UNIWERSYTET IM. ADAMA MICKIEWICZA W POZNANIU Wydział Chemii

Transkrypt

1 Poznań, dnia r. R E C E N Z J A pracy doktorskiej Pana mgr. inż. Jakuba Łukasza Zdarty pt.: Immobilizacja enzymów na wybranych nośnikach organicznych i nieorganicznych opracowana na zlecenie Dziekana Wydziału Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej na podstawie uchwały RW-1/2/2017 z dnia 10 stycznia 2017 r. Recenzowana praca doktorska została wykonana pod kierunkiem Pana prof. dr. hab. inż. Teofila Jesionowskiego w Instytucie Techno1ogii i Inżynierii Chemicznej Wydziału Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej i leży w zakresie badań prowadzonych przez grupę badawczą promotora pracy, obejmującym m.in. syntezę, charakterystykę właściwości i zastosowanie napełniaczy, adsorbentów czy hybryd organicznonieorganicznych otrzymywanych na bazie biopolimerów. Promotorem pomocniczym była Pani dr inż. Agnieszka Kołodziejczyk-Radzimska. Prof. Teofil Jesionowski jest wybitnym specjalistą w zakresie syntezy nanomateriałów i zakotwiczania związków organicznych oraz innych nanocząstek w nieorganicznych i organicznych matrycach w tym nurcie prowadzonych przez niego badań jest zlokalizowana recenzowana praca doktorska. Przedmiot pracy doktorskiej jest wysoce interesujący, albowiem zakotwiczony jest w zakresie szeroko rozumianej biokatalizie. Główną inspiracją do podjęcia przez Doktoranta badań jest duże zapotrzebowanie przemysłu na biokatalizatory obecnie kilkaset produktów dostępnych na rynku otrzymuje się z wykorzystaniem biokatalizy enzymatycznej (Illanes et al Bioresour. Technol. 115, 48 57). Biokataliza to kataliza reakcji chemicznych przez biokatalizatory, np. enzymy, które tak znacząco obniżają ich barierę energetyczną, że reakcje te osiągają stan równowagi z większą szybkością niż reakcje niekatalizowane. Ważnym zagadnieniem w tej dziedzinie jest dążenie

2 do zmniejszenia kosztów pozyskiwania i stosowania preparatów enzymatycznych w produkcji żywności, detergentów, farmaceutyków oraz biopaliw. Sprzyja temu postęp w zakresie technik immobilizacji enzymów przyczyniający się do ich wielokrotnego wykorzystania. Konsekwencją tych możliwości jest coraz powszechniej stosowana nanobiokataliza. Poprawa w tym zakresie dotyczy głównie immobilizacji enzymów w nanostrukturyzowanych matrycach. Charakteryzują się one rozwiniętą powierzchnią właściwą, co ułatwia ich wiązanie z enzymami, większym poziomem uporządkowania, a tym samym korzystniejszą aktywnością biokatalizatora w przeliczeniu na jednostkę masy czy objętości. Wyżej wymienione fakty pozwalają na pozytywną ocenę ważności tematyki dysertacji, w szczególności w aspektach aplikacyjnych i użytkowych. Celem przedłożonej rozprawy Pana mgr. inż. Jakuba Zdarty była immobilizacja białek enzymatycznych: (a) proteazy z Aspergillus oryzae oraz (b) lipaz: Amano Lipase A (ANL) z Aspergillus niger, typu B z Candida antarctica oraz z Aspergillus niger na powierzchni różnych nośników porowatych: pochodzenia nieorganicznego: hydroksyapatytu i krzemionki; pochodzenia organicznego: gąbki roślinnej Luffa cylidrica i morskiej Hippospongia communis; kompozytowych: krzemionka-lignina, chityna-lignina oraz chityna modyfikowana związkami typu POSS (wielościenne oligomeryczne silseskwioksany). Podjęto się także scharakteryzowania wpływu początkowych parametrów procesu immobilizacji na aktywność katalityczną przez otrzymane nowe systemy biokatalityczne. Praca liczy 206 stron, zilustrowana jest 65 rysunkami i zawiera 26 tabel. Tytuł przedłożonej rozprawy doktorskiej został poprawnie zdefiniowany i odpowiada przedstawionym wynikom badań. Praca napisana jest w języku polskim, w układzie niemal klasycznym i jest podzielona na rozdziały: wstęp i część literaturową (65 stron); cel pracy (1 strona); część eksperymentalna/metodyka pracy (17 stron) omówienie wyników i ich dyskusja (69 stron); wnioski - podsumowanie końcowe wyników (6 stron); Całość pracy zakończona jest spisem literatury, który obejmuje 458 pozycji, co znacznie przekracza standard dla prac doktorskich. Zestawienie literatury jest zrobione rzetelnie, w szczególności ujęto najnowszą literaturę, np. pracę nr 79 (Environmental assessment of enzyme use in industrial production A literature review, 2013), czy też ze specjalnego numeru: Chemical Society Reviews (tom 42, rok 2013) poz. 50, 84, 88, 91, 109, 235, str. 2

3 247, 256. Dysertacja zawiera także streszczenie w języku polskim i angielskim, kończy się zaś wykazem prac naukowych oraz komunikatów prezentowanych przez Doktoranta publicznie, tj. 20 publikacjami opublikowanymi w czasopismach z listy JCR oraz jednej innym. Warto byłoby wyróżnić (np. pogrubioną czcionką) prace związane z tematyką rozprawy doktorskiej. Pan Jakub Zdarta umiejętnie wykorzystuje swoje prace w dyskusji wyników, tj. jest współautorem pozycji literaturowych 87, 360, 368, 377, 414 i 441, co wyraźnie wskazuje, że tezy rozprawy doktorskiej zostały już bardzo dobrze opublikowane. Część doświadczalna pracy została poprzedzona kompetentnie i przejrzyście ujętym przeglądem literatury, w którym Pan mgr inż. Jakub Zdarta syntetycznie przedstawił istotne zagadnienia związane z tematyką przedstawionej pracy. A mianowicie opisał: pojęcia związane z charakterystyką enzymów, mechanizmy i czynniki wpływające na immobilizację enzymów, przeprowadził przegląd literaturowy nt. syntezy oraz właściwości i zastosowanie porowatych nośników stosowanych w immobilizacji enzymów. Ogólnie część literaturowa jest bardzo interesująca, tematy są trafnie dobrane, zaś Autor właściwie stosuje przypisy literaturowe w tekście oraz przy podpisach rysunków. W szczególności należy podkreślić bogaty przegląd literaturowy zestawiony w formie tabeli 2 i 3 zawierający zestawienie enzymów oraz nośników stosowanych do celów immobilizacji. W tej części pewien niedosyt budzi krótki opis materiałów stosowanych komercyjnie, np. krzemionkowych materiałów, takich jak: Florisil czy Celite, żywic jonowymiennych, np.: Lewatit, materiałów biopolimerowych (np. Sepharose i Sephadex ) czy też polimerowych Accurel, Eupergit, itp. Usystematyzowania wymaga także nomenklatura polimerów (stosowanie nazw zalecanych wg. IUPAC zamiast zwyczajowych). Kolejne części omawianej pracy to opis metodyki pracy oraz wyniki przeprowadzonych badań. W tych rozdziałach dysertacji Pan mgr inż. Jakub Zdarta przedstawił dokładne warunki preparatyki materiałów porowatych oraz opis stosowanych metod badawczych. Doktorant stosował bardzo dużo fizyko-chemicznych metod analitycznych służących do analizy struktury, tekstury nośników, a także oceny aktywności i stabilności biokalizatorów. W tej części pracy

4 bardzo cenne jest schematyczne przedstawienie technologicznych etapów syntezy nośników (rys ). W ramach najbardziej objętościowej części pracy wyniki badań i ich dyskusja Pan Jakub Zdarta w szczególności podjął się określenia: właściwości strukturalnych i morfologii wytworzonych nośników z wykorzystaniem wielu technik eksperymentalnych; wpływu czasu immobilizacji oraz wyjściowego stężenia roztworu białka na aktywność biokatalizatorów; możliwości zastosowania nowej grupy materiałów nośnikowanych w charakterze biokatalizatorów transestryfikacji oleju rzepakowego metanolem. W kontekście omówionych wyżej badań chciałabym podkreślić, że recenzowana praca traktuje nie tylko o skutecznym wprowadzaniu enzymów do materiałów porowatych i uzyskiwaniu trwałych układów, ale także, na bazie wyników w tym głównym nurcie badań, stanowi pogłębione studium nad warunkami immobilizacji prowadzącymi do uzyskania materiałów o odpowiedniej stabilności, a przede wszystkim aktywności katalitycznej. Do najważniejszych osiągnięć pracy doktorskiej Pana mgr. inż. Jakuba Zdarty zaliczam: 1. Opracowanie skutecznych warunków osadzania enzymów na nośnikach różnego pochodzenia, w szczególności zdefiniowanie wpływu warunków początkowych procesu immobilizacji (czas oraz stężenie roztworu enzymu) na właściwości otrzymanych układów i aktywność katalityczną unieruchomionych enzymów. 2. Określenie rodzaju oddziaływań powstałych pomiędzy enzymem i nośnikiem oraz ocena ich wpływu na właściwości osadzonego białka; w szczególności na podstawie analizy wyników badań z wykorzystaniem spektroskopii FTIR, NMR orz XPS zaproponowano mechanizm adsorpcyjny, np. tworzenie wiązań wodorowych pomiędzy unieruchomionymi enzymami (np. lipazą) a matrycą (np. chityna-lignina). 3. Wyselekcjonowanie preparatów o najlepszych właściwościach, a następnie przetestowanie ich w roli katalizatorów w procesie transestryfikacji olejów roślinnych. 4. Zastosowanie materiałów odnawialnych do nośnikowania enzymów, np. gąbki roślinnej z gatunku Luffa cylindrica, czy też szkieletów gąbek morskich z gatunku Hippospongia communis. Obowiązkiem recenzenta jest wskazanie pewnych niedokładności, błędnych sformułowań, kolokwializmów oraz przede wszystkim ocena merytoryczna, która ma wskazać pewne niejasności czy sugestie. Generalnie praca jest napisana bardzo ładnie, a w szczególności poprawnie językowo i stylistycznie, wyróżnia się ponadto bogatą i niezwykle estetyczną szatą str. 4

5 graficzną. Do tej części pracy mam tylko kilka uwag i pytań, które stawiam w celu doprecyzowania pewnych fragmentów: 1. Czym się kierowano w doborze nośników do poszczególnych enzymów? Czy próbowano dobrać stężenie początkowe enzymu do różnych typów nośników? Czy myślano o wykorzystaniu materiału SBA-15 (lub innego uporządkowanego mezoporowatego sita molekularnego) jako nośnika? 2. Czy obliczono stopień pokrycia ciał porowatych enzymami? Komentarz: w pracy brakuje szczegółowych informacji na temat immobilizowanych enzymów, np. masy cząsteczkowej, rozmiaru cząsteczek, itp. Pozwoliłoby to dobrać w taki sposób nośnik (pojemność sorpcyjną), aby doprowadzić do uwięzienia enzymu i jednoczesnego ustabilizowania go w połączeniu z nośnikiem, co prowadzi do uzyskania nowych właściwości biokatalizatora, takich jak szybkość transportu substratu do enzymu i produktu reakcji na zewnątrz, z jednoczesną jego stabilizacją. Brakuje także danych wartości punktów izoelektrycznych, co pozwoliłoby ocenić trafność wyboru parametrów immobilizacji (np. ocenę wpływu ph). 3. Czy oznaczono zawartość enzymu na nośniku na koniec cykli katalitycznych? Warto byłoby przeliczyć aktywność katalityczną na aktywność molekularną (TON - turnover number, liczba obrotów enzymu liczba cząsteczek substratu, które w danej jednostce czasu mogą zostać przekształcone w produkt przez enzym w pełni wysycony substratem). 4. Czy Autor próbował zestawić aktywność molekularną zamiast maksymalnej aktywności katalitycznej, tak jak ma to miejsce w tab. 25? 5. Warto byłoby zestawić parametry kinetyczne wolnych oraz unieruchomionych enzymów dla wszystkich nośników, a nie tylko dla gąbki roślinnej. 6. Intensywność pasm w spektroskopii FTIR wyrażana jest w skali transmitancji (T) lub absorbancji (A). W badaniach FTIR w ramach przedkładanej pracy doktorskiej zastosowano względną intensywność [j.w.], lecz ze względów wykorzystywania ich

6 w analizie ilościowej wskazane byłoby stosowanie absorbancji. Brak ponadto znaczników osi Y (przynajmniej warto byłoby dodać podziałkę z jednostką główną). 7. Jaki był błąd względny analizy elementarnej? W świetle tego, czy można wyciągać wnioski na podstawie niewielkich zmian, np. w tabeli 6. Podsumowując, cel pracy został osiągnięty, praca posiada elementy nowości naukowej, a Autor wykazał, iż jest dobrym eksperymentatorem i potrafi interpretować otrzymane wyniki w sposób właściwy. Ponadto praca doktorska jest napisana logicznie, wzbogacona graficznie kolorowymi rysunkami. Nie dopatrzyłam się w niej bardzo istotnych błędów stylistycznych, zaś ilość sformułowań żargonowych czy też literówek jest niewielka. Autor powinien jednak stosować zawsze wyrażenie pasmo zamiast pik czy sygnał w trakcie opisu widm FTIR (np. str. 96), czy też zapis SBA-15 zamiast SBA 15 (str. 68), lakazy zamiast lakkazy (str. 69). Na koniec należy podkreślić, iż nie tylko recenzowana praca jest wartościowym materiałem badawczym, ale także dorobek naukowy Pana mgr. inż. Jakuba Zdarty wykracza poza zwyczajowo przyjęte osiągnięcia naukowe. Jest on autorem wielu (20) oryginalnych prac naukowych w renomowanych czasopismach o wysokim współczynniku, co już zostało podkreślone na wstępie recenzji, ale także 30 publikacji w materiałach pokonferencyjnych i innych. Ponadto jest współautorem 20 komunikatów ustnych i 35 posterów przedstawionych na międzynarodowych i krajowych konferencjach. Pan Jakub Zdarta uczestniczył także w ośmiu projektach badawczych jako wykonawca, zaś od października 2016 r. jest kierownikiem dwóch projektów Narodowego Centrum Nauki: PRELUDIUM 10 i ETIUDA 4. Odbył także dwa staże naukowe, w tym jeden zagraniczny oraz jest beneficjentem kilku nagród i stypendiów. Stwierdzam, że rozprawa doktorska mgr. inż. Jakuba Zdarty zgodnie z rozporządzeniem MENiS z dnia 15 stycznia 2004 (Dz. U. z 2004 r., nr 15 poz.128 z późniejszymi zmianami) oraz art. 13 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach i tytule naukowym oraz stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. z 2003 r., nr 65 pozycja 595 z późniejszymi zmianami) w pełni odpowiada wymogom określonym przez wyżej wymienione ustawy. Recenzowana rozprawa reprezentuje bardzo dobry poziom naukowy, zawiera elementy nowości naukowej, a wymienione powyżej uwagi polemiczne i pytania nie umniejszają mojej bardzo wysokiej oceny recenzowanej pracy. Doktorant uzyskał szereg ciekawych rezultatów, które zostały już opublikowane w licznych pracach. Napisana przez Pana Jakuba Zdartę rozprawa świadczy, że posiada wiedzę i umiejętności, którymi powinien charakteryzować się doktor nauk chemicznych. W szczególności na uwagę zasługuje szeroki zakres pracy str. 6

7 doświadczalnej i mnogość zastosowanych technik badawczych. Autor wykazał się zdolnością prowadzenia własnych studiów literaturowych, opracowania własnych metod rozwiązania postawionego problemu i krytycznej oceny faktów, interpretacji wyników badań oraz formułowania wniosków. Wobec powyższego wnioskuję o przyjęcie pracy i dopuszczenie mgr. inż. Jakuba Zdarty do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Ponadto, biorąc pod uwagę bardzo wysoki poziom recenzowanej pracy doktorskiej oraz wszystkie jej walory wymienione w recenzji wnioskuję o wyróżnienie pracy doktorskiej w stosownym trybie. Prof. dr hab. Izabela Nowak