KOMÓRKI MACIERZYSTE W BIOLOGII I MEDYCYNIE 99 POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 36, 29 SUPLEMENT NR 25 (99 11) KOMÓRKI MACIERZYSTE ORGANIZMU DOROS EGO W BIOLOGII I MEDYCYNIE ADULT ORGANISM STEM CELLS IN BIOLOGY AND MEDICINE Jerzy KAWIAK Centrum Medyczne Kszta³cenia Podyplomowego, Warszawa Skrót tytu³u: Komórki macierzyste w biologii i medycynie Streszczenie: Okres ycia komórek jest ograniczony, a komórki obumieraj¹ce s¹ zastêpowane nowymi, zró nicowanymi, pochodz¹cymi od komórek macierzystych. Komórki macierzyste w organizmie doros³ym mo na odszukaæ markerami obecnymi KOMÓRKI MACIERZYSTE ORGANIZMU DOROS EGO zarówno w komórkach macierzystych embrionalnych jak i komórkach macierzystych w tkankach. Przyk³adem W BIOLOGII tych markerów s¹ I bia³ka: MEDYCYNIE Oct3/4, CXCR4, Nanos, CD133, CD34. Wspólne funkcje komórek macierzystych to: 1) zdolnoœæ do samoodnowy (po podziale ADULT powstaj¹ ORGANISM nowe komórki STEM CELLS macierzyste), IN BIOLOGY 2) zdolnoœæ AND do ró nicowania MEDICINE w wyspecjalizowane komórki tkanek i narz¹dów, 3) opornoœæ na stresy toksyczne oraz radiacyjne. Komórki macierzyste Jerzy s¹ KAWIAK obecne w ró nych miejscach doros³ego organizmu np. w naskórku, w nab³onku przewodu pokarmowego, w miêœniach szkieletowych. Centrum Skupienia Medyczne tych komórek Kszta³cenia nazywamy Podyplomowego, niszami komórek Warszawa macierzystych. S¹ one tam zatrzymywane uk³adami chemokinowymi. Znanym uk³adem chemokinowym Streszczenie: Okres ycia w szpiku komórek kostnym jest ograniczony, jest ligand a komórki SDF-1 obumieraj¹ce (Stroma s¹ Derived zastêpowane Factor-1), nowymi, oraz zró nicowanymi, receptor pochodz¹cymi na komórkach od komórek macierzystych. CXCR4. Komórki Czynniki macierzyste wywo³uj¹ce w organizmie stres doros³ym mo na indukowaæ wykryæ markerami spadek obecnymi poziomu zarówno SDF-1 w komórkach w szpiku macierzystych kostnym, embrionalnych, co powoduje jak i mog¹ komórkach macierzystych w tkankach. Przyk³adem tych markerów s¹ bia³ka: Oct3/4, CXCR4, Nanos, przemieszczanie CD133, CD34. Wspólne siê komórek funkcje komórek macierzystych macierzystych do to: kr¹ enia 1) zdolnoœæ oraz do do samoodnowy nowych nisz. (po podziale Innym znanym powstaj¹ nowe uk³adem komórki chemokinowym macierzyste), 2) zdolnoœæ jest do uk³ad ró nicowania Wnt(ligand)/Frizzle w wyspecjalizowane LPR komórki (kompleks tkanek i receptora) narz¹dów, 3) na opornoœæ powierzchni na stresy toksyczne komórek. oraz radiacyjne. Komórki macierzyste s¹ obecne w ró nych miejscach Pierwszym doros³ego bezpoœrednim organizmu, np. w naskórku, dowodem w nab³onku istnienia przewodu komórek pokarmowego, macierzystych w miêœniach szkieletowych. Skupienia tych komórek nazywamy niszami komórek macierzystych. S¹ one tam zatrzymywane uk³adami chemokinowymi. by³y obserwacje Znanym uk³adem komórek chemokinowym ostrej bia³aczki w szpiku mieloidalnej. kostnym jest Rozpoczêto ligand SDF-1 nowotworowych izolowanie (Stroma Derived oraz Factor-1) opisy oraz takich receptor komórek na komórkach w ró nych macierzystych guzach. CXCR4. Komórki Czynniki macierzyste wywo³uj¹ce nowotworowe stres mog¹ indukowaæ stanowi¹ spadek zwykle poziomu mniej SDF-1 ni w szpiku 1% komórek kostnym, co guza powoduje w modelach przemieszczanie mysich. siê Przyjmuje komórek macierzystych siê, e do mutacje uk³adu kr¹ enia w komórkach oraz do nowych macierzystych nisz. Innym znanym prawid³owych uk³adem chemokinowym mog¹ jest uk³ad Wnt(ligand)/Frizzle LPR (kompleks receptora) na powierzchni komórek. Pierwszym bezpoœrednim dowodem istnienia komórek macierzystych nowotworowych by³y obserwacje komórek ostrej bia³acz- doprowadziæ do transformacji w komórki nowotworowe. D³ugi okres interfazy komórek ki mieloidalnej. macierzystych Rozpoczêto izolowanie nowotworowych oraz opisy takich sprzyja komórek gromadzeniu w ró nych guzach. w nich Komórki mutacji, macierzyste nowotworowe na czynniki stanowi¹ toksyczne zwykle mniej chroni ni 1% te komórek komórki guza przed w modelach dzia³aniem mysich. leków. Przyjmuje siê, e a opornoœæ mutacje S³owa w komórkach kluczowe: macierzystych komórki macierzyste, prawid³owych mog¹ komórki doprowadziæ macierzyste do transformacji nowotworowe, w komórki nisze, nowotworowe. D³ugi okres interfazy komórek macierzystych nowotworowych sprzyja gromadzeniu w nich markery, modele mysie. mutacji, a opornoœæ na czynniki toksyczne chroni te komórki przed dzia³aniem leków. Summary: Life span of cells is restricted and undergoing death cells are replaced S³owa kluczowe: komórki macierzyste, komórki macierzyste nowotworowe, nisze, markery, modele mysie. by new, differentiating cells starting from the stem cells. An example is the hemopoietic Summary: Life span system of the in adult the cells bone is restricted marrow. and Stem senescent/undergoing cells the adult apoptosis organism cells are may replaced be recognized by new ones that by originate markers from present population on/in of both stem cells. embryonic An example stem is the cells hemopoietic and tissue-specific system in the bone marrow. Stem cells in the adult organism may be identified by markers that are expressed by both stem embryonic cells. stem Examples cells and of tissue-specific these markers stem are cells. proteins Oct3/4, CXCR4, Oct3/4, Nanog, CXCR4, CD133 Nanos, and CD34 CD133, are CD34. examples The of such stem markers. cells The have stem cells common share several physiological common properties properties: such as they 1) may: 1) replicate forming and give rise a to new stem cells, cells, 2) differentiate 2) may differentiate into heterogenous to tissue heterogenous and organ specific tissue cells, and organ finally functional 3) stem cells are cells, self-protected 3) they against are self-protected various toxic agents against and radiation. toxic and Stem radiation cells reside stress. in the adult The tissues in specialized sites (niches) that are identified e.g., in the bone marrow, skin, digestive tract stem cells are localized at different sites of the adult organism e.g. in the skin epithelium, and skeletal muscles. Stem cells that reside in stem cell niches are anchored by chemokines and epithelium, in the epithelium of the digestive tract or in skeletal muscles. Specific sites of the organism, nishes, are populated by stem cells, where they remain due to activity of chemokine systems. Well known chemokine system working in the bone marrow is ligand SDF-1 (Stroma Derived Factor-1) and stem-cells membrane receptor CXCR4. Several stress factors may induce decrease in SDF-1 level in

1 J. KAWIAK adhesion molecules. An important role in retention of stem cells in niche plays a-chemokine SDF-1 (Stroma Derived Factor-1) and stem-cell expressed receptor CXCR4. Several stress factors may attenuate SDF-1-CXCR4 axis in the bone marrow, what leads to release of stem cells from their niches into circulation. Another important stem cell niche-anchoring mechanism is interaction of Wnt (ligand with Frizzled LRP (receptor). Recent evidence accumulated, that malignancy arises from maturation arrest of stem cells and their mutation rather than the dedifferentiation of somatic cells. Cancer stem cells are responsible for tumor growth, its re-growth and metastasis. The first direct evidence for the existence of cancer stem cells came from observations of the acute myeloblastic leukemia. Currently cell population enriched for cancer stem cells were isolated from several tumors. The cancer stem cells represent less than 1% of tumor cells in the mouse models. Key words: stem cells, cancer stem cells, markers, mouse models, nishes. WSTÊP Cia³o doros³ej osoby jest zbudowane wed³ug ró nych ocen, z 1 13 1 15 komórek. Czas ycia pojedynczych komórek jest ró ny, ale ograniczony i dla niektórych rodzajów komórek zosta³ okreœlony [17]. Komórki obumieraj¹ce s¹ zastêpowane nowymi, które wywodz¹ siê i ró nicuj¹ z tkankowych komórek macierzystych kr¹ ¹cych we krwi. Jednym z lepiej poznanych uk³adów odtwarzania komórek z komórek macierzystych jest uk³ad macierzystych komórek hemopoetycznych (HSC) w szpiku kostnym [25]. Termin komórki macierzyste dla komórek macierzystych uk³adu hemopoetycznego w piœmiennictwie polskim zaproponowa³ W. Jêdrzejczak w 1989 r. [25]. Terminy stosowane w zwi¹zku z komórkami macierzystymi oraz ich definicje przedstawiono w tabeli 1. W AŒCIWOŒCI KOMÓREK MACIERZYSTYCH I SUGESTIE WYKORZYSTANIA ICH W LECZENIU W wielu tkankach organizmu doros³ego znajdowano nieliczne komórki maj¹ce ekspresjê bia³ek-markerów obecnych w komórkach embrionalnych wêz³a zarodkowego [44, 54, 61] (tab. 2). Komórki te mo na by³o izolowaæ i bli ej zbadaæ in vitro. Nazwano je komórkami macierzystymi (ang. stem cells). Na komórkach macierzystych hemopoetycznych (HSC) w szpiku kostnym u doros³ych oraz u rozwijaj¹cych siê zarodków jest powierzchniowe bia³ko-marker CD34 [15]. Krew obwodowa zawiera nieliczne komórki HSC, ale w krwi pêpowinowej jest wiele komórek macierzystych uwalnianych tam ze szpiku kostnego podczas stresu porodowego. Komórki te mog¹ byæ izolowane z ³o yska oraz ze sznura pêpowinowego, czyli z tkanek odrzucanych po porodzie. Tak otrzymane komórki macierzyste krwi pêpowinowej mog¹ byæ wykorzystane u dzieci do odtworzenia uk³adu hemopoetycznego, podawane choremu po wykrwawieniu w wyniku wypadku czy podczas operacji chirurgicznych [4]. Komórki te s¹ równie podawane wraz z mas¹ leukocytarn¹ chorym po intensywnej terapii lekami przeciwnowotworowymi, gdy s¹ równie uszkadzane leukocyty, erytrocyty i p³ytki krwi. Komórki macierzyste

KOMÓRKI MACIERZYSTE W BIOLOGII I MEDYCYNIE 11 TABELA 1. Definicje terminów z zakresu komórek macierzystych (wg [19] zmienione) TABLE 1. Definitions of terms used in stem cell description (according to [19],modified) Nazwa (termin) Definicj a Przyk³ad y Komórka macierzysta komórka d³ugo yj¹ca, zdolna do VSELs samoodnowy, proliferacji i wielokierunkowego ró nicowania Komórka macierzysta tkankowa komórka d³ugo yj¹ca, zdolna do samoodnowy, proliferacji komórka macierzysta hemopoetyczna i wielokierunkowego ró nicowania w obrêbie okreœlonej tkanki Komórka progenitorowa komórka zdolna do podzia³ów, która mo e daæ co najmniej jedno pokolenie komórka p³ucna neuroendokrynna Komórka macierzysta nowotworowa komórka nowotworowa o zwiêkszonym potencjale regeneracyjnym oraz oporna na toksyny, odnawiaj¹ca wzrost nowotworu ostra bia³aczka mieloidalna (AML) pochodz¹ce ze szpiku kostnego, krwi pêpowinowej i ró nych narz¹dów myszy oraz cz³owieka opisano szczegó³owo podaj¹c ich cechy morfologiczne, jak i obecnoœæ w nich bia³ek markerowych [32,33,49,67]. Komórki te s¹ bardzo ma³e, u myszy o œrednicy 3 5 mm i maj¹ markery komórek embrionalnych, st¹d nadano im nazwê ma³ych komórek macierzystych o cechach embrionalnych VSELs (Very Small Embryonic-Like). Komórki VESLs znajdowano w ró nych tkankach organizmu doros³ego i okreœlono ich liczbê zmniejszaj¹c¹ siê z wiekiem organizmu [68]. Wysuniêto hipotezê, e komórki te s¹ zachowywane po okresie ycia zarodkowego w szpiku kostnym jako mobilna populacja prekursorowych komórek kr¹ ¹cych. Odgrywa³yby one wa n¹ rolê w postnatalnej wymianie komórek hemopoetycznych, jak i niehemopoetycznych. Komórki macierzyste œródb³onka w szpiku kostnym oraz w tkankach równie maj¹ ekspresjê CD34. Subpopulacja ta mo e in vitro, w obecnoœci kilku czynników: zasadowego FGF bfgf (basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1) oraz VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), ró nicowaæ siê w komórki œródb³onka. Te komórki mo na odró niæ, bo obok antygenu CD34, zawieraj¹ czynnik von Willebranda (vwf) i w³¹czaj¹ lipoproteidy o ma³ej gêstoœci LDL (Low Density Lipoprotein). Aby rozstrzygn¹æ, czy komórki prekursorowe œródb³onkowe s¹ stale obecne w kr¹ eniu i pochodz¹ ze szpiku kostnego in vivo, wykorzystano przeszczepy szpiku u ró ni¹cych siê genetycznie psów [55]. Analizowano TABELA 2. Markery znajdowane w komórkach macierzystych szpiku kostnego cz³owieka, a obecne równie w komórkach macierzystych embrionalnych ([49], zmienione) TABLE 2. Stem cell markers of human bone marrow cells, present on embryonal stem cells ([49], modified) Komórki Markery Komórki progenitorowe œródb³onka naczyñ CD133, CD34, CD31, CD117=c-kit Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) CD15, CD133, CD9 Very small embryonic-like stem cells (VSELs) CD133, CD34, Oct3/4, SSEA-4

12 J. KAWIAK DNA komórek tworz¹cych nowe naczynia krwionoœne z prekursorowych komórek CD34+ szpiku kostnego implantowane od innego psa. Okaza³o siê, e komórki œródb³onka naczyñ pochodzi³y z komórek kr¹ ¹cych we krwi biorcy. Ju w roku 1971 [29] wykazano, e komórki œródb³onka têtnic wieñcowych cz³owieka po przeszczepieniu serca pochodz¹ od biorcy, a nie od dawcy. Mo na wiêc wnosiæ, e po obumarciu komórek œródb³onka serca dawcy s¹ one zastêpowane kr¹ ¹cymi komórkami prekursorowymi biorcy. Komórki macierzyste neuralne s¹ potencjalnym Ÿród³em komórek w leczeniu schorzeñ neurodegeneracyjnych. Hoduj¹c komórki pobrane biopsyjnie ze skóry albo z tkanki t³uszczowej otrzymano in vitro w obecnoœci czynników FGF2 (Fibroblast Growth Factor2) oraz EGF (Epithelial Growth Factor) prekursory neuronów nestyno (+) [62]. Nestyna jest markerem komórek neuronalnych. Inni autorzy [26] opisali otrzymanie komórek nestyno (+) z biopsyjnie pobranej skóry osoby doros³ej po hodowli in vitro w odpowiednio dobranych warunkach. Porównano te ró ne Ÿród³a komórek macierzystych mezenchymatycznych MSC (Mesenchymal Stem Cells) [13] dla otrzymania materia³u osteogennego celem odtwarzania koœci. MSC z tkanki t³uszczowej okaza³y siê ma³o przydatne do otrzymania in vivo tkanki osteogennej, natomiast dobre by³y do tego celu MSC pochodz¹ce ze szpiku kostnego albo z okostnej [21]. Markerami ró nicowania osteogennego by³y w tych doœwiadczeniach alkaliczna fosfataza oraz osteokalcyna. W innych doœwiadczeniach in vitro porównywano zdolnoœæ ró nicowania do komórek w¹troby MSC ze szpiku kostnego i tkanki t³uszczowej [59]. Obserwowano podobny potencja³ do ró nicowania komórek z obu tkanek, co mo e zachêcaæ do dalszych prób wykorzystania autologicznych komórek tkanki t³uszczowej do wspomagania funkcji w¹troby. Jednak wed³ug ostatnio opublikowanej pracy [13] komórki MSC szpiku kostnego cz³owieka nie mog¹ ró nicowaæ siê do hepatocytów, ale mog¹ do osteoblastów, chondrocytów, adipocytów oraz miêœni g³adkich naczyniowych. Fizjologiczne w³aœciwoœci komórek macierzystych opisywane przez wielu autorów s¹ podobne. Opis taki pozwala t³umaczyæ zachowania tych komórek w prawid³owych tkankach organizmu doros³ego, jak równie w tkankach zmienionych chorobowo. Podstawowymi w³aœciwoœciami komórek macierzystych s¹: a) zdolnoœæ do odtwarzania siê, czyli z komórki macierzystej mo e powstawaæ nowa komórka macierzysta, jednak czêstoœæ podzia³ów tych komórek jest niedu a, b) zdolnoœæ do ró nicowania w komórki tkanek/narz¹dów, a w trakcie tego procesu komórki przechodz¹ wiele podzia³ów daj¹c wiele komórek zró nicowanych, c) opornoœæ na czynniki szkodliwe, takie jak toksyny i promieniowanie. Ta ostatnia w³aœciwoœæ chroni komórki macierzyste i pozwala im prze yæ nawet w warunkach, gdy inne komórki obumieraj¹. Opornoœæ komórek na toksyny t³umaczy siê ich zdolnoœci¹ do wyrzucania toksyn z cytoplazmy, co mo na oceniaæ metodami cytometrycznymi. Komórki macierzyste wyrzucaj¹ np. z cytoplazmy jeden z barwników fluorescencyjnych barwnik Hoechsta 33342 i ³atwo mo na je wtedy odró niæ od pozosta³ych komórek, poniewa na wykresach cytometrycznych oddzielaj¹ siê do boku od g³ównej masy komórek, st¹d nazywa siê je populacj¹ boczn¹ SP (ang. side population) komórek [15,23]. Molekularn¹ determinant¹ zachowania siê tej populacji komórek jest uk³ad transporterów ABC [58].

KOMÓRKI MACIERZYSTE W BIOLOGII I MEDYCYNIE 13 UK ADY CHEMOKINOWE I NISZE KOMÓREK MACIERZYSTYCH Komórki macierzyste organizmu przebywaj¹ w okreœlonych miejscach nazywanych niszami tkankowymi albo narz¹dowymi. Komórki te s¹ utrzymywane w niszach uk³adami chemokinowymi. Jednym z nich jest uk³ad liganda SDF-1 (Stromal Derived Factor-1) i receptora na komórkach macierzystych CXCR4. Receptor nie jest równomiernie rozmieszczony na powierzchni komórek, ale jest w³¹czany do lipidowych tratw (ang. rafts) w b³onach komórkowych [65]. SDF-1 jest produkowany przez komórki zrêbu np. szpiku kostnego i moduluje adhezjê do fibronektyny. Komórki, nieprzyczepione na sta³e do pod³o a i maj¹ce odpowiedni receptor, s¹ zatrzymywane w miejscach, gdzie gromadzi siê SDF-1. Przyjmuje siê, e dziêki temu uk³adowi komórki macierzyste hemopoetyczne oraz inne komórki maj¹ce receptor CXCR4 s¹ utrzymywane w niszy szpiku kostnego [64]. W tej niszy uk³ad zapewnia sygnalizacjê miêdzykomórkow¹ przez zmiany stê enia liganda oraz ekspresji receptora CXCR4. Uk³ad warunkuje te uwalnianie komórek pod wp³ywem czynników regulatorowych, takich jak G-CSF, oraz toksyn, np. cyklofosfamidu, czy czynników stresu organizmu, jak podczas porodu czy zawa³u miêœnia sercowego [63]. Wtedy komórki macierzyste s¹ uwalniane z niszy i przenikaj¹ do krwi obwodowej, by t¹ drog¹ dotrzeæ do miejsc zagro onych wymagaj¹cych naprawy. W warunkach doœwiadczalnych zablokowanie uk³adu SDF-1/CXCR4 przez podanie inhibitora AMD31 hamuje oddzia³ywanie miêdzy ligandem a receptorem, co prowadzi do wyrzucania ze szpiku HSC [13,22]. Innym uk³adem chemokinowym dzia³aj¹cym w niszach komórek macierzystych i wa nym dla utrzymania komórek jest uk³ad Wnt [37,5]. Rodziny glikoproteidów Wnt s¹ wydzielane i przekazuj¹ sygna³y w wielu procesach biologicznych podczas embrio-genezy i organogenezy [48]. Bia³ka te s¹ ligandami, a ich receptorami w b³onie komórek docelowych s¹ kompleksy bia³ka G Frizzled zwi¹zanego z LRP (Low density lipoprotein Receptor-related Protein). Bia³ka receptorowe Frizzled s¹ zakotwiczone siedmioma odcinkami w b³onie komórkowej. LRP kompleksów receptorowych jest rodzin¹ bia³ek licz¹c¹ u cz³owieka oko³o 2 ró nych cz¹steczek. Sygnalizacja uk³adem Wnt jest konserwowana i kluczowa w kontroli oddzia³ywañ miêdzykomórkowych podczas embriogenezy [8], jak i w organizmie doros³ym [9]. Ten uk³ad w tkankach doros³ych zapewnia sygnalizacjê reguluj¹c¹ przemieszczanie siê komórek wzd³u nab³onka, co mo e nas tutaj interesowaæ ze wzglêdu na regulacjê nisz komórkowych. Warto przypomnieæ istnienie ró nych nisz komórek macierzystych. Hemopoetyczne komórki macierzyste (HSC) w niszy szpikowej mo na cytochemicznie wyró niæ tym, e na powierzchni komórki te maj¹ bia³ko CD34 oraz receptory CXCR4, ale nie maj¹ ekspresji CD38 [15]. Pewna liczba HSC stale kr¹ y i we krwi obwodowej stanowi ok.,1% leukocytów. Liczba kr¹ ¹cych HSC zwiêksza siê wielokrotnie pod wp³ywem czynników toksycznych, jakimi s¹ niektóre leki przeciwnowotworowe. Takie uwalnianie z niszy szpikowej HSC jest obecnie standardow¹ technik¹ stosowan¹ w transplantologii, gdy zamiast nak³uwania koœci celem otrzymania szpiku

14 J. KAWIAK kostnego z zawartymi w nim HSC dla dokonania przeszczepu [35] podaje siê dawcy cyklofosfamid albo G-CSF b¹dÿ oba te czynniki ³¹cznie. Wtedy komórki macierzyste wyrzucane s¹ ze szpiku kostnego i mo na pobieraæ je z krwi obwodowej oraz podawaæ choremu w odpowiedniej dawce zale nej od masy cia³a [4]. Komórki macierzyste jelita cienkiego s¹ zlokalizowane na dnie krypt. Jest ich 4 6 w ka dej krypcie i mo na je odró niæ po ekspresji genu Lgr5 metod¹ hybrydyzacji in situ [5]. Niektóre komórki macierzyste dna krypty rozpoczynaj¹ ró nicowanie czêstymi podzia³ami i wtedy przesuwaj¹ siê wy ej w krypcie, a to wi¹ e siê z ich dalszym ró nicowaniem. Populacjê czêsto dziel¹cych siê komórek mo na odró niæ markerami proliferacji (Ki67, BdrU), ale te ekspresj¹ genu Wdr43. Przesuwaj¹c siê do ujœcia krypty, a potem na kosmki jelitowe, komórki te ró nicuj¹ siê w 3 typy: enterocyty, komórki kubkowe oraz komórki enteroendokrynowe. W dnie krypt pozostaje czwarty typ zró nicowanych komórek, komórki Panetha, które odró nia siê morfologicznie oraz ekspresj¹ genu Defa 1. Podobnie zachowuj¹ siê komórki macierzyste jelita grubego maj¹ce niszê w dnie krypt [12,43,51]. Te komórki równie odró nia siê ekspresj¹ genu Lgr5 [5]. Komórki dna krypt rzadko dziel¹ siê, ale podobnie ró nicowanie rozpoczynaj¹ od czêstych podzia³ów. Ró nicuj¹ siê w enterocyty oraz komórki kubkowe, a u ujœcia krypty przestaj¹ siê dzieliæ i przesuwaj¹ na powierzchniê nab³onka, gdzie podlegaj¹ apoptozie i z³uszczeniu. Komórki macierzyste naskórka maj¹ nisze w torebce w³osowej mniej wiêcej w po³owie wysokoœci torebki i mo na je odró niæ markerem CD2. Stanowi¹ tam wiêksze nagromadzenie komórek nazywane wypukleniem (ang. bulge) [6,45]. St¹d komórki ró nicuj¹ce siê, po podzia³ach przesuwaj¹ siê do gruczo³u ³ojowego oraz na powierzchniê skóry tworz¹c naskórek. Inne komórki macierzyste przemieszczaj¹ siê w kierunku przeciwnym, do cebulki w³osa sk¹d wyrasta ga³¹ÿ w³osa. Wypuklenie jest miejscem uprzywilejowanym immunologicznie [41]. Komórki tam le ¹ce maj¹ nisk¹ ekspresjê MHC kl I i II oraz b2-mikroglobuliny, a wysok¹ czynników immunosupresorowych, takich jak TGFb2, czynnika hamuj¹cego migracjê makrofagów. POCHODZENIE TKANKOWYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH I MO LIWOŒCI REPROGRAMOWANIA KOMÓREK ZRÓ NICOWANYCH Pochodzenie komórek macierzystych znajduj¹cych siê w organizmie doros³ym nie jest oczywiste. Za jeden z podstawowych dowodów na ich obecnoœæ w tkankach/narz¹dach organizmu uwa a siê znajdowanie w tych komórkach bia³ek markerowych, które s¹ równie obecne w komórkach wêz³a zarodkowego we wczesnym okresie ycia [44,54,61]. Komórki takie mog¹ wiêc byæ pozosta³oœci¹ komórek zarodkowych, które s¹ i dziel¹ siê u doros³ego. Komórki macierzyste w tkankach mog¹ mieæ ró ny potencja³ rozwojowy, przewa nie s¹ multipotencjalne.

KOMÓRKI MACIERZYSTE W BIOLOGII I MEDYCYNIE 15 Potencja³ rozwojowy komórek embrionalnych podczas prawid³owego rozwoju zarodka zmniejsza siê. Jak o tym wspomniano, w organizmie doros³ym i w b³onach p³odowych s¹ obecne komórki o charakterze multipotencjalnym, tkankowe komórki macierzyste (tab. 1). Komórki te o mniejszym potencjale rozwojowym, ale o cechach komórek embrionalnych, równie w yciu doros³ym maj¹ TABELA 3. Reaktywacja markerów pluripotencjalnoœci podczas reprogramowania fibroblastów mysich in vitro (wg opisu Brambrink et al. [7]) TABLE 3. Reactivation of pluripotential markers in reprogrammed mice fibroblasts in vitro (according description Brambrink et al. [7]) Dzieñ Alkal.fosfataza SSEA1 Nanog Oct4 od indukcji % komórek (+) 3 9 12 16 26 35 ekspresjê bia³ek markerowych obecnych w komórkach wêz³a zarodkowego [44,61]. Takimi markerami komórkowymi s¹: alkaliczna fosfataza, SSEA-1, Oct4, Nanog. Zaobserwowano równie ubywanie liczby komórek macierzystych tkankowych z wiekiem organizmu u ssaków [67], co mo e œwiadczyæ o wyczerpywaniu siê zapasu komórek macierzystych z wiekiem osobniczym. Ostatnio s¹ czynione próby otrzymania komórek pluripotencjalnych z komórek somatycznych jako wynik reprogramowania [1,4,56]. Molekularne mechanizmy tego procesu nie s¹ dok³adnie poznane. Próbowano transdukcji mysich i ludzkich komórek somatycznych czterema czynnikami transkrypcyjnymi dla stopniowego przekszta³cenia ma³ej subpopulacji w komórki pluripotencjalne, podobne do komórek macierzystych embrionalnych [38]. Badania by³y prowadzone na ró nych komórkach somatycznych, miêdzy innymi na mysich fibroblastach transfekowanych in vitro wektorem przenosz¹cym cdna genów Oct4, Sox2, c-myc oraz Klf4 [4]. Komórki reprogramowane okreœlono nazw¹ komórek ips (ang. induced Pluripotent Stem cells). S¹ one zdolne do ró nicowania siê w komórki trzech listków zarodkowych, równie w komórki rozrodcze myszy chimerycznej [46]. Analizy metylacji DNA oraz modyfikacji histonów dowodz¹, e chromatyna mysich komórek ips zosta³a reprogramowana do stanu zarodkowego. Dotyczy³o to demetylacji endogennych promotorów kontroluj¹cych specyficzne geny Nanog oraz Oct4. Zbadano te kolejnoœæ aktywacji podstawowych czterech czynników wczeœniej uznanych jako niezbêdne do reprogramowania mysich fibroblastów (tab. 3) [7]. Zaobserwowano, e ekspresja SSEA1 po ekspresji alkalicznej fosfatazy jest stanem poœrednim, który musi byæ podtrzymany, aby by³a mo liwa póÿniejsza ekspresja genów Oct4 oraz Nanog. Aktywacja endogennych Oct4 oraz Nanog mo e byæ markerem pe³nego reprogramowania komórki ips, ju niezale nego od dodatkowych aktywnych genów. Stwierdzono równie, e niektóre komórki macierzyste w tkankach maj¹ ekspresjê kilku kluczowych dla reprogramowania czynników transkrypcyjnych. Komórki progenitorowe neuralne mog¹ wtedy byæ reprogramowane dwoma czynnikami (Oct4 i Klf4) [3], a nawet jednym (Oct4). Uk³ady reprogramowania opracowano dla bardzo ró nych komórek somatycznych: limfocytów B [2], komórek skóry [26], dla ludzkich keratynocytów [1]. Ustalono te, e równoczesne zahamowanie kinazy bia³kowej aktywowanej mitogenami MAKP 3 4 28 38 38 82 76 4 9 9 11 16,2 2 3,2 2 3

16 J. KAWIAK (Mitogen-Activated Protein Kinase) i kinazy-3 syntazy glikogenu GSK3 (Glycogen Synthase Kinase-3) oraz odnowienie ekspresji LIF (Leukemia Inhibitory Factor) kieruje pre-pluripotencjalne komórki do stanu pe³nej pluripotencji [56]. KOMÓRKI MACIERZYSTE NOWOTWOROWE Postêpy terapii nowotworów znacznie przed³u y³y ycie wielu chorym. Jednak z praktyki lekarskiej wiadomo, e po korzystnym wyniku terapii pocz¹tkowej czêsto dochodzi do wznowy nowotworu, a w przypadku guzów litych do przerzutów nowotworowych. Jest coraz wiêcej dowodów na to, e wzrost i rozprzestrzenianie siê wielu nowotworów zale y od ma³ej subpopulacji komórek w nowotworze, nazywanej komórkami macierzystymi nowotworowymi [24,27]. Zgodnie z tym pogl¹dem, nowotwór nie jest tylko wzrostem monoklonalnych komórek transformowanych, ale z³o on¹ tkank¹, gdzie nieprawid³owy wzrost jest napêdzany przez nieliczne, patologicznie zmienione komórki macierzyste o takich cechach, jak niekontrolowany wzrost i zdolnoœæ do tworzenia przerzutów, ale te zachowuj¹cych zdolnoœæ do w³asnej odnowy i ró nicowania w fenotypowo ró ne potomstwo. Wspieraj¹ ten pogl¹d obserwacje eksperymentalne, pocz¹tkowo przeprowadzone na komórkach ludzkiej ostrej bia³aczki szpikowej AML (Acute Myeloidal Leukemia). W 1994 r. Lapidot wsp. [34] udokumentowali obecnoœæ bia³aczkowych komórek macierzystych w ostrej bia³aczce szpikowej klonowaniem tych komórek oraz obserwacj¹ ich zdolnoœci do samoodnowy. Wysortowane i oddzielone komórki subpopulacji CD34+CD38 ostrej bia³aczki pobrane od chorego i wszczepione myszy SCID inicjowa³y bia³aczkê, podczas gdy nie mia³y tej w³aœciwoœci komórki CD34+CD38+ ani komórki CD34. Myszy SCID maj¹ niedobory immunologiczne, niesprawny uk³ad odpornoœciowy i dlatego nie odrzucaj¹ ksenoprzeszczepów komórek cz³owieka. Komórki bia³aczki rozwijaj¹cej siê u myszy mo na by³o przeszczepiaæ do nastêpnych myszy, co sugeruje, e komórki implantowane pierwotnie maj¹ zdolnoœæ do samoodnowy. Takie obserwacje komórek nowotworowych, jak zdolnoœæ do samoodnowy oraz do ponownego wzrostu po przeniesieniu pojedynczych komórek nowotworowych do nowej myszy, przyjmuje siê za podstawowe kryterium nowotworowej komórki macierzystej. Podobne komórki macierzyste nowotworowe identyfikowano nie tylko w AML, ale równie w guzach litych [3,14,18,19,47,51,57]. Równie w liniach komórek nowotworowych obserwowano obecnoœæ komórek macierzystych nowotworowych [28,31]. Koncepcja istnienia komórek macierzystych nowotworowych mo e mieæ du e znaczenie dla terapii maj¹cej na celu ca³kowite usuniêcie nowotworu u chorego. Trudno jest ustaliæ, jak mo e dochodziæ do powstania komórek macierzystych nowotworowych. Ocenia siê, e czêstoœæ mutacji spontanicznych jest 1 6 do 1 7 mutacji na gen na podzia³ komórki [2]. U cz³owieka podczas ca³ego jego ycia zachodzi oko³o 1 16 podzia³ów komórek, st¹d mo na wyliczyæ, e ka dy gen cz³owieka ma szansê ulec mutacji wiêcej ni 1 9 razy. Mutacje te s¹ najczêœciej

KOMÓRKI MACIERZYSTE W BIOLOGII I MEDYCYNIE 17 sprawnie reperowane w komórce b¹dÿ komórki ze zmutowanymi genami s¹ usuwane przez uk³ad odpornoœciowy. Mo e siê zdarzyæ, e w komórce macierzystej pojawi¹ siê mutacje onkogenne podobnie jak w genomie komórek zró nicowanych. Czêsto trzy takie kolejne mutacje onkogenne w komórce decyduj¹ o jej charakterze nowotworowym. Zwykle dla okreœlenia takich komórek bierze siê pod uwagê kilka ich cech: a) zdolnoœæ do odtwarzania siê co jednak nie oznacza, e komórki dziel¹ siê czêsto; skutkiem jest mo liwoœæ kumulowania w tej samej komórce mutacji prowadz¹cych do pozyskania cech komórki nowotworowej. b) zdolnoœæ do ró nicowania siê w komórki tkanek czy narz¹dów; nowotwór pierwotny mo e byæ zbudowany z komórek zró nicowanych, a komórki macierzyste zwykle stanowi¹ tylko ma³y procent wszystkich komórek nowotworowych. Inaczej jednak mo e byæ w przypadku eksperymentalnych nowotworowych linii komórkowych, gdzie wiêkszoœæ komórek mo e mieæ cechy macierzystych dziêki selekcji, jak ma to np. miejsce w przypadku mysich komórek bia³aczki L121 [28]. c) opornoœæ na czynniki szkodliwe gdy komórki macierzyste nowotworowe maj¹ wysok¹ ekspresjê transporterów rodziny ABC (ATP Binding Casette) [39,58]. Te cechy komórek macierzystych nowotworowych s¹ podobne do tych w komórkach macierzystych nienowotworowych. Tutaj jednak warto podkreœliæ jeszcze inne cechy komórek macierzystych nowotworowych: ekspresjê antygenów charakteryzuj¹cych komórki macierzyste embrionalne, takich jak: Oct3/4, SSEA1, CD133, CD9, zdolnoœæ do reperacji DNA [42], obni on¹ zdolnoœæ do inicjowania apoptozy. Wœród komórek izolowanych z nowotworów pierwotnych, jak i wœród komórek linii nowotworowych odkryto wspomniane ju komórki SP (side population), populacje komórek wyrzucaj¹ce z cytoplazmy barwnik Hoechsta. Zak³ada siê, e podobnie jak barwnik, komórki tej SP mog¹ pozbywaæ siê leków stosowanych w terapii [15, 23]. Komórki SP wysortowane okaza³y siê rzeczywiœcie komórkami podtrzymuj¹cymi wzrost nowotworu po implantacji do myszy. Wykryto te, e komórki SP maj¹ wysok¹ ekspresjê b³onowych bia³ek transportuj¹cych rodziny ABC, a wœród nich równie transporter opornoœci wielolekowej MDR-1 (MultiDrug Resistance transporter-1) [11] oraz BCRP-1 (Breast Cancer Resistance Protein- 1), chocia nie znajdowano korelacji miêdzy liczb¹ komórek SP+ i MDR-1+ u pacjentów z AML. Artyku³y przegl¹dowe oraz prace eksperymentalne na temat prób terapii kierowanej na komórki macierzyste nowotworowe publikowali ró ni autorzy [11,43,52,6,66]. Ten kierunek terapii wydaje siê obecnie najbardziej racjonalny. LITERATURA [1] AASEN T, RAYA A, BARRARO MJ et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnol 28; 26: 1276 1284. [2] ALBERTS B, BRAY D, HOPKIN K et al. Podstawy biologii komórki (t³um. polskie) 25 PWN Warszawa: 728 729.

18J. KAWIAK [3] AL-HAJJ M, CLARKE MF. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene 24; 23: 7274 7282. [4] ALLAN DS, KEENEY M, HOWSON-JAN K et al. Number of viable CD34(+) cells reinfused predicts engrafment in autologous hemopoietic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant 22; 29: 967 972. [5] BARKER N, van ES JH, KUIPERS J et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature 27; 449: 13 17. [6]BLAUPLAIN C, LOWRY WE, GEOGHEGAN A et al. Self-renewal, multipotency and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell nishe. Cell 24;118: 635 648. [7] BRAMBRINK T, FOREMAN R, WELSTEAD GG et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell 28; 2: 151 159. [8] CADIGAN KM, NUSSE R. Wnt signaling: a common theme in animal development. Genes Dev 1997; 11: 3286 335. [9] CHENG JH, SHE H, HAN Y-P et al. Wnt antagonism inhibits hepatic stellate cell activation and liver fibrosis. Am J Physiol Gastrointest 28; 294; G39 G49. [1] CIEMERYCH MA. Zarodkowe komórki macierzyste w poszukiwaniu pluripotencji. Post Biol Kom 28; 35: 183 25. [11] COLLINS AT, BERRY PA, HYDE C et al. Prospective identification of tumorogenic prostate cancer stem cells. Cancer Res 25; 65: 1946 1951. [12] DALERBA P, DYLLA SJ, PARK IK et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 27; 14: 1158 1163. [13] DELORME B, RINGE J, PONTIKOGLOU C et al. Specific lineage-priming of bone marrow mesenchymal stem cells provides the molecular framework for their plasticity. Stem Cells 29; 27: 1142 1151. [14] FANG D, NGUYEN TK, LEISHEAR K et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res 25; 65: 9328 9337. [15] FEURING-BUSKE M [1], HOGGE DE. Hoechst 33342 efflux identifies a subpopulation of cytogenetically normal CD34+CD38 progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia. Blood 21; 97: 3882 3889. [16] FLOMENBERG N, DEVINE SM, DIPERSIO JF et al. The use of AMD31 plus G-CSF for autologous hemopoietic progenitor cell mobilization is superior to G-CSF alone. Blood 25; 16: 1867 1874. [17] FURNE JK, SPRINGFIELD JR, HO SB, LEVITT MD. Simplification of the end-alveolar carbon monoxide technique to asses erythrocyte survival. J Lab Clin Med 23; 142: 52 57. [18] GIBBS CP, KUKEKOV VG, REITH JD et al. Stem-like cells in bone sarcomas: implications for tumorigenesis. Neoplasia 25; 7: 967 976. [19] GLANGRECO A, GROOT KR, JANES SM. Lung cancer and lung stem cells. Strange bedfellows? Am J Respir Crit Care Med 27; 175: 547 553. [2] HANNA J, MARKONLAKI S, SCHOERDRET P et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell 28; 133: 25 261. [21] HAYASHI O, KATSUBE Y, HIROSE M et al. Comparison of osteogenic ability of rat mesenchymal stem cells from bone marrow, periosteum and adipose tissue. Calcif Tissue Int 28; 82: 238 247. [22] HESS DA, BONDE J, CRAFT TC et al. Human progenitor cells rapidly mobilized by AMD31 repopulate NOD/SCID mice with increased frequency in comparison to cells from the same donor mobilized by G-CSF. Biol Blood Marrow Transpl 27; 13: 398 411. [23] HIRSCHMANN-JAX C, FOSTER AE, WULF GG et al. A distinct side population of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA 24; 11: 14228 14233. [24] HOPE KJ, JIN L, DICK JE. Acute myeloid leukemia originates from a hierarchy of leukemic stem cell clases that differ in self-renewal capacity. Nature Immunol 24; 5: 738 743. [25] JEDRZEJCZAK WW. Komórki macierzyste krwiotworzenia. W: Ultrastruktura i funkcja komórki. Kawiak J, Osuchowska Z, Prze³êcka A (red.), t.3, PWN, Warszawa: 1989: 31 75. [26] JOANNIDES A, GAUGHWIN P, SCHWIENING C et al. Efficient generation of neural precursors from adult human skin: astrocytes promote neurogenesis from skin-derived stem cells. Lancet 24; 364: 172 178. [27] JORDAN CT, GUZMAN ML, NOBLE M. Cancer stem cells. N Engl J Med 26; 355: 1253 1261. [28] KAWALEC M, SKORSKI T, KAWIAK J. Successful chemoimmunotherapy of Marine L121 lymphatic leukemia with cyclophosphamide and mafosfamide-treated leukemia cells. Invest New Drugs 1988; 6: 169 172.

KOMÓRKI MACIERZYSTE W BIOLOGII I MEDYCYNIE 19 [29] KENNEDY LJ, Jr, WEISSMAN IL. Dual origin of intimal cells in cardiac-allograft arteriosclerosis. New Engl J Med 1971; 285: 884 887. [3] KIM JB, ZAEHRES H, WU G et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature 28; 454: 646 65. [31] KONDO T, SETOGUCHI T, TAGA T. Persistence of small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line. Proc Natl Acad Sci USA 24; 11: 781 786. [32] KUCIA M, HALASA M, WYSOCZYNSKI M et al. Morphological and molecular characterization of novel population of CXCR4(+)SSEA-4(+)Oct-4(+) very small embryonic-like cells purified from human cord blood preliminary report. Leukemia 27; 21: 297 33. [33] KUCIA M, RECA R, CAMPBELL FR et al. A population of very small embryonic-like (VSEL) CXCR4(+)SEA-1(+)Oct-4(+) stem cells identified in adult bone marrow. Leukemia 26; 2: 857 869. [34] LAPIDOT T, SIRARD C, VORMOOR J et al. A cell initiating human acute myeloid leukemia after transplantation into SCID mice. Nature 1994; 367: 645 648. [35] LEVESQUE JP, HENDY J, TAKARNATSU Y et al. Disruption of the CXCR4/CXCL12 chemotactic interaction during hematopoietic stem cell mobilization induced by G-CSF or cyclofosfamide. J Clin Invest 23; 111: 187 196. [36] LILES WC, RODGER E, BROXMEYER HE et al. Augumented mobilization and collection of CD34+ hemopoietic cells from normal human volunteers stimulated with G-CSF by single-dose administration of AMD31, a CXCR4 antagonist. Transfusion 25; 45: 295 3. [37] LOGAN CY, NUSSE R. The Wnt signaling pathway in development and disease. Ann Rev Cell Dev Biol 24; 2: 781 81. [38] LOH YH, AGRAVAL S, PARK IH et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood 29; 113: 5476 5479. [39] LOU H, DEAN M. Targeted therapy for cancer stem cells: the patched pathway and ABC transporters. Oncogene 27; 26: 1357 136. [4] MEISSNER A, WERING M, JAENISCH R. Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts into pluripotent stem cells. Nature Biotechnol 27; 25: 1177 1181. [41] MEYER KC, KLATTE JE, DINH HV et al. Evidence that the bulge region is a site of relative immune privilege in human hair follicles. Br J Dermatol 28; 159: 177 185. [42] NOWACKA-ZAWISZA M, KRAJEWSKA WM. Rola bia³ek BCRA1, BCRA2 i RAD51 w zachowaniu stabilnoœci genomu. Post Biol Kom 29; 36: 679 694. [43] O'BRIEN CA, POLLET A, GALLINGER S, DICK JE. A human colon cancer cell capable of initiating tumor growth in immunodeficient mice. Nature 27; 445: 16 11. [44] O'CONNOR MD, KARDEL MD, IOSFINA I et al. Alkaline phosphatase-positive colony formation is a sensitive, specific, and quantitative indicator of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem Cells 28; 26: 119 1116. [45] OHYAMA M. Advances in the study of stem cell-enriched hair follicle bulge cells: a review featuring characterization and isolation of human bulge cells. Dermatology 27; 214: 342 351. [46] OKITA K, ICHISAKA T, YAMANAKA S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 27; 448: 313 317. [47] PATRAWALA L, CALHOUN T, SCHNEIDER-BROUSSARD R et al. Highly purified CD44 prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene 26; 25: 1696 178. [48] PATTHEY C, EDLUND T, GUNHAGA L. Wnt-regulated temporal control of BMP exposure directs the choice between neural plate border and epidermal fate. Development 29; 136: 73 83. [49] RATAJCZAK MZ, ZUBA-SURMA EK, MACHALINSKI B et al. Very small embryonic-like (VSEL) stem cells: purification from adult organs, characterization and biological significance. Stem Cell Rev 28; 4: 89 99. [5] REYA T, CLEVERS H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature 25; 434: 843 85. [51] RICCI-VITIANI L, LOMBARDI DG, PILOZZI E et al. Identification and expression of human coloncancer-initiating cells. Nature 27; 445: 111 115. [52] ROBEY RW, STEADMAN K, POLGAR O et al. Pheophorbide a is a specific probe for ABCG2 function and inhibition. Cancer Res 24; 64: 1242 1246. [53] ROBEY RW, TO KK, POLGAR O et al. ABCG2: a perspective. Adv Drug Deliv Rev 29; 61: 3 13. [54] ROSSANT J. Stem cells and early lineage development. Cell 28; 132: 527 531.

11 J. KAWIAK [55] SHI Q, RAFII S, HONG-DEWU M et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood 1998; 92: 362 367. [56] SILVA J, BARRANDON O, NICHOLS J et al. Promotion of reprogramming to ground state pluripotency by signal inhibition. PLoS Biol 28; 6: e253. [57] SINGH SK, HAWKINS C, CLARKE ID et al. Identification of human brain tumor initiating cells. Nature 24; 432: 396 41 [58] SWERTS K, DEMOLERLOOSE B, DHOOGE C et al. Prognostic significance of multidrug resistancerelated proteins in childhood acute lymphoblastic leukemia. Eur J Cancer 26; 42: 295 39. [59] TALENS-VISCONTI R, BONORA A, JOVER R et al. Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal cells. World J Gastroenterol 26; 12: 5834 5845. [6] TANG C, ANG BT, PERVAIZ S. Cancer stem cell: target for anti-cancer therapy. FASEB J 27; 21: 3777 3785. [61] THOMSON JA, ITZKOVITZ-ELDOR J, SHAPIRO SS et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: 1145 1147. [62] VINDIGNI V, MICHELOTTO L, LANCEROTTO L et al. Isolation method for a stem cell population with neural potential from skin and adipose tissue. Neurol Res 29; publ ahad PMID1524673 [63] WOJAKOWSKI W, TENDERA M, MICHALOWSKA A et al. Mobilization of CD34/CXCR4+, CD34/ CD117+, c-met+ stem cells and mononuclear cells expressing early cardiac muscle and endothelial markers into peripheral blood in patients with acute myocardial infarction. Circulation 24; 11: 3213 322. [64] WRIGHT DE, WAGERS AJ, GULATI AP et al. Physiological migration of hemopoietic stem and progenitor cells. Science 21; 294: 1933 1936. [65] WYSOCZYNSKI M, RECA R, RATAJCZAK J et al. Incorporation of CXCR4 into membrane lipid rafts primes doming-related responses of hematopoietic stem/progenitor cells to an SDF-1 gradient. Blood 25; 15: 4 48. [66] YILMAZ OH, VALDEZ R, THEISEN BK et al. Pten dependence distinguishes hemopoietic stem cells from leukemia-initiating cells. Nature 26; 441: 475 482 [67] ZUBA-SURMA EK, KUCIA M, ABDEL-LATIF A et al. Morphological characterization of very small embryonic-like stem cells (VSELs) by ImageStream system analysis. J Cell Mol Med 28; 12: 292 33. [68] ZUBA-SURMA EK, WU W, RATAJCZAK J et al. Very small embryonic-like stem cells in adult tissues potential implications for aging. Mech Ageing Dev 29; 13: 58 66. Jerzy Kawiak, Zak³ad Cytologii Klinicznej, Centrum Medyczne Kszta³cenia Podyplomowego, ul. Marymoncka 99, 1-813 Warszawa e-mail: jkawiak@cmkp.edu.pl