardowym widmie EI; identyfikacja związków znanych przez porównanie widma eksperymentalnego z widmami z komputerowej biblioteki widm; badanie ścieżek fragmentacji poprzez rejestrowanie jonów metastabilnych i jonów powstających w wyniku aktywacji zderzeniowej (CID); dokładne pomiary masy jonów fragmentacyjnych; wymiana izotopowa; otrzymywanie i badanie pochodnych.
Identyfikacja produktu reakcji na podstawie widma masowego O OC 2 H 5 OH OH OC 2 H 5 NaOH EtOH czy? 1 315 x 5 9 8 7 344 59 = C 3 H 7 O Intensity (%age) 6 5 4 3 16 189 316-59 43 M + 2 1 15 13 234 5 1 15 2 25 3 35 4 Low Resolution M/z
α-pinen (96 %) 2.33 β-pinen (97 %) 3.17 Chromatogram GC/MS olejku cytrynowego. Składniki zidentyfikowano na podstawie biblioteki widm Wiley a sabinen (97 %) mircen 3.33 (96 %) 3.96 4.78 limonen (99 %) γ-terpinen (97 %) 5.82 linalool (97 %) 11.57 octan linalylu (91 %) 11.72 12.12 α-bergamoten (98 %) 12.3 β-kariofilen (99 %) 11.5 12. 12.5 13. 13.5 14. p-cymen (97 %) α-terpinolen 11.57 6.4 (98 %) 12.12 6.66 β-bisabolen (95 %) Z-cytral (97 %) 13.52 α-terpineol (91 %) 13.69 13.52 14.7 geranial (96 %) 14.19 14.19 octan geranylu (91 %) 14.45 14.45 14.5 2. 4. 6. 8. 1. 12. 14. min. Liczby w nawiasach określają w procentach współczynnik zgodności widma zmierzonego i bibliotecznego
Statystyka procedury porównywania widm Average of 14.39 to 14.86 min.: CYTR6.D olejek cytrynowy w heksanie.2 ul PBM Search of library d:\database\wiley275.l Name MolWt Formula Qual 1..BETA.-BISABOLENE 24 C15H24 92 2..beta.-Farnesene $$ 1,6,1-Dodecatriene, 24 C15H24 9 3. NEROL 154 C1H18O 9 4. trans-.beta.-farnesene $$ (E)-.beta.-Far 24 C15H24 9 5..beta.-Bisabolene $$ Cyclohexene, 1-meth 24 C15H24 81 6..BETA.-BISABOLENE 24 C15H24 72 7..beta. bisabolene $$ BETA-BISABOLENE 24 C15H24 7 8. (Z)-.beta.-Farnesene $$ 1,6,1-Dodecatri 24 C15H24 7 9. 5-BROMO-3-PENTENE $$ 1-Pentene, 5-bromo- 148 C5H9Br 6 1. CIS-.ALPHA.-BISABOLENE 24 C15H24 53 11..alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 24 C15H24 52 12..alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 24 C15H24 5 13..alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 24 C15H24 5 14..alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 24 C15H24 5 15..ALPHA.-HUMULENE $$ ALPHA-HUMULENE 24 C15H24 5 16..alpha.-Humulene $$ 1,4,8-Cycloundecatri 24 C15H24 38 17. CIS-.ALPHA.-BISABOLENE 24 C15H24 38 18..beta.-Bisabolene $$ Cyclohexene, 1-meth 24 C15H24 38 19..beta.-Bisabolene $$ Cyclohexene, 1-meth 24 C15H24 38 2..beta.-Bisabolene $$ Cyclohexene, 1-meth 24 C15H24 38
Wykorzystanie wymiany izotopowej do ustalania liczby wymienialnych atomów wodoru O N H 2 M = 137 OH Intensity (%age) Intensity (%age) 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Widmo standardowe 37 39 46 52 55 6 65 Widma EI 66 74 8 92 93 1819 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 Low Resolution M/z Widmo po kilkakrotnym odparowaniu próbki z CH 3 OD 33 37 39 44 47 52 55 61 65 66 73 74 77 81 89 92 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 Low Resolution M/z 93 1819 12 12 121 121 131 136 137 d 1 138 d 2 d 3 141 149
Wykorzystanie wymiany izotopowej do ustalania liczby wymienialnych atomów wodoru O N H 2 M = 137 OH % Intensity % Intensity 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 138 M + H + M + Na + 16 139 161 Widma ESI Widmo w MeOH/H 2 O 1 12 14 16 18 2 Mass (m/z) 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 d 2 -M + D + d 3 -M + H + d-m + D + d 2 -M + H + M + D + d-m + H + 14 141 139 142 d 2 -M + Na + 162 d 3 -M + D + 161 163 d 3 -M + Na + d 1 -M + Na + Widmo w MeOD/D 2 O 1 12 14 16 18 2 Mass (m/z)
Typowe zanieczyszczenia próbek obserwowane w widmach masowych
Węglowodory nasycone (na przykładzie triakontanu C 3 H 62 ) M = 422
Silikony Abundance 73 #275767: SILIKONFETT SE3 (GREVELS) 9 CH 3 CH 3 8 7 RO CH 3 Si O CH 3 Si O CH 3 n Si OR CH 3 6 5 147 221 M = 74 4 27 355 3 281 429 m/z--> 2 1 26 111 295 53 41 181 325 577 253 475 534 652 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 55 6 65
Ftalan di-n-butylu M = 278
Ftalan diizooktylu M = 39
Widmo ESI ftalanów 1 9 8 Spec /2:19 ASC[BP = 413.3, 542] 413.3 ftalan diizooktylu + Na + 413 542.4 7 6 % Intensity 5 4 3 ftalan di-n-butylu + Na + 31 31.1 2 414.3 (ftalan diizooktylu) 2 + Na + 393.3 1 32.1 349.2 437.2 83.6 149. 311.3 36.3 394.3 481.3 447.3 525.3 691.4 13. 182.9 215. 251.1 285.2 357.2 421.3 475.3 569.4 613.4 657.5 717.5745.5 85.5 1 28 46 64 82 1 Mass (m/z) 83
Siarka (widmo rzeczywistej próbki zanieczyszczonej siarką) 1 64 256 S 2 S 9 8 Intensity (%age) 8 7 6 5 4 S 5 16 S 4 128 S 6 192 3 S 3 2 1 34 41 55 66 96 85 18 136 162 184 S 7 224 247 26 5 1 15 2 25 3 Low Resolution M/z