VII. Pałeczki Gram-dodatnie: Corynebacterium, Listeria, Erysipelothtix, Lactobacillus - ćwiczenia praktyczne Ćwiczenie 1. Wykonanie barwionych preparatów mikroskopowych preparat barwiony metodą Grama z Corynebacterium pseudodiphtheriticum Opis preparatu: preparat barwiony metodą Grama z Lactobacillus spp. Opis preparatu: preparat barwiony metodą Neissera z. Opis preparatu:
Ćwiczenie 2. Ocena wzrostu szczepów na agarze z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (AK) gatunek drobnoustroju: Corynebacterium pseudodiphtheriticum typ hemolizy gatunek drobnoustroju: typ hemolizy Ćwiczenie 3. Oznaczanie cech biochemicznych szczepów maczugowców. a. wykonanie próby na katalazę Szczep badany.. wnioski
b. oznaczanie zdolności do redukcji azotanów Zasada metody: Badanie wykrywa zdolność wytwarzania przez bakterie reduktazy azotanowej. W wyniku jej działania drobnoustroje przekształcają jony azotanowe w azotynowe. Dodanie do hodowli odczynnika Griessa (kwas sulfanilowy: α-naftyloamina w kwasie octowym) powoduje, że zachodzi w roztworze reakcja diazowania kwasu sulfanilowego jonami azotynowymi, której produktem jest związek diazowy o barwie ceglastoczerwonej. Wykonanie: 1. Badanie wykonuje się na bulionie z dodatkiem azotanu potasu. 2. Po 24 godzinnej inkubacji do hodowli dodaje się odczynnika Griessa. Ceglastoczerwone zabarwienie hodowli świadczy o redukcji azotanów. próba dodatnia próba ujemna c. wykrywanie zdolności do wytwarzania ureazy Zasada metody: Enzymatyczny rozkład mocznika przez bakterie powoduje powstanie NH 3 i CO 2. Powstający NH 3 alkalizuje podłoże i powoduje zmianę zabarwienia z żółtej na różowoamarantową. Wykonanie: 1. Podłoże zawierające 2% mocznika zaszczepić badanym szczepem. 2. Całość inkubować w 37 0 C 18-24 godzin. 3. Odczytać wynik. próba dodatnia próba ujemna d. ocena zdolności utleniania/fermentacji glukozy, maltozy, sacharozy Zasada metody: Badanie zdolności sacharolitycznych bakterii wykonuje się na podłożu zawierającym surowicę końską, enzymatyczny hydrolizat kazeiny, cystynę, 1% glukozy i czerwień fenolową. Kwaśny rozkład węglowodanów powoduje zmianę ph środowiska i zmianę zabarwienia z czerwonego na żółte. Wykonanie: 1. Podłoże zawierające 1% glukozy lub maltozy lub sacharozy zaszczepić badanym szczepem 2. Całość inkubować w 37 0 C 18-24 godzin. 3. Odczytać wynik. próba dodatnia próba ujemna
Ćwiczenie 4. Różnicowanie szczepów Corynebacterium spp. na podstawie wybranych cech biochemicznych 1-redukcja azotanów, 2- wytwarzanie ureazy, 3- O/F glukozy, 4-rozkład maltozy, 5- rozkład sacharozy 1 2 3 4 5 1 Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium ulcerans Corynebacterium pseudodiphtheriticum Corynebacterium urealyticum
Ćwiczenie 5. Identyfikacja szczepów Corynebacterium spp. przy użyciu testu API Coryne Odczyt testu Po inkubacji do mikroprobówek NIT, PYZ, PyrA, PAL, GUR, GAL, αglu, βnag dodać odpowiednie odczynniki wg schematu: 1. Test NIT po kropli NIT1 i NIT2 2. Test PYZ 1 kropla PYZ 3. Testy PyrA, PAL, GUR, GAL, αglu, βnag po kropli ZYM A i ZYM B Odczytać wyniki wg załączonej tabeli.
Ćwiczenie 6. Identyfikacja szczepu Listeria monocytogenes a. próba na katalazę Szczep badany.. wnioski b. hydroliza eskuliny c. wzrost w temperaturze 4 0 C Materiał kliniczny miesza się proporcji 1:10 z bulionem i umieszcza w temp. 4 0 C. Pałeczki Listeria mnożą się w niskich temperaturach. d. test CAMP Czynnik CAMP jest białkiem enzymatycznym działającym jako ko-cytolizyna na częściowo zhemolizowane przez β-hemolizynę gronkowcową krwinki baranie. Wynikiem tego działania jest tzw. synergistyczna hemoliza. Wykonanie ćwiczenia: 1. Na powierzchnię płytki agarowej z 5% krwią baranią posiać liniowo (przez środek szalki) szczep Staphylococcus aureus ATCC 25923 wytwarzający hemolizę β. 2. Prostopadle do linii posiewu, w bliskiej odległości (ale nie dotykając) posiać badany szczep. 3. Płytkę inkubować przez 18-24 godzin w temperaturze 35 0 C. 4. Wytwarzanie czynnika CAMP objawia się pojawieniem strefy wzmożonej hemolizy w postaci przejaśnienia, często o kształcie jasnego grota strzały, w miejscu gdzie linia posiewu szczepu nachodzi na strefę hemolizy β gronkowca.
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Szczep badany Wnioski..... e. ocena zdolności hemolitycznych na podłożu agarowym z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej typ hemolizy Listeria monocytogenes ruch + typ hemolizy katalaza wzrost w 4 0 C hydroliza eskuliny test CAMP